Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Metoda ta pozwala na izolację małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z raka wątroby pochodzących z tkanek o czystości wyższej niż osiągana przez klasyczne, różnicowe ultrawirowanie. Technologia ta jest prosta, wygodna i łatwa w obsłudze, co może zapewnić wsparcie metodologiczne w badaniu małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Aby rozpocząć, wyjmij próbkę tkanki z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Umieść około 400 miligramów tkanki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych na pojemniku z lodem i drobno zmielić tkankę skalpelem. Przenieś tkankę na sześciodołkową płytkę z 1,5 mililitra roztworu trawiennego. Następnie umieść płytkę na wytrząsarce odbarwiającej przeniesienie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby całkowicie zdysocjować tkankę raka wątroby i uwolnić małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub sEV.

Po inkubacji umieść sześciodołkową płytkę na pojemniku na lód. Dodaj 80 mikrolitrów inhibitora fosfatazy i 200 mikrolitrów kompletnego roztworu inhibitora proteazy, aby zatrzymać trawienie. Następnie przenieś roztwór trawienny do sitka komórkowego o średnicy 70 mikrometrów umieszczonego na dwumililitrowej probówce wirówkowej i powoli filtruj, aby usunąć wszelkie duże resztki tkanki.

Odwirować filtrat o masie 500 g przez 10 minut, aby usunąć drobne resztki tkanki, a następnie zebrać supernatant w nowej dwumililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować supernatant o stężeniu 3 000 g przez 20 minut w celu usunięcia resztek komórek. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej, aż końcówka pipety dotknie białych zanieczyszczeń na dnie.

Po powtórzeniu wirowania pozostałej cieczy, zebrać supernatant w probówce, nie naruszając zanieczyszczeń. Odwirować zebrany supernatant o masie 12 000 g przez 20 minut i przenieść 900 mikrolitrów supernatantu do 4,7-milimetrowej probówki ultrawirówkowej. Powtórzyć wirowanie pozostałej cieczy, a następnie zebrać i wymieszać oba supernatanty w tej samej probówce ultrawirówkowej.

Całkowicie napełnij probówkę PBS. Odwirować supernatant w stężeniu 100 000 g przez 60 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad, wypełniając probówkę ultrawirówki PBS.

Po powtórzeniu wirowania przy 100 000 g przez 60 minut, ponownie zawieś osad z 50 mikrolitrami PBS. Odessać zawiesinę sEV za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra i przefiltrować ją przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra do probówki wirówkowej o pojemności 600 mikrolitrów. Przechowywać filtrat w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.

Użyj cytometru przepływowego nanocząstek, aby określić rozkład wielkości i czystość sEV. Sprawdź objętość roztworu czyszczącego. Następnie zwróć uwagę na różnicę między poziomami osłony a cieczą odpadową.

Po 20 sekundach od włączenia głównego zasilania przyrządu włącz komputer. Poczekaj na sygnały dźwiękowe wskazujące, że instrument jest prawidłowo podłączony, aby uruchomić oprogramowanie. Kliknij przycisk Uruchom, aby włączyć kamerę, laser i pompę powietrza.

Następnie kliknij Sheath Flow i wybierz Start Up.Umieść ultraczystą wodę na platformie załadowczej. Po czterech minutach kliknij Sample and Boosting, a następnie wybierz Unload in Sample. Po 30 sekundach umieść pustą rurkę na platformie ładunkowej.

Kliknij pozycję Próbka, wybierz pozycję Boosting, a następnie wybierz pozycję Unload in Sample. Następnie umieść rurkę zawierającą ultraczystą wodę na platformie załadowczej. W tym samym czasie kliknij na Sample i Boosting, a następnie na Sheath Flow i Purge.

Kliknij opcję Manual Operation (Obsługa ręczna) i umieść rurkę do koncentracji cząstek na platformie załadowczej. Następnie kliknij Próbka, wybierz Boosting na jedną minutę i jednocześnie wybierz 250 nanometrowe standardowe fluorescencyjne nanosfery krzemionkowe w Sample Information. Wybierz opcję Sampling from Sample (Próbkowanie z próbki) i włącz detektor, klikając SPCM.

Następnie kliknij na Auto Sampling (Automatyczne pobieranie próbek) i wprowadź 1.0 w Sampling Set, aby ustawić ciśnienie na poziomie jednego kilopaskala. Kliknij pasek narzędzi i wybierz opcję Duży sygnał. Dostosuj poziome położenie lasera i ustaw laser na dwa mikrometry.

Następnie ciągle klikaj L i R, aby upewnić się, że sygnał jest silny i jednolity. Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskakują do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Nfa i kliknij Próbka, aby wybrać opcję Rozładuj.

Umieść rurkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej. Kliknij na Sample, wybierz Boosting, a po jednej minucie kliknij na Sample and Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.

Umieść probówkę o standardowym rozmiarze cząstek na platformie załadowczej i kliknij Sample Boosting (Zwiększanie próbki) na jedną minutę. Wybierz od 68 do 155 S16M-Exo quality control w Sample Information (Informacje o próbce) i kliknij Sample, a następnie Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.

Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskakują do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Nfa i kliknij Próbka, aby wybrać opcję Rozładuj. Po usunięciu pozostałości za pomocą roztworu czyszczącego, umieść probówkę PBS na platformie załadowczej i wykonaj czynności pokazane dla probówki o standardowej wielkości cząstek.

Następnie wyczyść końcówkę kapilarną, jak pokazano wcześniej, i załaduj próbkę sEV, aby przeanalizować dane opisane wcześniej dla rurki o standardowym rozmiarze cząstek. Oczyszczone sEV zbadano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym, który ujawnił obecność sEV o morfologii w kształcie miseczki. Przeprowadzono cytometrię przepływową dla sEV.

Wielkość cząstek wahała się od 40 do 200 nanometrów, a średnia wielkość cząstek wynosiła 89 nanometrów. Stwierdzono, że czystość wzbogaconych sEV wynosi 68,32%Markery białkowe sEV, takie jak CD63, CD9 i TSG101, wykryto za pomocą western blot. GM130 zastosowano jako ujemny marker kontrolny sEVs, który stwierdzono w komórkach tkankowych, ale nie w sEVs.

Bardzo ważne jest, aby wykonywać etapy trawienia enzymatycznego, ultrawirowania różnicowego i filtracji membranowej z najwyższą starannością, aby zapewnić czystość małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.