Name: Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Naucz się metody wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z tkanki raka wątroby. Technika różnicowej ultrawirówki zapewnia wyższą czystość izolowanych pęcherzyków niż klasyczne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pierwszemu Szpitalowi Stowarzyszonemu Uniwersytetu Medycznego Gannan za wsparcie tej pracy. Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numery grantów 82260422).

Ludzka tkanka raka wątroby została pobrana od pacjentów, u których zdiagnozowano nowotwór złośliwy wątroby w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Medycznego Gannan. Wszyscy pacjenci podpisali formularz świadomej zgody, a pobranie próbek tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego Gannan. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Umieścić wytrząsarkę odbarwiającą przeniesieniową w inkubatorze i ustawić temperaturę na 37 °C. Zobacz Rysunek 1 dla wszystkich innych potrzebnych urządzeń.</li>
	<li>Oczyść skalpel i kleszcze, spryskując je 75% alkoholem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór trawienny, odmierzając 6 mg kolagenazy D (4 mg/ml) i 24 μl DNazy Ι (80 U/ml) i dodając je do 1,5 ml pożywki zasadowej RPMI-1640. Mieszaj przez delikatne odwrócenie, aż dodatki całkowicie się rozpuszczą.</li>
	<li>Wcześniej zwilż sitka do komórek o wielkości 70 μm i 0,22 μm 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Umieść sterylne naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm na pojemniku na lód, aby pomieścić tkanki wątroby po rozmrożeniu.</li>
	<li>W ciągu 15 minut po wyizolowaniu tkanki raka wątrobowokomórkowego spłukać krew z powierzchni bloku tkankowego za pomocą PBS, przenieść tkankę do sterylnej zamrożonej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu eksperymentu nie dłużej niż 2 tygodnie.</li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Wyjąć próbkę tkanki z zamrażarki o temperaturze −80 °C i umieścić około 400 mg tkanki pokrojonej na fragmenty o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm umieszczonym w pojemniku na lód.</li>
	<li>Przenieść tkankę do 6-dołkowej płytki z 1,5 ml roztworu trawiennego; następnie umieścić płytkę na wytrząsarce odbarwiającej przeniesienie (20 obr./min) w celu inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu całkowitej dysocjacji tkanki raka wątroby i uwolnienia sEV.</li>
	<li>Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora i umieścić ją w zamrażalniku. Dodać 80 μl inhibitora fosfatazy i 200 μl kompletnego roztworu inhibitora proteazy, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Przenieś roztwór trawienny do sitka komórkowego o wielkości 70 μm i powoli je przefiltruj, aby usunąć wszelkie duże resztki tkanek. Zebrać filtrat i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
3. Ultrawirowanie różnicowe
UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy wirowania w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Odwirować filtrat o stężeniu 500 × g przez 10 minut i zebrać supernatant w nowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Większość drobnych resztek tkanek można następnie usunąć.</li>
	<li>Odwirować supernatant o stężeniu 3 000 × g przez 20 minut w celu usunięcia resztek komórek. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej, aż końcówka pipety dotknie białej substancji na powierzchni.</li>
	<li>Odwirować pozostałą ciecz o stężeniu 3 000 × g przez 3 minuty, a następnie odessać supernatant w celu ułatwienia zebrania pęcherzyków. Aby zapewnić czystość sEVs, upewnij się, że biała substancja nie jest zasysana.</li>
	<li>Odwirować zebrany supernatant o masie 12 000 × g przez 20 minut i przenieść 900 μl supernatantu do probówki ultrawirówkowej o pojemności 4,7 ml. Pozostałą ciecz odwirować o sile 12 000 × g przez 3 minuty, a następnie zebrać i wymieszać oba supernatanty w tej samej probówce do ultrawirówki. Całkowicie napełnij probówkę PBS.</li>
	<li>Odwirować supernatanty w stężeniu 100 000 × g przez 60 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, napełniając probówkę ultrawirówki PBS i ponownie odwirowując przy 100 000 × g przez 60 minut. Ponownie zawiesić osad z 50 μl PBS.</li>
	<li>Odessać zawiesinę sEV za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 600 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Ocena jakości wzbogacenia
<ol>
	<li>Obserwuj morfologię sEV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
	<ol>
		<li>Następnie upuść 10 μl próbki sEV na miedzianą siatkę, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wyczyść sterylną wodą destylowaną, używając papieru chłonnego w celu usunięcia nadmiaru płynu.</li>
		<li>Upuść 10 μl 2% octanu uranylu na siatkę miedzianą w celu barwienia ujemnego przez 1 minutę. Użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć ciecz na powierzchni siatki miedzianej i suszyć ją przez 2 minuty pod żarówką.</li>
		<li>Obserwuj miedzianą siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym i obraz przy napięciu 80 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj cytometru przepływowego nanocząstek, aby określić rozkład wielkości i czystość sEV.
	<ol>
		<li>Przed uruchomieniem maszyny należy przygotować probówki zawierające 200 μl kontroli jakości, 200 μl nanosfer krzemionkowych, 2 x 200 μl wody ultraczystej, 2 x 200 μl roztworu czyszczącego i 200 μl PBS. 
		UWAGA: Przed badaniem próbek sEV konieczne jest przeprowadzenie kontroli jakości przyrządu i przetestowanie wzorca wielkości cząstek (rozkład wielkości należy obliczyć przy użyciu standardowych krzywych wygenerowanych dla kilku nanomikrosfer o różnych średnicach [68-155 nm] w tych samych warunkach wykrywania). Kulki QC i nanosfery krzemionkowe rozcieńczono 100-krotnie ultraczystą wodą w łącznej objętości 200 μL.</li>
		<li>Sprawdź objętość roztworu czyszczącego (>10 ml) i zwróć uwagę na różnicę między poziomem płynu osłonowego a płynu odpadowego (20-30 cm).</li>
		<li>Wyłącz główne zasilanie instrumentu; po 20 sekundach włącz komputer i poczekaj na sygnały dźwiękowe wskazujące, że instrument jest prawidłowo podłączony, aby uruchomić oprogramowanie.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby włączyć kamerę, laser i pompę powietrza.</li>
		<li>Kliknij Sheath Flow-Start Up i umieść ultraczystą wodę na platformie załadowczej. Po 4 minutach (odliczanie instrumentu) kliknij na Sample-Boosting | Rozładunek próbki.</li>
		<li>Po 30 sekundach umieść pustą probówkę na platformie załadowczej i kliknij Sample-Boosting | Rozładunek próbki. Następnie umieść rurkę z ultraczystą wodą na platformie załadowczej i jednocześnie kliknij Sample-Boosting | Oczyszczanie przepływu pochwy.</li>
		<li>Kliknij opcję Manual Operation (Obsługa ręczna) i umieść rurkę z koncentracją cząstek na platformie załadowczej. Następnie kliknij na Sample-Boosting na 1 minutę i jednocześnie wybierz kontrolę jakości 250 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf."</li>
		<li>Kliknij Sample-Sampling i włącz detektor, klikając SPCM. 
		UWAGA: W tym momencie można zobaczyć przebieg sygnału w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Kliknij Auto Sampling i wprowadź 1.0 do Sampling SET, aby ustawić ciśnienie na 1 KPa. Kliknij na pasku narzędzi i wybierz Duży sygnał.</li>
		<li>Dostosuj poziome położenie lasera i ustaw laser na 2 μm, a następnie kliknij L lub R, aby upewnić się, że sygnał jest silny i jednolity.</li>
		<li>Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.</li>
		<li>Umieść rurkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting, a po 1 minutach kliknij Sample-Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.</li>
		<li>Umieść rurkę o rozmiarze cząstek na platformie załadowczej i kliknij przycisk Sample-Boosting na 1 minutę.</li>
		<li>Wybierz kontrolę jakości 68-155 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf" i kliknij Sample-Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.</li>
		<li>Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.</li>
		<li>Umieść probówkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting, a po 1 minucie kliknij Sample-Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.</li>
		<li>Umieść probówkę PBS na platformie załadowczej; kliknij na Sample-Boosting (Zwiększanie próbki) na 1 minutę.</li>
		<li>Wybierz kontrolę jakości 68-155 nm Std FL SiNPs w "SAMP. Inf" i kliknij Sample-Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.</li>
		<li>Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskoczą do bufora. Zapisz dane w pliku Naf i kliknij Sample-Unload.</li>
		<li>Umieść probówkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej, kliknij Sample-Boosting i Sample-Unload po 1 minutach. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.</li>
		<li>Sprawdź informacje o próbce zgodnie z opisem w krokach 4.2.17-4.2.20; zmień PBS (krok 4.2.17) na próbkę sEV i przeanalizuj dane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dalej identyfikuj sEV za pomocą western blot.
	<ol>
		<li>Określ stężenia białek w sEV i tkankach za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oblicz objętość ładunku sEV (np. dla 5 μg białka na studzienkę) na podstawie tych wyników ilościowych. Dodaj bufor ładujący w stosunku 1:4 i zwiruj mieszaninę.</li>
		<li>Po denaturacji w kąpieli metalowej o temperaturze 100 °C (suchy termostat) przez 10 minut, oddzielić białko na 12% żelu poliakrylamidowym pod napięciem 60 V przez 80 minut.</li>
		<li>Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu o natężeniu 0,22 μm w temperaturze 220 mA przez 2 godziny za pomocą buforu transferowego (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu).</li>
		<li>Zablokować błonę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD9, monoklonalne przeciwciało monoklonalne królika przeciwko ludzkiemu CD63, monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu TSG101, mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie GM130) przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% mleku beztłuszczowym w stosunku 1:1 000.</li>
		<li>Po trzech przemyciach TBST inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wykryj przeciwciało sprzężone z HRP za pomocą substratu do bibuły ECL, a następnie zbierz i przeanalizuj obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje powtarzalną metodę ekstrakcji sEV z tkanki raka wątroby. Wysokiej jakości sEV uzyskuje się poprzez izolację ostrych tkanek, traktowanie enzymami trawiennymi, ultrawirowanie różnicowe oraz filtrację i oczyszczanie membraną filtracyjną 0,22 μm. W przypadku dalszej analizy niezwykle ważne jest zapewnienie wysokiej czystości sEV. W procesie wirowania różnicowego na powierzchni supernatantu pojawi się warstwa białych substancji (nieznany skład). Ponieważ warstwa ta mogłaby zanieczyścić sEVs, usunęliśmy ją...

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) mają średnicę około 30 nm do 150 nm i są wydzielane przez różne komórki1. Mogą komunikować się z komórkami tkankowymi i regulować lokalne lub odległe mikrośrodowisko, transportując ważne cząsteczki biologiczne, takie jak lipidy, białka, DNA i RNA do różnych narządów, tkanek, komórek i części wewnątrzkomórkowych. W ten sposób mogą również zmienić zachowanie komórek odbiorcy2,3. Izolacja i oczyszczenie określonych sEV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do badania ich zachowania biologicznego podczas rozwoju i przebiegu choroby. Ultrawirowanie różnicowe - uważane za złoty standard - jest powszechnie stosowane do oddzielania sEV od tkanek, w których normalnie się znajdują4. Za pomocą tej techniki można usunąć szczątki tkanek, szczątki komórek, duże pęcherzyki i ciała apoptotyczne, pozostawiając tylko sEV.
Wykazano, że klasa <p="jove_content">Wykazano, że kolagenaza D i DNaza I nie wpływają na cechy molekularne komórek lub pęcherzyków, a właściwości obu enzymów przyczyniają się do uwalniania pęcherzyków w macierzy zewnątrzkomórkowej <klasa sup="xref">5. Enzymy te zostały użyte do ekstrakcji sEV z ludzkiej tkanki czerniaka z przerzutami, tkanki raka jelita grubego i tkanki błony śluzowej okrężnicy5,6,7. Jednak stężenie i czas trawienia kolagenazy D i DNazy I w tych metodach różnią się, co prowadzi do niespójnych wniosków. Aby uniknąć współwytrącania innych podtypów sEV, naukowcy usunęli większe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (o średnicy 0,1 μm lub 0,2 μm) poprzez filtrację i/lub wirowanie różnicowe8. W zależności od tkanki źródłowej mogą być wymagane różne metody izolacji i oczyszczania9,10.
Użycie tradycyjnej metody ultrawirowania różnicowego do ekstrakcji sEVs z tkanki wątroby powoduje powstanie warstwy istoty białej na powierzchni supernatantu, bez żadnego sposobu określenia jej właściwości. W poprzednim badaniu11 stwierdzono, że ta warstwa istoty białej wpływa na czystość sEVs. Chociaż liczba cząstek i stężenie białka w próbkach wyizolowanych metodą tradycyjną były wyższe niż w przypadku obecnej metody, współczynnik zmienności był duży, prawdopodobnie dlatego, że wiele zanieczyszczeń może prowadzić do słabej powtarzalności wyników. Oznacza to, że przy użyciu detergentu (tj. wykrywając rozpuszczalność cząstek w 1% Triton X-100), stwierdziliśmy, że czystość sEV uzyskanych tą metodą była większa. Dlatego używamy tej metody do izolowania i oczyszczania sEV pochodzących z tkanki raka jelita grubego do badań proteomicznych.
Obecnie badania nad sEVs w raku wątroby koncentrują się głównie na surowicy, osoczu i supernatencie hodowli komórkowej12,13,14. Jednak sEV pochodzące z tkanki raka wątroby mogą dokładniej odzwierciedlać patologię fizjologiczną i otaczające mikrośrodowisko raka wątroby oraz skutecznie zapobiegać degradacji i zanieczyszczeniu innych EVs15,16. Dzięki zastosowaniu ultrawirowania różnicowego, metoda ta może wzbogacić plon i uzyskać wysokiej jakości sEV, stanowiąc ważną podstawę do dalszych badań nad rakiem wątroby. Metoda ta umożliwia oddzielenie tkanki raka wątroby przez ostre oddzielenie i dysocjację przez kolagenazę D i DNazę I. Następnie szczątki komórkowe, duże pęcherzyki i ciała apoptotyczne są dalej usuwane przez filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Na koniec sEV są izolowane i oczyszczane do późniejszych badań.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr membranowy</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Sterylna strzykawka</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4,7 ml Probówka wirówkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do pomiaru komórek</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Zlewka</td><td>Tianjin Kangyiheng Firma zajmująca się sprzedażą instrumentów eksperymentalnych</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; m Sitko do komórek</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Probówka wirówkowa</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do oznaczania ilościowego białka BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD63</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD9</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Suchy termostat</td><td>Hangzhou Allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti Human CD9 Przeciwciało</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Drugorzędowe przeciwciało przeciw myszy sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Drugorzędowe przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową koziołka (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy nanocząstek NanoFCM</td><td>INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory fosfatazy (PhosSTOP)</td> <td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td> <td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Membrana z polifluorku winylidenu</td><td>Koraliki Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 podstawowe podłoże</td><td>Przemysł biologiczny&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr><tr><td>Skalpel</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanosfery krzemionkowe</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Transfer odbarwiający wytrząsarka TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TSG101</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) pochodzące z tkanki mogą odzwierciedlać stan funkcjonalny komórek źródłowych i charakterystykę przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Skuteczne wzbogacenie tych sEV jest ważnym warunkiem wstępnym dla badań nad ich funkcją biologiczną i kluczem do rozwoju klinicznych technik wykrywania i technologii nośników terapeutycznych. Trudno jest wyizolować sEV z tkanki, ponieważ są one zwykle silnie zanieczyszczone. Badanie to dostarcza metody szybkiego wzbogacania wysokiej jakości sEV z tkanki raka wątroby. Metoda obejmuje czteroetapowy proces: inkubację enzymów trawiennych (kolagenazy D i DNazy Ι) z tkanką, filtrację przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, ultrawirowanie różnicowe i filtrację przez filtr membranowy 0,22 μm. Dzięki optymalizacji etapu ultrawirowania różnicowego i dodaniu etapu filtracji, czystość sEV uzyskanych tą metodą jest wyższa niż uzyskana przy użyciu klasycznego ultrawirowania różnicowego. Dostarcza ważnej metodologii i danych pomocniczych do badania sEV pochodzących z tkanek.

sEV pochodzące z tkanek raka wątroby u ludzi odgrywają kluczową rolę w diagnostyce, leczeniu i prognozowaniu przebiegu choroby u pacjentów z rakiem wątroby. W niniejszej metodzie wykorzystano powszechne instrumenty laboratoryjne do izolacji i oczyszczania sEV pochodzących z tkanek raka wątroby, co może stanowić wsparcie metodologiczne dla badań nad sEV. Rysunek 2 przedstawia ogólny proces wzbogacania sEV z tkanek raka wątroby. sEV znajdujące się w przestrzeniach międzykomórkowych tkanek są w...

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Metoda ta pozwala na izolację małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z raka wątroby pochodzących z tkanek o czystości wyższej niż osiągana przez klasyczne, różnicowe ultrawirowanie. Technologia ta jest prosta, wygodna i łatwa w obsłudze, co może zapewnić wsparcie metodologiczne w badaniu małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Aby rozpocząć, wyjmij próbkę tkanki z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza.Umieść około 400 miligramów tkanki w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych na pojemniku z lodem i drobno zmielić tkankę skalpelem. Przenieś tkankę na sześciodołkową płytkę z 1,5 mililitra roztworu trawiennego. Następnie umieść płytkę na wytrząsarce odbarwiającej przeniesienie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby całkowicie zdysocjować tkankę raka wątroby i uwolnić małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub sEV.Po inkubacji umieść sześciodołkową płytkę na pojemniku na lód. Dodaj 80 mikrolitrów inhibitora fosfatazy i 200 mikrolitrów kompletnego roztworu inhibitora proteazy, aby zatrzymać trawienie. Następnie przenieś roztwór trawienny do sitka komórkowego o średnicy 70 mikrometrów umieszczonego na dwumililitrowej probówce wirówkowej i powoli filtruj, aby usunąć wszelkie duże resztki tkanki.Odwirować filtrat o masie 500 g przez 10 minut, aby usunąć drobne resztki tkanki, a następnie zebrać supernatant w nowej dwumililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować supernatant o stężeniu 3 000 g przez 20 minut w celu usunięcia resztek komórek. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej, aż końcówka pipety dotknie białych zanieczyszczeń na dnie.Po powtórzeniu wirowania pozostałej cieczy, zebrać supernatant w probówce, nie naruszając zanieczyszczeń. Odwirować zebrany supernatant o masie 12 000 g przez 20 minut i przenieść 900 mikrolitrów supernatantu do 4,7-milimetrowej probówki ultrawirówkowej. Powtórzyć wirowanie pozostałej cieczy, a następnie zebrać i wymieszać oba supernatanty w tej samej probówce ultrawirówkowej.Całkowicie napełnij probówkę PBS. Odwirować supernatant w stężeniu 100 000 g przez 60 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad, wypełniając probówkę ultrawirówki PBS.Po powtórzeniu wirowania przy 100 000 g przez 60 minut, ponownie zawieś osad z 50 mikrolitrami PBS. Odessać zawiesinę sEV za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra i przefiltrować ją przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra do probówki wirówkowej o pojemności 600 mikrolitrów. Przechowywać filtrat w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.Użyj cytometru przepływowego nanocząstek, aby określić rozkład wielkości i czystość sEV. Sprawdź objętość roztworu czyszczącego. Następnie zwróć uwagę na różnicę między poziomami osłony a cieczą odpadową.Po 20 sekundach od włączenia głównego zasilania przyrządu włącz komputer. Poczekaj na sygnały dźwiękowe wskazujące, że instrument jest prawidłowo podłączony, aby uruchomić oprogramowanie. Kliknij przycisk Uruchom, aby włączyć kamerę, laser i pompę powietrza.Następnie kliknij Sheath Flow i wybierz Start Up.Umieść ultraczystą wodę na platformie załadowczej. Po czterech minutach kliknij Sample and Boosting, a następnie wybierz Unload in Sample. Po 30 sekundach umieść pustą rurkę na platformie ładunkowej.Kliknij pozycję Próbka, wybierz pozycję Boosting, a następnie wybierz pozycję Unload in Sample. Następnie umieść rurkę zawierającą ultraczystą wodę na platformie załadowczej. W tym samym czasie kliknij na Sample i Boosting, a następnie na Sheath Flow i Purge.Kliknij opcję Manual Operation (Obsługa ręczna) i umieść rurkę do koncentracji cząstek na platformie załadowczej. Następnie kliknij Próbka, wybierz Boosting na jedną minutę i jednocześnie wybierz 250 nanometrowe standardowe fluorescencyjne nanosfery krzemionkowe w Sample Information. Wybierz opcję Sampling from Sample (Próbkowanie z próbki) i włącz detektor, klikając SPCM.Następnie kliknij na Auto Sampling (Automatyczne pobieranie próbek) i wprowadź 1.0 w Sampling Set, aby ustawić ciśnienie na poziomie jednego kilopaskala. Kliknij pasek narzędzi i wybierz opcję Duży sygnał. Dostosuj poziome położenie lasera i ustaw laser na dwa mikrometry.Następnie ciągle klikaj L i R, aby upewnić się, że sygnał jest silny i jednolity. Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskakują do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Nfa i kliknij Próbka, aby wybrać opcję Rozładuj.Umieść rurkę z roztworem czyszczącym na platformie załadowczej. Kliknij na Sample, wybierz Boosting, a po jednej minucie kliknij na Sample and Unload. Użyj ultraczystej wody, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z końcówki kapilarnej.Umieść probówkę o standardowym rozmiarze cząstek na platformie załadowczej i kliknij Sample Boosting (Zwiększanie próbki) na jedną minutę. Wybierz od 68 do 155 S16M-Exo quality control w Sample Information (Informacje o próbce) i kliknij Sample, a następnie Sampling. Następnie kliknij pasek narzędzi i wybierz Mały sygnał.Kliknij Czas do nagrywania, aby zebrać dane, które po zakończeniu automatycznie przeskakują do bufora. Następnie zapisz dane w pliku Nfa i kliknij Próbka, aby wybrać opcję Rozładuj. Po usunięciu pozostałości za pomocą roztworu czyszczącego, umieść probówkę PBS na platformie załadowczej i wykonaj czynności pokazane dla probówki o standardowej wielkości cząstek.Następnie wyczyść końcówkę kapilarną, jak pokazano wcześniej, i załaduj próbkę sEV, aby przeanalizować dane opisane wcześniej dla rurki o standardowym rozmiarze cząstek. Oczyszczone sEV zbadano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym, który ujawnił obecność sEV o morfologii w kształcie miseczki. Przeprowadzono cytometrię przepływową dla sEV.Wielkość cząstek wahała się od 40 do 200 nanometrów, a średnia wielkość cząstek wynosiła 89 nanometrów. Stwierdzono, że czystość wzbogaconych sEV wynosi 68,32%Markery białkowe sEV, takie jak CD63, CD9 i TSG101, wykryto za pomocą western blot. GM130 zastosowano jako ujemny marker kontrolny sEVs, który stwierdzono w komórkach tkankowych, ale nie w sEVs.Bardzo ważne jest, aby wykonywać etapy trawienia enzymatycznego, ultrawirowania różnicowego i filtracji membranowej z najwyższą starannością, aby zapewnić czystość małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Naucz się metody wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z tkanki raka wątroby. Technika różnicowej ultrawirówki zapewnia wyższą czystość izolowanych pęcherzyków niż klasyczne metody.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Przeglądaj więcej filmów