Name: Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w trójwymiarowe organoidy siatkówki nerwowej. Technika łączy hodowlę adherentną i zawiesinową, umożliwiając selektywny wybór i wzbogacanie organoidów siatkówki oraz komórek RPE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za naukowe i techniczne wsparcie ze strony dr Chitry Kannabiran, genetyka; dr Subhadra Jalali, konsultanta ds. siatkówki; dr Milind Naik, chirurga okuloplastycznego; oraz dr Swathi Kaliki, onkologa okulistycznego w Instytucie Okulistycznym LV Prasad w Hajdarabadzie, w kierunku generowania normalnych i specyficznych dla pacjenta linii iPSC. Autorzy dziękują o grantach badawczo-rozwojowych z Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Departamentu Nauki i Technologii (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Departamentu Biotechnologii (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) oraz stypendiów badawczych dla seniorów z ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) i CSIR (V.K.P.), rządu Indii.

<ol><li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+visual+impairment+in+India%3A+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li>
<li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li>
<li>RetNet - Retinal Information Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022).</li>
<li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa%3A+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361(2019).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li>
<li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882(2018).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047(2014).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie pozostają w konflikcie interesów ani nie ujawniają informacji finansowych.

Komórki hiPS są potężnym narzędziem do badania rozwoju narządów i tkanek in vitro. Rekapitulacja fenotypu choroby poprzez różnicowanie zdrowych i specyficznych dla choroby hiPSC w kierunku linii siatkówki może pomóc w uzyskaniu nowszego wglądu w patofizjologię różnych form dziedzicznych dystrofii siatkówki. Opisano i przyjęto kilka protokołów różnicowania in vitro PSC w typy komórek siatkówki. Większość z nich polega na użyciu pożywki hodowlanej zawierającej złożone koktajle rekombinowanych czynników wz...

Siatkówka to wrażliwa na światło tkanka znajdująca się w tylnej części oka kręgowców, która przekształca sygnały świetlne w impulsy nerwowe za pomocą zjawiska biochemicznego znanego jako szlak fototransdukcji. Początkowe impulsy nerwowe generowane w komórkach fotoreceptorów siatkówki są przekazywane do innych interneuronów siatkówki i komórek zwojowych siatkówki (RGC) i docierają do kory wzrokowej mózgu, co pomaga w percepcji obrazu i reakcji wzrokowej.
Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), około 1,5 miliona dzieci jest niewidomych, z czego 1 milion mieszka w Azji. Dziedziczna dystrofia siatkówki (IRD) jest poważną chorobą powodującą ślepotę, która dotyka 1 na 4 000 osób na całym świecie1,2,3, podczas gdy częstość występowania ślepoty związanej ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) waha się od 0,6%-1,1% w krajach rozwijających się4. IRD są spowodowane dziedzicznymi wadami genetycznymi w ponad 300 różnych genach zaangażowanych w rozwój i funkcję siatkówki5. Takie zmiany genetyczne skutkują zaburzeniem prawidłowych funkcji siatkówki i stopniową degeneracją komórek siatkówki, a mianowicie komórek fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), prowadząc w ten sposób do poważnej utraty wzroku i ślepoty. Ogromny postęp poczyniono w innych stanach oślepiających obejmujących rogówkę, soczewkę itp. Jednak dystrofie siatkówki i zaniki nerwu wzrokowego nie mają do tej pory żadnej sprawdzonej terapii. Ponieważ siatkówka dorosłego człowieka nie posiada komórek macierzystych6, alternatywne źródła, takie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta (iPSC) mogą zapewnić nieograniczoną podaż pożądanych typów komórek i są bardzo obiecujące dla rozwoju złożonych organoidów tkankowych wymaganych do badań modelowania chorób in vitro oraz do opracowywania terapii regeneracyjnych7, 8,9,10.
Kilka lat badań nad siatkówką doprowadziło do lepszego zrozumienia zdarzeń molekularnych, które kierują wczesnym rozwojem siatkówki. Większość protokołów generowania komórek siatkówki i organoidów 3D z PSC ma na celu podsumowanie tych zdarzeń rozwojowych in vitro, poprzez hodowlę komórek w złożonym koktajlu czynników wzrostu i małych cząsteczek w celu stopniowego modulowania znanych procesów biologicznych. Wygenerowane w ten sposób organoidy siatkówki składają się z głównych komórek siatkówki: komórek zwojowych siatkówki (RGC), interneuronów, fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Pomimo udanych prób modelowania IRD za pomocą organoidów siatkówki, wymóg złożonego koktajlu czynników wzrostu i małych cząsteczek podczas różnicowania oraz stosunkowo niska wydajność generowania organoidów siatkówki stanowi poważne wyzwanie w przypadku większości protokołów. Obejmują one głównie tworzenie ciał embrionalnych, a następnie ich stopniowe różnicowanie w linie siatkówki przy użyciu złożonych warunków hodowli na różnych etapach rozwoju in vitro20,21,22.
Tutaj przedstawiono uproszczoną i solidną metodę tworzenia złożonych 3D organoidów neuro-siatkówkowych ze zdrowej kontroli i specyficznych dla choroby siatkówki hiPSC. Opisany tutaj protokół wykorzystuje bezpośrednie różnicowanie prawie zlewających się kultur hiPSC bez konieczności tworzenia ciała zarodkowego. Ponadto złożoność pożywki hodowlanej jest uproszczona, dzięki czemu jest to opłacalna i powtarzalna technika, która może być łatwo zaadoptowana przez nowych badaczy. Obejmuje hybrydowy system hodowli składający się z przylegających kultur jednowarstwowych w ciągu pierwszych 4 tygodni różnicowania siatkówki, aż do pojawienia się odrębnych, samoorganizujących się pierwotnych klastrów pola ocznego (EFP). Co więcej, okrągłe wyspy nerwowo-siatkówkowe w każdym EFP są ręcznie wybierane i hodowane w kulturach zawiesinowych przez 1-2 tygodnie w celu przygotowania wielowarstwowych miseczek 3D siatkówki lub organoidów składających się z proliferujących PAX6 + i CHX10 + prekursorów neurosiatkówkowych. Rozszerzona hodowla organoidów siatkówki w pożywce zawierającej 100 μM taurynę przez kolejne 4 tygodnie spowodowała pojawienie się prekursorów fotoreceptorów RCVRN+ i CRX+ oraz dojrzałych komórek z podstawowymi wewnętrznymi rozszerzeniami przypominającymi segmenty.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtry strzykawkowe</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Chx10; Mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td><td>rozcieńczeniem 1:50</td></tr><tr><td>Anty-CRX; Monoklonalne przeciwciało przeciw MiTF królika</td><td>Abcam</td><td>ab140603</td><td>rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>, mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Recoverin; Królik poliklonalny&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td>Wirówka <td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar (50 mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX (podłoże podstawowe)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA DreamTaq</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 średni zestaw</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa dwuwodzianu kwasu etylenodiaminowego tetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Szalka Petriego nie poddana obróbce TC, 60 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Płodu&nbsp; Bydło&nbsp; Serum, kwalifikowane, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ z oprogramowaniem laboratorium obrazowego</td> System <td>dokumentacji żelu agarozowego</td> <td>BIO-RAD</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kozioł anty-Królik IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kozia anty-IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>Do cięcia</td></tr><tr><td>KnockOut Zamiennik serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-Aksorbowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplement (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Do ilościowego oznaczania RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pipipety Pasteura, 9 cali, niesterylne, bez załącznika</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-Otx2, monoklonalne królicze</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-PAX6; Królik Monoklonalny</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-RPE65, Królik monoklonalny</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko Noggin R</td><td>& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy</td><td>dwuwodny Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Starfrost ( pokryte silanem) szkiełka mikroskopowe</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III System syntezy pierwszej nici</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III System syntezy pierwszej nici do RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI&nbsp;</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek witronektyny</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor kinazy Rho)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td> <td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 880</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą generować złożone organoidy tkankowe, które są przydatne do badań nad modelowaniem chorób in vitro i do opracowywania terapii regeneracyjnych. Protokół ten opisuje prostszą, solidniejszą i krokową metodę generowania organoidów siatkówki w hybrydowym systemie hodowli składającym się z przylegających kultur jednowarstwowych w ciągu pierwszych 4 tygodni różnicowania siatkówki do momentu pojawienia się odrębnych, samoorganizujących się pierwotnych klastrów pola ocznego (EFP). Ponadto okrągłe i półprzezroczyste wyspy nerwowo-siatkówkowe w kształcie pączka w każdym EFP są ręcznie wybierane i hodowane pod zawiesiną przy użyciu nieprzylegających szalek hodowlanych w pożywce różnicującej siatkówkę przez 1-2 tygodnie w celu wytworzenia wielowarstwowych miseczek nerwu wzrokowego 3D (OC-1M). Te niedojrzałe organoidy siatkówki zawierają proliferujące PAX6 + i ChX10 +, multipotencjalne prekursory siatkówki. Komórki prekursorowe są liniowo samoorganizujące się w organoidach i pojawiają się jako wyraźne promieniste prążki. Po 4 tygodniach od posiewu zawiesinowego komórki progenitorowe siatkówki ulegają postmitotycznemu zatrzymaniu i różnicowaniu linii, tworząc dojrzałe organoidy siatkówki (OC-2M). Prekursory zaangażowane w linię fotoreceptorów rozwijają się w najbardziej zewnętrznych warstwach organoidów siatkówki. Te komórki fotoreceptorów CRX+ i RCVRN+ dojrzewają morfologicznie, aby wyświetlać wewnętrzne rozszerzenia podobne do segmentów. Metoda ta może być stosowana do generowania organoidów siatkówki przy użyciu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wszystkie kroki i procedury są jasno wyjaśnione i zademonstrowane, aby zapewnić powtarzalność i szersze zastosowania w naukach podstawowych i badaniach translacyjnych.

Różnicowanie hiPSC w kierunku linii komórkowych oka osiąga się poprzez hodowlę komórek w różnych mieszaninach pożywek zawierających suplementy i czynniki wzrostu w kolejnych etapach w określonych punktach czasowych, jak opisano na Rysunku 1. Hodowle hiPSC utrzymuje się w pożywce Essential 8, która jest pożywką do utrzymania pluripotencji komórek macierzystych. Po osiągnięciu 70%-80% konfluencji (Rysunek 2A), pożywkę wymienia się w dniu 0 (patrz krok 3.2) na poży...

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Protokół ten opisuje prostą i wydajną metodę różnicowania ludzkich IPC w złożone trójwymiarowe organoidy neurosiatkówki do zastosowań badawczych i regeneracyjnych. Technika ta obejmuje zarówno hodowle adherentne, jak i zawiesinowe, co pozwala na selektywne wybieranie i wzbogacanie zarówno organoidów siatkówki, jak i komórek RP. Może zapewnić realne i regularne dostarczanie źródeł komórkowych do opracowywania terapii komórkowych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.Takie organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych i komórki RPE są przydatne jako modele in vitro do badania rozwoju oczu i dziedzicznych chorób siatkówki. Metoda ta może być łatwo odtworzona przez laboratoria badawcze, które są już zaznajomione z obsługą ludzkich kultur IPSC. Demonstracja wizualna znacznie pomaga w identyfikacji pól ocznych i izolacji bańek nerwowo-siatkówkowych na podstawie ich położenia przestrzennego i cech morfologicznych.Na początek odessać zużytą pożywkę od 70 do 80% zlewających się ludzkich kultur IPSC na płytkach sześciodołkowych. Dodaj PBS do studzienek, zakręć je i odessaj bufor do płukania. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu dysocjacji komórek lub CDS do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu minut, aż komórki się zaokrąglą.Odessać CDS i zebrać zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Obracaj rurkę z prędkością 1 000 obr./min przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 1,2 mililitra pożywki Essential 8.Dozować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej matrycą, zawierającej 1,5 mililitra pożywki hodowlanej IPSC i 10 mikromolowych Y27632. Po 12 do 24 godzinach usuń zużytą pożywkę i dodaj wstępnie podgrzaną pożywkę do pełnego wznoszenia bez Y27632, aby utrzymać kultury. Zmieniaj pożywkę co 24 godziny, aż kultury osiągną 70 do 80% zbieżności.W dniu zerowym odessać ludzką pożywkę konserwacyjną IPSC i dodać pożywkę indukcyjną do różnicowania zawierającą jeden nanogram na mililitr BFGF i jeden nanogram na mililitr Noggina do płytki sześciodołkowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Pierwszego dnia odessać zużytą pożywkę i dodać pożywkę indukcyjną różnicującą zawierającą jeden nanogram na mililitr BFGF i 10 nanogramów na mililitr Noggin.Ponownie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. W drugim i trzecim dniu usuń zużytą pożywkę i dodaj pożywkę indukcyjną różnicowania zawierającą 10 nanogramów na mililitr Noggin. Po dodaniu dwóch mililitrów na pożywkę dołkową do płytki sześciodołkowej, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i zmieniać pożywkę co 24 godziny.W czwartym dniu usuń zużytą pożywkę i dodaj pożywkę różnicującą siatkówkę lub RDM. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby dodać dwa mililitry na pożywkę studzienkową do płytki sześciodołkowej i inkubować kultury. Zmieniaj podłoże codziennie.Około 14 i 18 dnia obserwuj kultury pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu pod kątem pojawienia się neuronalnych domen przypominających rozety składających się z wczesnych przodków pola oka. Około 21 i 28 dnia obserwuj kultury pod mikroskopem przy powiększeniu 4X i 10X, aby zaobserwować pojawienie się samoorganizujących się odrębnych EFP z centralną wyspą kolistych struktur neurosiatkówki 3D otoczonych ciągłymi wyrostkami nabłonka nerwowego i nabłonka powierzchni oka. Weź sterylną pipetę Pasteura i przytrzymaj podstawę w jednej ręce, a końcówkę kapilary w drugiej.Wysterylizuj płomieniem i podgrzej obszar w pobliżu środka końcówki kapilarnej ruchami obrotowymi, aż szkło stanie się giętkie. Następnie odsuń się od płomienia i szybko pociągnij końcówkę kapilary na zewnątrz, aby utworzyć cienką końcówkę kapilarną z zamkniętym światłem. Trzymaj cienką końcówkę poziomo przed płomieniem i szybko przepuść ją przez płomień ruchem na zewnątrz, aby utworzyć gładki haczyk lub końcówkę kapilarną w kształcie litery L.Pod mikroskopem stereoskopowym ręcznie wybierz dobrze uformowane miseczki nerwowo-siatkówkowe z poszczególnych EFP, używając gładkiej zewnętrznej strefy krzywizny haka kapilarnego jako drobnej miarki. W dniach 25 i 30 dodaj cztery mililitry wstępnie podgrzanej pożywki do różnicowania siatkówki w 60-milimetrowym naczyniu o niskim naczyniu do hodowli i utrzymuj miseczki siatkówki w celu wytworzenia organoidów siatkówki 3D. Należy to zrobić przed pobraniem bańek nerwowo-siatkówkowych.Ustaw mikropipetę o długości jednego milimetra do zasysania 100 mikrolitrów i użyj mikrokońcówek o pojemności jednego mililitra z szerokimi otworami, aby zassać i przenieść pływające kubki siatkówki do przygotowanych wcześniej świeżych naczyń o niskiej przyczepności. Utrzymuj miseczki siatkówki w RDM jako nieprzylegające kultury zawiesinowe i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. W dniach 30 i 45, stosując metodę częściowego karmienia, należy usunąć połowę objętości zużytej pożywki i zastąpić ją równą objętością świeżej pożywki.W 45 i 60 dniu hoduj organoidy siatkówki przez kolejne dwa tygodnie w RDM zawierającym 100 mikromolową taurynę, aby wspierać lepsze przeżycie i różnicowanie linii progenitorów neurosiatkówki oraz rozwój dojrzałych typów komórek siatkówki. Organoidy siatkówki są charakteryzowane na różnych etapach dojrzewania w celu ekspresji kilku markerów progenitorowych siatkówki za pomocą RT-PCR i immunohistochemii. Wyniki RT-PCR potwierdziły indukcję i ekspresję markerów neurosiatkówkowych w jednomiesięcznych organoidach siatkówki i dwumiesięcznych organoidach siatkówki.Przedstawiono konfokalne obrazy znakowanych immunologicznie odcinków niedojrzałych organoidów siatkówki przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom progenitorowym neurosiatkówki Chx10, PAX6 i Otx2 oraz dojrzałych organoidów siatkówki wykorzystujących przeciwciała przeciwko markerom prekursorowym fotoreceptorów rekupyny i CRX. Zaznaczona najbardziej zewnętrzna warstwa organoidów siatkówki z różnicującymi się komórkami fotoreceptorowymi jest powiększona i pokazana na tych obrazach. Szczątkowe wewnętrzne przedłużenia przypominające segmenty są oznaczone białymi strzałkami.Skupiska EFP z miseczką neurosiatkówkową w środku i migrującymi wyrostkami RPE wykazują pigmentację wzdłuż krawędzi natarcia. Pokazano tutaj dobrze zróżnicowane pigmentowane wyrostki nabłonkowe z wielu EFP wokół wyspy nerwowo-siatkówkowej. Większe powiększenie EFP pokazuje strefę migracyjną przodków RPE i nabłonek powierzchni oka otaczający miseczkę nerwowo-siatkówkową.Pokazano tutaj rozszerzone hodowle adherentne, w których rozwinęły się monowarstwy niedojrzałych komórek RPE zawierających zarówno komórki pigmentowane, jak i niepigmentowane. Jednowarstwowe hodowle w pełni dojrzałych i pigmentowanych komórek RPE wykazują morfologię bruku w 60 dniu. Komórki RPE wykazujące ekspresję PAX6, MITF i RPE65 pokazano na tym rysunku.Obrazy te reprezentują EFP z nieprawidłowymi agregatami przodków siatkówki ze zniekształconą laminacją i brakiem prążków. EFP z miniaturową miseczką nerwowo-siatkówkową, ale pozbawioną otaczającej strefy RPE i nabłonka powierzchni oka pokazano na tym rysunku. Na reprezentatywnym obrazie widoczne są nieregularne agregaty nerwowo-siatkówkowe powstałe w hodowli zawiesiny.Bardzo ważne jest, aby rozpocząć proces różnicowania przy użyciu prawie zlewających się kultur wzrostu IPC, aby osiągnąć skuteczną indukcję pola oka w ciągu trzech do czterech tygodni. Organoidy siatkówki i komórki RPE wygenerowane z normalnych i specyficznych dla pacjenta IPC mogą być wykorzystywane jako modele chorób siatkówki oraz do testowania nowych leków terapeutycznych.

generation-retinal-organoids-from-healthy-retinal-disease-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół generowania dojrzałych ludzkich organoidów siatkówki i wykorzystywania ich w teście toksyczności fotoreceptorów do identyfikacji kandydatów farmaceutycznych na chorobę zwyrodnieniową siatkówki związaną z wiekiem teleangiektazję plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w trójwymiarowe organoidy siatkówki nerwowej. Technika łączy hodowlę adherentną i zawiesinową, umożliwiając selektywny wybór i wzbogacanie organoidów siatkówki oraz komórek RPE.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Przeglądaj więcej filmów