Name: Obrazowanie żywych komórek nienaruszonych kul ex vivo za pomocą nowatorskiego uchwytu wydrukowanego w 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek rogówki z użyciem uchwytu drukowanego 3D. Technika umożliwia monitorowanie sygnałowania wapniowego i migracji komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować NIH za następujące wsparcie w postaci grantów: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) i 5T32GM008541-24 (KS). Chcielibyśmy również podziękować Massachusetts Lions Eye Research Fund oraz New England Corneal Transplant Fund.

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Stowarzyszenie Badań nad Widzeniem i Okulistyką na temat Wykorzystania Zwierząt w Opiece Okulistycznej i Badaniach nad Wzrokiem oraz protokół IACUC Uniwersytetu Bostońskiego (201800302).
1. Projektowanie uchwytów i pokrywy wydrukowanych w 3D
<ol>
	<li>Zaprojektuj wydrukowane w 3D uchwyty i listwę pokrywy, biorąc pod uwagę średnią średnicę kul myszy, a następnie wydrukuj projekt w 3D (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A, B).</li>
	<li>Utrzymuj średnicę wewnętrznej ścianki uchwytu nieco większą niż średnia średnica kuli ziemskiej, aby uwzględnić różne rozmiary poszczególnych myszy. Utrzymuj wysokość uchwytu na poziomie około połowy średnicy kuli ziemskiej, zapewniając ścisłe dopasowanie kuli ziemskiej, gdy jest zabezpieczona wydrukowaną w 3D listwą pokrywy.</li>
	<li>Dopasuj listwę pokrywy uchwytu do długości zewnętrznej średnicy uchwytu o szerokości od 1/4 do 1/2 średnicy uchwytu. Osłona jest tak dobrana, aby umożliwić dostęp do kuli ziemskiej, gdy jest zamocowana w uchwycie w celu nawodnienia i usunięcia oka po zakończeniu eksperymentu.</li>
	<li>Wydrukuj uchwyt i listwę pokrywy.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Eutanazja myszy (do tego badania wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 9-12 tygodni i 27 tygodni) przy użyciu ustalonych protokołów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W przypadku tego protokołu należy przeprowadzić eutanazję za pomocą dwutlenku węgla, a następnie ścięcie głowy.</li>
	<li>Zdejmij głowę myszy i natychmiast umieść ją na lodzie, aby zachować żywotność tkanki. Wyłuszczenie kul za pomocą narzędzi preparacyjnych, zapobiegając uszkodzeniom tkanek.</li>
	<li>Obrysuj kulę ziemską za pomocą pęsety. Przytnij nerw wzrokowy za pomocą nożyczek preparacyjnych tuż poniżej miejsca, w którym jest trzymany przez pęsetę. 
	UWAGA: Aby uzyskać dalsze środki ostrożności, wykonaj następujące czynności w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Inkubować kule w 2 ml pożywki w naczyniu do hodowli komórkowych p35 wraz ze wskaźnikiem wapnia i/lub barwieniem błony komórkowej przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w warunkach słabego oświetlenia. Upewnij się, że kule są zanurzone w podłożu barwiącym, aby uzyskać równomierne barwienie.
	<ol>
		<li>Do przeprowadzanych tutaj eksperymentów należy użyć wskaźnika wapniowego Fluo4-AM (1:100)2 i barwienia przeciw błonie komórkowej, ciemnoczerwonego barwnika błony plazmatycznej (1:10 000)2, o końcowym stężeniu 1% (v/v) DMSO i 0,1% (w/v) kwasu pluronowego w 2 ml pożywki wolnej od keratynocytów (KSFM) z następującymi suplementami wzrostu: 25 μg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,02 nM naskórkowy czynnik wzrostu, 0,3 mM CaCl2 i penicylina-streptomycyna (odpowiednio 100 jednostek/ml i 100 μg/ml). 
		UWAGA: Warunki i czas inkubacji są różne w zależności od wskaźnika wapnia, rodzaju tkanki i objętości próbki. Podczas stosowania kwasu pluronowego zaleca się ostrożność, ponieważ sprawia on, że tkanki stają się przepuszczalne. Protokół ten wymaga 10% kwasu pluronowego. Stwierdzono eksperymentalnie, że niższe stężenia kwasu pluronowego są nieskuteczne, a wyższe stężenia grożą uszkodzeniem tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie uchwytów na próbki
<ol>
	<li>Przyklej uchwyty do czystego szkiełka nakrywkowego ze szklanym dnem za pomocą kleju, który nie był wcześniej używany. Klej użyty w tym protokole pochodzi z jednorazowych pojemników, aby zapewnić sterylność i za każdym razem używany jest nowy, nieotwarty pojemnik.</li>
	<li>Umyj uchwyt w 70% etanolu. Umieść klej na uchwycie i przyklej uchwyt do szklanego dna szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że klej nie znajduje się w wewnętrznej części uchwytu, ponieważ klej może fluoryzować, komplikując obrazowanie.</li>
	<li>Poczekaj, aż klej zastygnie. Upewnij się, że uchwyt jest zabezpieczony przed szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Płytki komórkowe P35 ze szkiełkami nakrywkowymi ze szklanym dnem zostały użyte do eksperymentów przedstawionych w tym manuskrypcie. Inne szkiełka i/lub płytki ze szklanym dnem mogą być zastępowane w zależności od potrzeb eksperymentu.</li>
</ol>
4. Ranienie gałek ocznych
<ol>
	<li>Usuń kule z roztworu barwiącego za pomocą sterylnych zakraplaczy do oczu, uważając, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek w obszarze zainteresowania. Myj kule przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w celu usunięcia nadmiaru plam i umieść kule w pożywce w celu transportu do mikroskopu.</li>
	<li>Nawiń kule za pomocą sterylnej igły 25 G w obszarze zainteresowania.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnego zakraplacza do oczu podnieś i przytrzymaj gałkę ziemską z tyłu oka. Dzięki temu kula ziemska będzie stabilna, zapobiegnie jej toczeniu się i umożliwi tworzenie spójnych ran. Korzystając z tej konfiguracji, nerw wzrokowy będzie znajdował się wewnątrz dyszy zakraplacza oka, a rogówka będzie skierowana na zewnątrz.</li>
		<li>W przypadku rany po zadrapaniu delikatnie przesunąć sterylną igłę 25 G po odsłoniętej rogówce. W przypadku rany kłutej delikatnie wciśnij igłę bezpośrednio w centralną rogówkę. Upewnij się, że rana nie przebija rogówki. 
		UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli reakcja na ranę lub zranione środowisko nie jest wymagane do eksperymentu. Wcześniejsze badania wykazały, że zarówno rany zadrapania, jak i rany kłute mysich rogówek wykonane tą metodą są spójne zarówno pod względem średnicy, jak i głębokości10. Potwierdzenie wymiarów rany pomiędzy niezależnymi kulami przeprowadzono za pomocą analizy obszaru zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Umieszczenie próbki na uchwycie
<ol>
	<li>Umieść rogówkę lub obszar rąbka na szkiełku nakrywkowym w wewnętrznej części uchwytu i ustabilizuj za pomocą wydrukowanej w 3D pokrywy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C-H).</li>
	<li>Upewnij się, że kula ziemska jest prawidłowo umieszczona i że miejsce zainteresowania styka się ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Po umieszczeniu kuli w uchwycie nie próbuj wyjmować kuli, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.</li>
	<li>Przyklej wydrukowaną w 3D osłonę do uchwytu za pomocą kleju, zapewniając stabilizację. Upewnij się, że listwa pokrywy przylega do uchwytu, a nie do kuli ziemskiej. 
	UWAGA: Obszar, który ma być obrazowany, jest umieszczany w dół, ponieważ protokół jest napisany do użytku na mikroskopie odwróconym. Protokół można dostosować do mikroskopów pionowych za pomocą uchwytów o mniejszym promieniu wewnętrznym i zdejmowania listwy pokrywy. Spowoduje to mniejszą stabilizację kuli ziemskiej.</li>
</ol>
6. Próbkowanie
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i komorę środowiskową i sprawdź, czy komora jest nawilżona. Ustawić komorę środowiskową na 35 °C i 5% CO2 na czas trwania eksperymentu. 
	UWAGA: Mikroskopy z komorami środowiskowymi są preferowane do tej procedury, aby zapobiec odwodnieniu i utrzymać kulę ziemską w optymalnej temperaturze, ale nie są wymagane.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe, uchwyt i ustabilizowaną kulę ziemską na stoliku mikroskopu w komorze środowiskowej i zobrazuj za pomocą technik obrazowania żywych komórek9.</li>
	<li>Odpipetować dodatkowe podłoże wzrostowe na szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec odwodnieniu i utrzymać żywotność tkanek. Upewnij się, że w studzience jest wystarczająca ilość podłoża, aby przykryć kulę ziemską w uchwycie. W zależności od czasu trwania obrazowania, w razie potrzeby przez cały czas trwania eksperymentu należy dodawać świeżą pożywkę.</li>
	<li>Rozpocznij eksperymenty z wykorzystaniem technik i protokołów obrazowania żywych komórek. Użyj ustawień lasera o niskiej mocy, aby zachować tkankę i zapobiec uszkodzeniom tkanek w długotrwałych eksperymentach. Używaj odpowiednich celów do pracy na duże odległości. Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone przy użyciu obiektywu 20x. 
	UWAGA: Moc i wzmocnienie lasera, czas trwania eksperymentu, lokalizacja i płaszczyzna obrazowania są zmiennymi zależnymi od parametrów eksperymentalnych. Eksperymenty obrazowania na nienaruszonych kulach o czasie trwania od 1 do 4 godzin zostały pomyślnie przeprowadzone w poprzednich publikacjach10.</li>
	<li>Nagrywaj i zapisuj dane w preferowanym formacie pliku. Oprogramowanie używane przez mikroskop tworzy pliki .czi do rejestracji danych.</li>
	<li>Pozbądź się globusów zgodnie ze standardowymi protokołami instytucjonalnymi na końcu protokołu.</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Protokół ten opisuje technikę obrazowania żywych komórek, która wykorzystuje wydrukowany w 3D uchwyt do stabilizacji i unieruchomienia nienaruszonych oczu zwierząt. Został zaprojektowany w celu obejścia kilku istotnych wad znanych z poprzednich protokołów obrazowania żywych komórek tkanki rogówki ex vivo . Protokół ten oferuje wiele korzyści w zakresie obrazowania żywych komórek nienaruszonych kul. Znacznie zmniejsza niepotrzebne uszkodzenia tkanek, które mogłyby zakłócać reakcję gojenia się ran na eksperymental...

Rogówka 
Rogówka jest przezroczystą, beznaczyniową strukturą pokrywającą przednią powierzchnię oka, która załamuje światło, aby umożliwić widzenie i chroni wnętrze oka przed uszkodzeniem. Ponieważ rogówka jest narażona na działanie środowiska, jest podatna na uszkodzenia zarówno z przyczyn mechanicznych (zadrapania), jak i z powodu infekcji. Uraz rogówki u zdrowego pacjenta zwykle goi się w ciągu 1-3 dni. Jednak u pacjentów z chorobami podstawowymi, takimi jak niedobór rąbków komórek macierzystych i cukrzyca typu II, proces gojenia się ran rogówki może być znacznie wydłużony1. Ponieważ rogówka jest silnie unerwiona, te niegojące się owrzodzenia rogówki i nawracające nadżerki rogówki są bardzo bolesne i znacznie obniżają jakość życia pacjentów, którzy ich doświadczają1.
Sygnalizacja komórkowa 
Kiedy zdrowa rogówka zostaje uszkodzona, zdarzenia sygnalizacji wapniowej w komórkach sąsiadujących z raną poprzedzają i skłaniają komórki do łożyska rany, gdzie zamykają uraz bez ryzyka bliznowacenia2,3. Te zdarzenia sygnalizacyjne zostały dobrze scharakteryzowane w modelach hodowli komórek nabłonka rogówki przy użyciu obrazowania żywych komórek2. Wstępne eksperymenty wykazały znacznie większą sygnalizację wapnia po urazie w komórkach niecukrzycowych w porównaniu z komórkami cukrzycowymi. Jednak scharakteryzowanie zdarzeń sygnalizacji komórkowej w globach ex vivo okazało się wyzwaniem technicznym.
Obrazowanie żywych komórek 
Wcześniejsze badania z powodzeniem zarejestrowały zdarzenia sygnalizacji wapniowej z modeli hodowli komórkowych in vitro gojenia się ran rogówki4,5,6. Opracowanie metodologii tworzenia wysokiej jakości obrazów tych zdarzeń sygnalizacyjnych w tkance ex vivo jest bardzo interesujące, ponieważ umożliwiłoby badanie tych zdarzeń w bardziej złożonym i realistycznym systemie. Poprzednie podejścia obejmowały wypreparowanie rogówki, a następnie unieruchomienie w żelu PEG indukowanym promieniowaniem UV7,8,9. Unieruchomienie jest niezbędnym, ale trudnym krokiem podczas pracy z żywą tkanką, ponieważ musi ona pozostać żywotna i nawodniona przez cały czas trwania eksperymentu. Ponadto unieruchomienie nie może uszkodzić tkanki. Podczas gdy roztwór PEG unieruchomiał tkankę, rozdzielczość i jakość wytwarzanych obrazów nie były spójne. Dlatego opracowano uchwyty drukowane w 3D, aby unieruchomić nienaruszone kule w celu uzyskania obrazów o wyższej jakości przy mniejszym ryzyku uszkodzenia tkanek.
Podejście 
Unikalny uchwyt wydrukowany w 3D został opracowany w celu unieruchomienia nienaruszonych kul ex vivo w celu obrazowania żywych komórek. Uchwyt ten zapobiega uszkodzeniom z dwóch głównych źródeł: pozwala na obrazowanie wyłuszczonej kuli bez konieczności preparowania rogówki i eliminuje ekspozycję na światło UV. Bez tych źródeł uszkodzeń uzyskane obrazy dokładniej reprezentowały reakcję na zadrapania wykonane eksperymentalnie. Co więcej, wydrukowany w 3D uchwyt został skalibrowany do dokładnych wymiarów mysiego oka. Zapewniło to znacznie lepsze dopasowanie niż unieruchomienie w roztworze PEG, prowadząc do wyższej jakości obrazu przy obiektywach o mniejszej mocy ze względu na zmniejszony ruch tkanki. Listwa pokrywy przymocowana do górnej części uchwytu zapewnia, że kula pozostaje nieruchoma przez cały czas trwania eksperymentu i że nie dochodzi do przemieszczenia kuli po zastosowaniu pożywki wzrostowej w celu utrzymania nawodnienia i żywotności. Możliwość wydrukowania uchwytu na precyzyjne wymiary pozwala nam również na wygenerowanie optymalnego dopasowania dla mysich oczu o różnych rozmiarach ze względu na wiek lub stan choroby. Technologia ta może być szerzej stosowana do opracowywania uchwytów do oczu różnych gatunków w oparciu o ich wymiary.

<table><tbody><tr><td>1.75 niebieski kwas polimlekowy (PLA) tworzywo sztuczne</td><td>Creality (Shenzen, Chiny)</td><td>N/A</td><td>Materiał na uchwyt</td></tr><tr><td>35 mm Talerz, nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 14 mm, Poli-D-Lizyna Powlekana</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>Studnia do obrazowania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk (San Rafael, Kalifornia).</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie używane do drukowania uchwytów.</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 sterylne igły jednorazowego użytku 100 igieł/pudełko</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>305124</td><td>Do eksperymentalnie wywołanych ran na kulach</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>C10046</td><td>Przeciwbarwienie błony komórkowej. Wskaźnik wapnia. Stężenie 1:10 000 z końcowym stężeniem 1%(v/v) DMSO i 0,1% (w/v) kwasu pluronowego</td></tr><tr><td>Complete Home Super Glue</td><td>Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A</td><td>Do mocowania uchwytu do studni obrazowania</td></tr><tr><td>Drukarka 3D Ender 3 Pro&nbsp;</td><td>Creality (Shenzen, Chiny)</td><td>N/A Do</td><td>drukowania uchwytu</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>Numer licencji: GPL2</td><td>Oprogramowanie służące do potwierdzania spójności głębokości i średnicy rany między niezależnymi kulami za pomocą analizy Region of Interest</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>Wskaźnik wapnia. Stężenie 1:100 z końcowym stężeniem 1%(v/v) DMSO i 0,1% (w/v) kwasu pluronowego</td></tr><tr><td>Keratynocyty Pożywka bez surowicy</td><td>Gibco (Waltham, MA)</td><td>17005042</td><td>25 mg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 i penicylina-streptomycyna (100 jednostek/ml, 100 &mikro; g/mL, odpowiednio) dodane do pożywki</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td><td>Służy do zmywania nadmiaru plam z rogówki przed obrazowaniem</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss 880 z AiryScan</td><td>Użyto obiektywu</td><td></td> o <td>20-krotnym powiększeniu</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek nienaruszonych kul ex vivo za pomocą nowatorskiego uchwytu wydrukowanego w 3d

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

Gojenie ran nabłonka rogówki to proces migracyjny zainicjowany przez aktywację receptorów purynergicznych wyrażających się na komórkach nabłonkowych. Ta aktywacja powoduje zdarzenia mobilizacji wapnia, które rozprzestrzeniają się z komórki na komórkę, co jest niezbędne do zainicjowania ruchliwości komórek w łożysku rany, sprzyjając efektywnemu gojeniu się ran. Laboratorium Trinkaus-Randall opracowało metodologię obrazowania reakcji na gojenie się ran rogówki w mysich kulach ex vivo w czasie rzeczywistym. Podejście to polega na wyłuszczeniu nienaruszonej kuli ziemskiej od myszy, która została poddana eutanazji zgodnie z ustalonymi protokołami, i natychmiastowej inkubacji kuli ziemskiej za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia. Na tym etapie można zastosować barwnik przeciwbarwiący, który barwi inne cechy komórki, aby pomóc w obrazowaniu i pokazać punkty orientacyjne komórki. Protokół działał dobrze z kilkoma różnymi barwnikami z żywych komórek stosowanymi do barwienia przeciwstawnego, w tym aktyną SiR do barwienia aktyny i ciemnoczerwonym barwieniem błony plazmatycznej do barwienia błony komórkowej. Aby zbadać reakcję na ranę, nabłonek rogówki jest uszkadzany za pomocą igły 25 G, a kule są umieszczane w uchwycie wydrukowanym w 3D. Wymiary uchwytu wydrukowanego w 3D są skalibrowane, aby zapewnić unieruchomienie kuli ziemskiej przez cały czas trwania eksperymentu i mogą być modyfikowane, aby pomieścić oczy o różnych rozmiarach. Obrazowanie reakcji rany na podstawie żywych komórek jest wykonywane w sposób ciągły na różnych głębokościach w tkance w czasie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten pozwala nam generować obrazy o wysokiej rozdzielczości i jakości publikowanej przy użyciu obiektywu pneumatycznego o powiększeniu 20x w mikroskopie konfokalnym. W przypadku tego protokołu można również wykorzystać inne cele. Stanowi to znaczną poprawę jakości obrazowania żywych komórek w mysich kulach ex vivo i umożliwia identyfikację nerwów i nabłonka.

Niniejszy protokół był wykorzystywany do spójnego generowania danych i obrazów o jakości publikacyjnej10. Uzyskane obrazy stanowią znaczącą poprawę w porównaniu z poprzednimi metodami (Rysunek 2). Dzięki zastosowaniu uchwytu wydrukowanego w technologii 3D możliwe jest obrazowanie wszystkich warstw rogówki oraz obserwacja mobilizacji wapnia w różnych płaszczyznach z (Rysunek 3). Podejście to zostało wykorzystane do porównania sygnalizacji ...

Niniejsza praca opisuje nowatorski protokół eksperymentalny, który wykorzystuje uchwyt wydrukowany w 3D, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości wyłuszczonych kul. Dzięki temu protokołowi można obserwować w czasie rzeczywistym komórkową aktywność sygnalizacyjną wapnia w uszkodzonym nabłonku rogówki z kul ex vivo.

Obrazowanie żywych komórek nienaruszonych kul ex vivo za pomocą nowatorskiego uchwytu wydrukowanego w 3D

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

Wydrukowany w 3D uchwyt używany w tym protokole pozwala nam monitorować krótkoterminową sygnalizację komórkową i długoterminowe zdarzenia migracji komórkowej w uszkodzonych rogówkach w czasie rzeczywistym. Utrzymując kulę ziemską w stanie nienaruszonym, żywotnym i nieruchomym, protokół ten tworzy wysokiej jakości obrazy na żywo komórek rogówki, w tym nabłonka i nerwów. Uchwyt wydrukowany w 3D można łatwo zmodyfikować pod kątem kul o różnych rozmiarach i gatunkach.Możemy również inaczej zorientować oczy, aby zobrazować inne obszary lub przeprowadzić eksperymenty z nano wgłębieniami. Na początek, po usunięciu głowy myszy poddanej eutanazji, natychmiast umieść ją na lodzie, aby zachować żywotność tkanki. Następnie wyłuszczej kule, spychając je rekwizytem za pomocą pęsety.I przytnij nerw wzrokowy za pomocą nożyczek preparacyjnych tuż poniżej miejsca, w którym jest trzymany przez pęsetę. Inkubować kule w dwóch mililitrach pożywki w naczyniu do hodowli komórkowych P-35, w tym wskaźnika wapnia i/lub barwienia błony komórkowej przez jedną godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w warunkach słabego oświetlenia, upewniając się, że kule są zanurzone w pożywce barwiącej w celu równomiernego barwienia. Aby przykleić uchwyty do czystego szkiełka na spodzie szkiełka, umyj uchwyt w 70% etanolu i nałóż klej na uchwyt.Następnie przyklej uchwyt do szklanego dolnego szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że w wewnętrznej części uchwytu nie ma kleju, ponieważ klej może fluoryzować, komplikując obrazowanie. Po zastygnięciu kleju upewnij się, że uchwyt jest zabezpieczony przed szkiełkiem nakrywkowym. Usuń kulki z roztworu barwiącego za pomocą sterylnych zakraplaczy, uważając, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki w obszarze zainteresowania.Myj kule przez pięć minut w temperaturze pokojowej, używając sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w celu usunięcia nadmiaru plam i umieść kule w pożywce w celu transportu do mikroskopu. Aby nawinąć kule za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25 w obszarze zainteresowania, podnieś i przytrzymaj kulę z tyłu oka, używając sterylnego zakraplacza, aby utrzymać kulę stabilnie i zapobiec jej toczeniu się. W przypadku rany po zadrapaniu delikatnie przesuń sterylną igłę o rozmiarze 25 po odsłoniętej rogówce lub delikatnie wciśnij igłę bezpośrednio w środkową rogówkę w celu uzyskania rany kłutej, upewniając się, że rana nie przebija błony podstawnej rogówki.Umieścić rogówkę lub obszar rąbka na szkiełku nakrywkowym w wewnętrznej części uchwytu, upewniając się, że kula ziemska jest prawidłowo umieszczona i że miejsce zainteresowania styka się ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Ustabilizuj za pomocą wydrukowanej w 3D osłony przyklejonej do uchwytu za pomocą kleju. I nie próbuj usuwać kuli, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki.Włącz mikroskop i ustaw komorę środowiskową na 35 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i sprawdź nawilżoną komorę. Umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego i ustabilizowaną kulę ziemską na stoliku mikroskopu w komorze środowiskowej i obrazie, używając technik obrazowania żywych komórek. Przez weterynarza dodatkowe podłoża wzrostowe na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec odwodnieniu i utrzymać żywotność tkanek, upewniając się, że w studzience jest wystarczająca ilość podłoża, aby pokryć kulę ziemską w uchwycie.Rozpocznij eksperymenty przy użyciu technik obrazowania żywych komórek, używając ustawień lasera o niskiej mocy, aby zachować tkankę i zapobiec jej uszkodzeniu oraz odpowiednie cele dla długotrwałych eksperymentów. Nagrywaj i zapisuj dane w preferowanym formacie plików CZI do nagrywania danych. Uzyskano wysokiej jakości dane obrazowe o wielowarstwowej strukturze dla rogówki X vivo, stabilizowanej za pomocą uchwytu wydrukowanego w 3D, demonstrując zdarzenia sygnalizacji wapniowej w warstwach wierzchołkowych, podstawnych i zrębowych rogówki.Obrazy Z-stack rogówki, unieruchomionej w wydrukowanym w 3D uchwycie, w ranie po zadrapaniu, uzyskano w celu wizualizacji błon komórkowych i sygnalizacji wapnia w warstwach rogówki oraz mobilizacji wapnia w różnych płaszczyznach Z. Eksperyment z szeregami czasowymi rogówki przeprowadzono w celu zbadania migracji komórek do łożyska rany podczas reakcji gojenia, ujawniając niewielki ruch kuli ziemskiej w kierunkach X, Y lub Z. Zaobserwowano, że umieszczając kulę ziemską w uchwycie, można uwidocznić różne obszary rogówki, zarówno w centralnej, jak i w okolicy rąbka rogówki.Protokół ten pozwala nam obrazować oczy z modeli chorób, które wykazują różnice w gojeniu się ran. Możemy scharakteryzować aberracje w sygnalizacji komórkowej i ruchliwości w żywej tkance.

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Embriony piskląt są używane do badania ludzkich guzów mózgu z glejakiem (GBM) in ovo i w kokulturach ex vivo. Zachowanie komórek GBM można rejestrować za pomocą mikroskopii poklatkowej w kokulturach ex vivo, a oba preparaty można analizować w eksperymentalnym punkcie końcowym za pomocą szczegółowej analizy konfokalnej 3D.

Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek rogówki z użyciem uchwytu drukowanego 3D. Technika umożliwia monitorowanie sygnałowania wapniowego i migracji komórek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywych komórek nienaruszonych kul ex vivo za pomocą nowatorskiego uchwytu wydrukowanego w 3D

Przeglądaj więcej filmów