Name: Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Naucz się izolować plastoglobule z tkanki liści roślin i cyjanobakterii za pomocą ultrawirówki i gradientu sacharozy. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskanie czystych kropelek lipidowych do analiz biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w grupie laboratoryjnej Lundquist są wspierane przez granty z NSF (MCB-2034631) i USDA (MICL08607) dla P.K.L. Autorzy dziękują dr Carrie Hiser (MSU) za wsparcie w opracowaniu metody izolacji plastoglobul sinicowych.

1. Surowa izolacja plastoglobul
<ol>
	<li>Surowa ekstrakcja plastoglobuli z nieobciążonej tkanki liści kukurydzy
	<ol>
		<li>Zdobądź sześć zdrowych siewek kukurydzy w wieku około 3 tygodni i prawie w fazie wzrostu V5, o wadze około 120 g.</li>
		<li>Odetnij wszystkie liście u podstawy łodygi, szybko zanurz je w kąpieli lodowej i przetransportuj do chłodni</li>.
		<li>Pracując pod zieloną lampą bezpieczeństwa, usuń liście kukurydzy z łaźni lodowej i pokrój je na mniejsze kawałki (około 5 cm x 5 cm) za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Delikatnie, ale dokładnie zmiel połowę przyciętej tkanki liściowej w komercyjnym blenderze w 350 ml buforu do mielenia (Tabela 1). Uruchom blender 5x-6x, aby upewnić się, że wszystkie liście są pocięte. Nie używaj poziomu wyższego niż 7 w blenderze.</li>
		<li>Przefiltrować homogenat przez jedną warstwę nylonowej tkaniny o grubości 25 μm na dużym lejku do czterech butelek wirówkowych o pojemności 250 ml. Następnie powtórz krok 1.1.4 z drugą połową przyciętej tkanki liścia.</li>
		<li>Równomiernie podzielić filtrat między cztery butelki i odwirować przez 6 minut przy 1,840 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć podwielokrotność filtratu z liści i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka liści ogółem.</li>
		<li>Odlewać powstały supernatant i delikatnie zawiesić osad w 12 ml pożywki R 0,2 zawierającej 0,2 M sacharozy (Tabela 1), obracając i ponownie zawieszając delikatnymi ruchami szczotki. Po ponownym wymieszaniu każdej granulki, przenieść zawiesinę do następnej butelki i powtórzyć mieszanie. Zawiesiny zebrać w jednej butelce.</li>
		<li>Rozprowadzić zbiorczą zawiesinę między sześcioma probówkami ultrawirówek o pojemności 3 ml, osiągając maksymalną objętość 2,5 ml w każdej probówce.</li>
		<li>Sonizuj każdą probówkę 4x, za każdym razem przez 10 s, używając sonografu końcówkowego o amplitudzie 100%. Uważaj, aby róg sonitora był zanurzony i z dala od powierzchni cieczy, aby zapobiec pienieniu się.</li>
		<li>Powoli przesuwaj klakson sonitora w górę i w dół w zawieszeniu podczas każdej rundy. Stosować naprzemiennie cztery probówki, po każdej sonikacji wkładając każdą probówkę z powrotem do wiadra z lodem, aby próbka ostygła.</li>
		<li>Odwirować sonikowaną surową zawiesinę tylakoidów o stężeniu 150 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą strzykawki i igły 22 G zebrać powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul z powierzchni poduszki sacharozy (łatwo widocznej jako żółta, oleista podkładka), przesuwając powierzchnię poduszki otworem igły, odzyskując około 500 μl z każdej probówki. Umieść w probówce o pojemności 2,0 ml.</li>
		<li>Zebrać porcje surowego tylakoidu przed i po sonikacji i uwolnieniu plastoglobul. Przejdź do kroku 2.1. Alternatywnie, surowe plastoglobule należy przechowywać w temperaturze -80 °C i oczyścić w późniejszym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Surowa ekstrakcja plastoglobuli z wysuszonej tkanki liścia E. nindensis
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w doniczkę (składającą się z trzech pojedynczych roślin w doniczce) z całkowicie wysuszonym, 8-9-tygodniowym E. nindensis (prawie 40 g tkanki).</li>
		<li>Odetnij całą tkankę liścia od podstawy rośliny, tuż nad glebą, za pomocą nożyczek i natychmiast zanurz tkankę w kąpieli lodowej. Przetransportuj tkankę do chłodni.</li>
		<li>Pracując pod zieloną lampą bezpieczeństwa, odetnij E. Nindensis pozostawia liście na mniejsze kawałki (około 5 cm x 5 cm) za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Delikatnie, ale dokładnie zmiel liście ze 100 ml buforu do mielenia (Tabela 1) w komercyjnym blenderze. Kilkakrotnie uruchom i zatrzymaj blender, aby upewnić się, że wszystkie liście są pokrojone. Nie używaj poziomu wyższego niż 7 w blenderze.</li>
		<li>Przefiltrować homogenat przez jedną warstwę nylonowej tkaniny o grubości 25 μm na dużym lejku do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Usunąć podwielokrotność filtratu z liści i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka ogółem liści.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość sacharozy, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 M i rozprowadzić roztwór w probówkach wirówkowych o pojemności 250 ml. 
		UWAGA: Wyższe stężenie sacharozy w porównaniu z preparatem Z. mays stosuje się w celu zapewnienia flotacji kropelek lipidów cytozolowych przed późniejszą sonikacją/uwolnieniem plastoglobul związanych z tylakoidami.</li>
		<li>Odwirować probówki o masie 45 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Mieszanina plastoglobulek i cytozolowych kropelek lipidów będzie łatwo widoczna jako żółta, oleista podkładka na powierzchni sacharozy lub w jej pobliżu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Zebrać pływający materiał za pomocą strzykawki z igłą 22 G, przesuwając powierzchnię poduszki z otworem igły, a następnie umieścić w tubce.</li>
		<li>Odrzucić pozostały supernatant po zebraniu swobodnie unoszącej się mieszaniny plastoglobulek i kropelek lipidów.</li>
		<li>Aby wyizolować plastoglobulki połączone z resztkowym tylakoidem, należy ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki R 0,2, obracając i ponownie zawieszając delikatnymi ruchami szczotki. Zawiesiny zebrać w jednej butelce. Przejdź do kroku 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Surowa ekstrakcja plastoglobul z sinic
	<ol>
		<li>Wyhoduj 50 ml kultury Synechocystis sp. PCC 6803 do fazy stacjonarnej (około 7-10 dni) i dostosuj gęstość komórek do OD750 2,0 za pomocą spektrofotometru. W warunkach hodowli należy użyć pożywki BG-11 i hodować w inkubatorze przy natężeniu światła 150 μmol fotonów/m2/s, 2% CO2 , 32 °C i przy ciągłym wytrząsaniu przy 150 obr./min.</li>
		<li>W celu usunięcia polisacharydów należy przepłukać komórki, odwirowując 50 ml kultury o stężeniu 6 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Kontynuuj, przemując komórki dwukrotnie w 50 ml buforu A (Tabela 1). Usunąć podwielokrotność homogenatu komórkowego i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem, aby była przechowywana jako reprezentatywna próbka komórkowa ogółem</li>
		<li>Ponownie zawiesić przemyty osad w 25 ml buforu A i rozbić komórki za pomocą francuskiej celi ciśnieniowej przy 1,100 psi, powtarzając proces 3x (umieść próbkę na lodzie między każdym cyklem, aby uniknąć denaturacji białka), aż zlizowany kolor zmieni się z zielonego na czerwono-niebiesko-zielony w białym świetle. Użyj wstępnie schłodzonego ogniwa i wykonaj ten krok w chłodni.</li>
		<li>Powstały homogenat rozprowadzić między ośmioma probówkami ultrawirówkowymi o pojemności 3 ml wypełnionymi maksymalnie do 2,5 ml w każdej probówce, a następnie ostrożnie nałożyć na 400 μl pożywki R, tworząc gradient krokowy. 
		UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w Yang, et al. i Kelekar, et al. 25,26.</li>
		<li>Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając w razie potrzeby dodatkowe medium R i odwirować przez 30 minut przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C. Tyrakooidy i inne cięższe organelle (w tym wszelkie ciała polihydroksyalkanianowe) będą się osadzać, podczas gdy plastoglobule będą łatwo widoczne jako żółta, oleista podkładka na lub w pobliżu szczytu gradientu sacharozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
		<li>Za pomocą strzykawki i igły 22G zbierz powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul i umieść ją w probówce o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z boku ścianki probówki ultrawirówki za pomocą końcówki igły.</li>
		<li>Przejdź do kroku 2.2. Alternatywnie, surowe plastoglobulki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i oczyścić później.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbieranie czystych plastoglobul
<ol>
	<li>Przetwarzanie tkanek roślinnych
	<ol>
		<li>Wytwarzać gradienty sacharozy w probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml, najpierw nakładając warstwy na 500 μl surowych plastoglobulek z kroku 1.1 lub kroku 1.2 zmieszanych z 500 μl pożywki R 0,7, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml, następnie nałożyć 400 μl pożywki R 0,2, a następnie nałożyć 400 μl pożywki R. 
		UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w artykułach Yang et al. oraz Kelekar et al.25,26.</li>
		<li>Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając nadmiar pożywki R do górnej warstwy, jeśli to konieczne. Następnie odwirować przy 150 000 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zbierz powstałą pływającą podkładkę z czystych plastoglobul (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A) za pomocą strzykawki i igły 22G i umieść w probówce o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z górnej części ścianki probówki wirówkowej za pomocą końcówki igły.</li>
		<li>Podwielokrotność czystych plastoglobul i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie cyjanobakterii
	<ol>
		<li>Wytworzyć gradient sacharozy w czterech probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml ułożonych najpierw warstwami z 500 μl surowych plastoglobul z kroku 1.3 zmieszanych z 750 μl pożywki R 0,7, a następnie nałożyć na 750 μl pożywki R 0,2, 
		UWAGA: Szczegółowe opisy przygotowania gradientu sacharozy można znaleźć w artykułach Yang et al. oraz Kelekar et al.25,26.</li>
		<li>Odwirować gradient sacharozy przy 150 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać czyste plastoglobulki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1C) za pomocą strzykawki i igły 22 G z górnej fazy gradientu sacharozy i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Podaczuj czyste plastoglobule i błyskawicznie zamrażaj w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li>
<li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening%2C+modified+prenyl-lipids%2C+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherol+cyclase+%28VTE1%29+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Plastoglobuli+von+Spinat%2C+ihre+Gr%C3%B6%CE%B2e%2C+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+%28L%29+Mill%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li>
<li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Pflanzenphysiologie%22%5BJournal%5D)">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li>
<li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li>
<li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+function+of+plastoglobuli+%3A+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li>
<li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobule+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li>
<li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li>
<li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).</li>
<li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).</li>
<li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2%2B-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signalling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).</li>
<li>Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBesagni%2C+C+%22Chloroplast+Research+in+Arabidopsis%22">Chloroplast Research in Arabidopsis</a>. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).</li>
<li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+preparation%2C+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).</li>
<li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelekar%2C+P+%22Cilia%3A+Motors+and+Regulation.+Methods+in+Cell+Biology%22">Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology</a>. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li>
<li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547(2012).</li>
<li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Aby zminimalizować zmiany fizjologiczne/biochemiczne w materiale i chronić niektóre foto- i termolabilne pigmenty prenylowo-lipidowe, które są bogatym składnikiem plastoglobul, konieczne jest wykonanie izolacji w temperaturze 4 °C i ochrona przed światłem. Jak wskazano powyżej, początkowe kroki wykonuje się w chłodni pod lampą bezpieczeństwa przy użyciu żarówki emitującej zielone światło. Kolejne etapy wykonywane w laboratorium odbywają się przy przyciemnionym oświetleniu i wykorzystują wirowanie lodem lub chłodzeniem. Z...

Obecne zrozumienie składu i funkcji plastoglobul wynika ze szczegółowych badań proteomicznych i lipidomicznych1,2,3,4,5. Takie badania zostały znacznie wsparte szybką i skuteczną metodą izolacji, która opiera się na ich bardzo niskiej gęstości w celu efektywnej separacji za pomocą gradientów sacharozy. Początkowe metody izolacji plastoglobul uzyskano z takich gatunków jak: buk zwyczajny (Fagus sylvatica), miotła zwyczajna (Sarothamnus scoparius), cebula (Allium), szpinak (Spinacia oleracea), bratek (Viola tricolor), papryka (Capsicum annuum) i groch (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11,12,13. Zaktualizowana metoda izolowania plastoglobul chloroplastowych w bardziej wydajny i bardziej wydajny sposób została później przedstawiona przez Ytterberg et al.3,14. Chociaż początkowo stosowaliśmy tę zaktualizowaną metodę do badania plaglobulek chloroplastów liści rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana), z powodzeniem zastosowaliśmy tę zaktualizowaną metodę do zdrowej tkanki liści innych gatunków roślin, zarówno jednoliściennych, jak i dwuliściennych, w tym kukurydzy (Zea mays), pomidora (Solanum lycopersicum), miłosicy (Eragrostis nindensis), fałszywego bromu purpurowego (Brachypodium distachyon) i dzikiego tytoniu (Nicotiana benthamiana; wyniki niepublikowane). Ponadto metoda izolacji została z powodzeniem zaadaptowana do plastoglobulek sinic, w tym Synechocystis sp. PCC 6803 i Anabaena sp. PCC 712015, oraz wysuszonej tkanki liściowej rośliny zmartwychwstania, E. nindensis.
Chloroplastowe globule zdrowej tkanki liścia są fizycznie połączone z błonami tylakoidów16. Pomimo tej fizycznej ciągłości, dwa podprzedziały chloroplastów utrzymują odrębny skład lipidów i białek, chociaż zaproponowano regulowaną wymianę lipidów i białek między tymi dwoma przedziałami2,4,17,18,19. W rzeczywistości niedawno zaproponowano interesujący model hemifuzji dla transportu neutralnych lipidów między chloroplastami a cytozol19. Ze względu na fizyczną ciągłość plastoglobul i tylakoidów, metoda izolacji ze zdrową tkanką liścia rozpoczyna się od pobrania granulowanego surowego preparatu tylakoidów, który jest następnie sonikowany w celu oddzielenia plastoglobul od tylakoidów, co jest przeciwieństwem metod stosowanych do izolowania kropelek lipidów cytozolowych<klasa sup="xref">20. Ultrawirowanie na poduszce sacharozowej następnie unosi plastoglobule o niskiej gęstości w górę przez sacharozę, skutecznie oddzielając je od tylakoidów, jąder i innych materiałów o dużej gęstości. W przeciwieństwie do tego, plastoglobule w sinicach, jak również te z wysuszonej tkanki liści, ewidentnie występują in vivo w postaci swobodnie pływającej. W związku z tym ich izolacja polega na bezpośrednim unoszeniu się na gradiencie sacharozy. W artykule przedstawiono metodę izolacji ze zdrowej tkanki liścia, a następnie zademonstrowano dwie odmiany, które można wykorzystać do wyizolowania plastoglobul z wysuszonej tkanki liścia lub kultur sinic, znacznie rozszerzając zakres fizjologiczny i kontekst ewolucyjny, w którym można badać plastoglobule.
Izolowane plastoglobule mogą być następnie używane do dowolnej liczby dalszych analiz w celu zbadania cech molekularnych. Wykorzystaliśmy izolowane plastoglobule z tkanki liścia A. thaliana do obszernej analizy proteomicznej i lipidomicznej w różnych warunkach środowiskowych lub genotypach, wykazując selektywną modyfikację składu białek i lipidów w adaptacji do stresu2,4,21,22. Ponadto przeprowadzono testy kinaz in vitro, które wykazują aktywność transfosforylacji związaną z izolowanymi plastoglobulami22, zbadano stany oligomeryczne składników białkowych za pomocą natywnej elektroforezy żelowej 21, a także przeprowadzono testy golenia proteazy23.
Główną zaletą tej metody jest względna szybkość procedury. Z naszego doświadczenia wynika, że opisane poniżej protokoły można w pełni wykonać w ciągu około 4 godzin. Opisano alternatywną metodę izolowania plastoglobul z tkanki liścia, która pozwala na jednoczesną izolację innych podkompartmentów chloroplastowych24. Ta alternatywna metoda oferuje pewne wyraźne korzyści, gdy konieczne lub pożądane jest porównanie ilościowe z innymi podkompartmentami chloroplastów. Jednak ta alternatywna metoda jest również bardziej żmudna i zapewni znacznie niższą wydajność izolowanych plastoglobul z porównywalnych ilości tkanki liścia. Gdy celem jest ukierunkowane badanie plastoglobulek, przedstawiona tutaj metodologia jest optymalnym wyborem. Niemniej jednak podczas przygotowywania próbki można pobrać całkowitą ilość porcji tylakoidów i surowych liści i zdecydowanie zaleca się to zrobić, aby mieć próbki referencyjne do późniejszego porównania.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosforan. 2Na5H2O</td><td>EMD Milipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Proliant Biologiczna</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>French Pressure cell (model FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem Multitron</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana cysteina</td><td>MP Biochemikalia</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu &middot; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W świetlówka Gro-Lux żarówka, 18"</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Blender (1,2 l)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Blender komercyjny</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy</tr></tbody></table>

izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Kropelki lipidowe plastoglobuli są dynamicznym podkompartmentem chloroplastów roślinnych i cyjanobakterii. Uważa się, że występują powszechnie wśród gatunków fotosyntetyzujących i odgrywają kluczową rolę w adaptacji i przebudowie błony tylakoidów w szybko zmieniających się warunkach środowiskowych. Zdolność do izolowania plastoglobulek o wysokiej czystości znacznie ułatwiła ich badanie dzięki metodom proteomicznym, lipidomicznym i innym. Dzięki plastoglobulom o wysokiej czystości i wydajności możliwe jest zbadanie ich składu lipidowego i białkowego, aktywności enzymatycznej i topologii białek, a także innych możliwych cech molekularnych. W artykule przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji plastoglobul z chloroplastów tkanki liści roślin oraz przedstawiono warianty metodologiczne izolacji plastoglobul i powiązanych struktur kropelek lipidowych z liści kukurydzy, wysuszonej tkanki liścia rośliny zmartwychwstania, Eragrostis nindensis, oraz cyjanobakterii, Synechocystis Sp. z o.o. PCC 6803. Izolacja opiera się na niskiej gęstości tych bogatych w lipidy cząstek, co ułatwia ich oczyszczanie przez flotację o gęstości sacharozy. Metodologia ta okaże się cenna w badaniach plastoglobul z różnych gatunków.

Po zakończeniu kroku 1 protokołu powinna być wyraźnie widoczna znaczna ilość materiału plastoglobul/kropelek lipidowych pływającego na (lub w pobliżu) górnej warstwie poduszki sacharozowej (Ryc. 1B-C). Na tym etapie można zebrać również inne frakcje. Na przykład tylakoidy zostaną osadzone w formie pelletu i mogą zostać zawieszone ponownie w medium R 0.2 do dalszych analiz. Po kolejnym wirowaniu oczyszczone plastoglobule zostaną otrzymane na powierzchni lub w...

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Izolacja wysoce czystych plastoglobulek ma kluczowe znaczenie dla ich badania. Przedstawiono tutaj szybki i skuteczny protokół ich izolacji, który ułatwia ich dalsze badania biochemiczne. Podstawową zaletą tej metody jest względna szybkość zabiegu i jego zdolność adaptacji do wielu gatunków roślin i warunków środowiskowych.Szczególną ostrożność należy zachować podczas sonikacji zawiesin tylakoidów w celu zapewnienia siły wystarczającej do usunięcia plastoglobul z tylakoidów, a następnie ekstrakcji plastoglobul z gradientu sacharozy. Tę procedurę zademonstrują dr Elsinraju Devadasu, doktor habilitowany w moim laboratorium, oraz Febri Susanto, doktorant w moim laboratorium. Zacznij od zdobycia trzytygodniowych sadzonek sześciu zdrowych odmian kukurydzy, mających fazę wzrostu V5 i ważących około 120 gramów.Odetnij wszystkie liście u podstawy łodygi i szybko zanurz je w kąpieli lodowej przed przetransportowaniem do chłodni. Pracując pod zieloną lampą bezpieczeństwa, usuń liście kukurydzy z łaźni lodowej i pokrój je nożyczkami na mniejsze kawałki o wymiarach pięć na pięć centymetrów. Delikatnie i dokładnie zmiel połowę przyciętej tkanki liściowej w 350 mililitrach bufora do mielenia na poziomie niższym niż siedem w komercyjnym blenderze.Uruchom i zatrzymaj blender pięć do sześciu razy, aby upewnić się, że wszystkie liście zostały pokrojone. Przefiltruj homogenat przez jedną warstwę nylonowej tkaniny o grubości 25 mikronów na dużym lejku do czterech 250-mililitrowych butelek wirówek. Po powtórzeniu etapu mieszania z pozostałą przyciętą tkanką liścia, równomiernie podzielić filtrat między cztery butelki.Usunąć podwielokrotność filtratu z liści i odłożyć ją na bok w celu przechowywania jako reprezentatywną próbkę ogółem liści. Następnie odwirować filtrat przez sześć minut w temperaturze 1,840 G i czterech stopniach Celsjusza. Odlej powstały supernatant i delikatnymi ruchami wirowymi szczotki ponownie zawieś osad w 12 mililitrach podłoża R 0,2, zawierającego 0,2 molowej sacharozy.Po ponownym umieszczeniu osadu w jednej butelce, dodać zawiesinę do następnej butelki i powtórzyć ponowne wymieszanie, aby zawiesiny zebrać w jednej butelce. Rozprowadź zbiorczą zawiesinę między sześcioma trzymililitrowymi probówkami ultrawirówek, osiągając maksymalną objętość 2,5 mililitra w każdej probówce. Następnie użyj sonikatora z końcówką o amplitudzie 100%, aby poddać sonifikację każdej probówki cztery razy przez 10 sekund każda.Upewnij się, że klakson sonikatora jest zanurzony i z dala od powierzchni cieczy, aby zapobiec pienieniu. Powoli przesuwaj klakson sonitora w górę i w dół w zawieszeniu podczas każdej rundy. Zmieniając cztery probówki, po każdej sonikacji należy włożyć każdą probówkę z powrotem do wiadra z lodem, aby próbka ostygła.Po zakończeniu odwirować sonikowaną surową zawiesinę tylakoidów o stężeniu 150 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zetrzyj powierzchnię poduszki za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 22 i zbierz powstałą żółtą i oleistą pływającą podkładkę z surowych plastoglobulek z poduszki sacharozy. Odzyskaj około 500 mikrolitrów z każdej probówki i umieść je w probówce o pojemności 2,0 mililitra.Zebrać surowe podwielokrotności tylakoidów przed i po sonikacji i uwolnieniu plastoglobul. Po zakończeniu kontynuuj przetwarzanie tkanek roślinnych lub przechowuj surowe plastoglobule w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i oczyść je później. Hoduj 50 mililitrów kultury PCC 6802 z gatunku synechocystis w pożywce BG11 przez 7 do 10 dni, aby osiągnąć fazę stacjonarną.Za pomocą spektrofotometru dostosuj gęstość komórek do gęstości optycznej 2,0 przy 750 nanometrach. Aby usunąć polisacharydy, odwirować 50 mililitrów kultury i usunąć supernatant. Powtórzyć płukanie komórek w 50 mililitrach buforu A dwa razy.Ponownie zawiesić umyty osad w 25 mililitrach buforu A i rozbić komórki za pomocą francuskiej celi ciśnieniowej o wadze 1,100 funtów kwadratowych. Powtórz proces trzy razy w niskich temperaturach, aż zlizowany kolor zmieni się z zielonego na czerwony, niebieski, zielony w białym świetle. Usunąć podwielokrotność homogenatu komórkowego i odłożyć ją na bok w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka komórkowa ogółem.Rozprowadź powstały homogenat w ośmiu trzymililitrowych probówkach ultrawirówek wypełnionych maksymalnie 2,5 mililitra w każdej probówce. Nałożyć ten homogenat na 400 mikrolitrów pożywki R, tworząc gradient krokowy. Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając w razie potrzeby dodatkowe medium R przed odwirowaniem probówek.Tyrakooidy i inne cięższe organelle, w tym wszelkie ciała polihydroksyalkanianowe, wykazują tworzenie osadów, podczas gdy plastoglobule tworzą żółtą oleistą podkładkę na szczycie gradientu sacharozy lub w jego pobliżu. Zbierz powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul za pomocą strzykawki, jak pokazano wcześniej, i umieść zbiór w dwumililitrowej probówce. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z boku ścianki probówki ultrawirówki za pomocą końcówki igły.Albo kontynuuj przetwarzanie cyjanobakterii, albo przechowuj surowe plastoglobule w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i oczyść później. Aby zebrać czyste plastoglobule metodą przetwarzania tkanek roślinnych, przygotuj opisany wcześniej gradient sacharozy, używając 500 mikrolitrów surowych plastoglobul, 400 mikrolitrów pożywki R 0,2 i 400 mikrolitrów pożywki R. Po odwirowaniu zbierz powstałą pływającą podkładkę z czystych plastoglobul do dwumililitrowej probówki. Po podzieleniu czystych plastoglobul i błyskawicznym zamrożeniu podwielokrotności w ciekłym azocie, przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub liofilizuj do suchego proszku.Aby zebrać czyste plastoglobule z cyjanobakterii, utwórz gradient sacharozy, jak wspomniano wcześniej, używając 500 mikrolitrów surowych plastoglobul, 750 mikrolitrów pożywki R 0,7 i 750 mikrolitrów pożywki R 0,2. Po odwirowaniu zbierz czyste plastoglobule w 1,5-mililitrowej probówce i podziel czyste plastoglobulki. Po zakończeniu błyskawicznie zamroź czyste porcje plastoglobul w ciekłym azocie i przechowuj je bezpośrednio w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub liofilizuj do suchego proszku.W tej metodzie zaobserwowano znaczną ilość plastoglobulki lub kropelki lipidu unoszące się na górnej warstwie poduszki sacharozy. Po kolejnym odwirowaniu oczyszczone plastoglobulki otrzymywano na powierzchni gradientu sacharozy lub w jej pobliżu. Po udanej izolacji plastoglobul, immunobloty opracowane do oceny czystości przy użyciu przeciwciał podniesionych przeciwko arabidopsis thaliana fibrillin 1a i arabidopsis thaliana photosystem II podjednostka D1 wykazały, że homologi fibryliny były przede wszystkim związane z tylakoidami niż plastoglobulkami.Aby zapewnić wydajną i skoncentrowaną ekstrakcję pływającej podkładki, umieść otwór igły strzykawki tuż pod powierzchnią płynu bufora, gdy jest całkowicie zanurzony, a następnie delikatnie pociągnij do góry. Wyizolowane próbki plastoglobul są podatne na późniejsze badania proteomiczne lub lipidomiczne i zostały wykorzystane do wykazania zmian w docelowym składzie białkowo-lipidowym w różnych warunkach środowiskowych. Technika ta ułatwiła nowe badania nad plastoglobulą, w tym odkrycie związanej z nią aktywności kinazy białkowej i obecności oligomerycznych kompleksów białkowych poprzez późniejsze badania biochemiczne.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Źródło: Shivaiah, K., et al. Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia izolację plastoglobul od sinic. Rozpoczyna się od hodowli cyjanobakterii i przechodzi przez rozbijanie komórek za pomocą siły mechanicznej. Uwolnienie pigmentów fotosyntetycznych wskazuje na udaną lizę. Gradient krokowy sacharozy jest następnie używany do oddzielania składników komórkowych według gęstości, umożliwiając plastoglobulkom o niskiej...

Ekstrakcja i oczyszczanie plastoglobul z bakterii fotosyntetycznych

Źródło: Shivaiah, K., et al. Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje izolację plastoglobul od cyjanobakterii za pomocą wirowania w gradicyi gęstości sacharozy, podkreślając ich bogaty w lipidy charakter o niskiej gęstości i zapewniając ich zachowanie strukturalne do dalszej analizy.

Oczyszczanie w gradiencie gęstości plastoglobul cyjanobakteryjnych

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

Naucz się izolować plastoglobule z tkanki liści roślin i cyjanobakterii za pomocą ultrawirówki i gradientu sacharozy. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskanie czystych kropelek lipidowych do analiz biochemicznych.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Przeglądaj więcej filmów