Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

Podczas gdy techniki oceny biomarkerów biochemicznych są szeroko stosowane, protokół ten przedstawia kluczowe szczegóły dotyczące standaryzacji i replikacji metodologii u anuranów neotropikalnych. Główną zaletą tej techniki jest jej niski koszt, powtarzalność i zastosowanie. Technika ta może być stosowana do uzyskiwania danych ilościowych w celu oceny zmian w wewnętrznej melaninie.

Test kometarny jest czułą, wszechstronną i prostą techniką, która pozwala określić efekty genotoksyczne wywołane przez określony związek. Może być stosowany do każdego rodzaju komórek eukariotycznych w celu monitorowania uszkodzeń DNA, naprawy DNA i oceny statusu przeciwutleniającego komórek. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0 i wybierz menu i pasek narzędzi jako biologiczne.

Aby określić ilościowo obszar zajmowany przez melaninę, wybierz pomiar, a następnie wybierz przestrzenną kalibrację powiększenia używaną do wykonania mikrofotografii. Po otwarciu obrazu histologicznego wybierz liczbę narzędzi, a następnie zmierz obiekty. Zaznacz na obrazie kolorowanie, które ma być mierzone, za pomocą narzędzia Wybierz kolory i zakraplacz, a następnie zamknij okno.

Wizualizuj wyniki, klikając liczbę, widok i statystyki. Inkubuj mieszaninę PBS, nadtlenku wodoru i próbki w trzymililitrowej kuwecie kwarcowej o długości jednego centymetra. Następnie wyjmij próbkę przechowywaną w probówce wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów i dodaj ją do kuwety kwarcowej.

Odczytaj kinetykę katalazy przy 240 nanometrach przez dwie minuty w spektrofotometrze UV i oblicz aktywność enzymu, korzystając z równania pokazanego na ekranie. Rozcieńczyć pobraną próbkę krwi jednym mililitrem PBS. Odwirować go przy 381 G przez dziewięć minut i ponownie zawiesić osad z 50 mililitrami PBS.

Wymieszaj 30 mikrolitrów próbki krwi z 70 mikrolitrami agarozy o niskiej temperaturze topnienia lub LMPA w stężeniu 0,5% agarozy, aby utworzyć warstwę drugą. Umieścić 50 mikrolitrów warstwy drugiej na szkiełku uprzednio pokrytym warstwą pierwszą zawierającą 100 mikrolitrów 0,5% agarozy o normalnej temperaturze topnienia. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i umieść je na zimno w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut, aby zestalić warstwę drugą.

Po zestaleniu usuń szkiełko nakrywkowe. Uformuj trzecią warstwę, układając 100 mikrolitrów 0,5% LMPA i ponownie przykryj szkiełko. Po zestaleniu się trzeciej warstwy usuń szkiełko nakrywkowe i zanurz każde szkiełko w 100-mililitrowym słoiku z kopinem zawierającym roztwór do lizy przygotowany tego samego dnia.

Umieść słoiki z kopiną w zimnej kąpieli w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę w ciemności, aby nastąpiła liza. Pod koniec lizy wyjmij szkiełka i zanurz je w roztworze buforowym do elektroforezy w zbiorniku do elektroforezy na 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Po rozwinięciu jądrowego DNA wykonuj elektroforezę na tym samym buforze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut przy napięciu 25 woltów i 250 miliamperach.

Pod koniec elektroforezy zneutralizować próbki na szkiełkach, dodając trzy razy dwa mililitry roztworu solnego tris przez pięć minut. Umieść próbki w 100-mililitrowych słoikach z kopiną zawierających 95% alkoholu w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu odwodnienia próbek. Wybarwić próbki, dodając 10 mikrolitrów DAPI do środka szkiełka.

Następnie rozprowadź barwnik w próbkach za pomocą szkiełka nakrywkowego. Zbadaj szkiełka pod fotomikroskopem fluorescencyjnym z filtrem NU. Określ ilościowo uszkodzenia DNA, oceniając długość migracji DNA z nukleoidu.

W takim przypadku określ to wizualnie na 100 losowo wybranych komórkach bez nakładania się. Następnie sklasyfikuj uszkodzenia DNA na cztery klasy, gdzie zero do jednego oznacza brak uszkodzeń, dwa oznacza minimalne uszkodzenia, trzy oznaczają średnie uszkodzenia, a cztery oznaczają maksymalne uszkodzenia. Wyraź dane jako średnią liczbę uszkodzonych komórek i średni wynik komety dla każdej grupy badanej.

Na koniec na podstawie tych danych oblicz wskaźnik uszkodzeń genetycznych lub GDI dla każdego badanego organizmu, korzystając z równania pokazanego na ekranie. Skalowany wskaźnik masy dorosłych osobników Boana pulchella i Leptodactylus luctator przedstawiono na tym rysunku. Do analizy skalowanego wskaźnika masy przeprowadzono analizę regresji nieliniowej, która pokazuje zależność funkcji potęgowej między SVL a masą ciała dla gatunku w celu wyznaczenia wykładnika skalowania.

Skalowany indeks masy jest przydatny do porównywania grup osobników dorosłych lub młodocianych osobników tego samego gatunku. Przedstawiono tutaj wycinki histologiczne wątroby Boana raniceps. Z tych odcinków można zaobserwować większą ilość c oraz większe wymiary hepatocytów i jądra hepatocytów.

Na rysunku przedstawiono różne i komplementarne odpowiedzi biomarkerów cytogenetycznych w scenariuszu ekspozycji na herbicydy u Boana pulchella. Tutaj czarne paski wskazują 48 godzin, a szare paski wskazują 96 godzin. Czas narażenia i stężenie powinny być zawsze brane pod uwagę jako czynnik, ponieważ określony czas lub stężenie może nie wystarczyć do wywołania szkody.

Reprezentatywny obraz opisuje, w jaki sposób biomarkery są powiązane ze wskaźnikiem odpowiedzi biomarkera. Tutaj kolor niebieski oznacza grupę kontrolną, podczas gdy kolory pomarańczowy, żółty i zielony wskazują scenariusze ekspozycji na BDE 209. Dane te wskazują, że katalaza jest skutecznym biomarkerem w sytuacjach stresowych, w których stresor występuje w najwyższych stężeniach.

Obliczając wskaźnik kondycji ciała, konsekwentnie rób zdjęcia z tej samej odległości. W kijankach zmierz długość ciała SVL aż do rurki kloaki, z wyłączeniem płetwy kołnierza. Takie podejście bezpiecznie odnosi się do fizjologii i wpływu zmian środowiskowych.

Chociaż istnieją alternatywne, potencjalnie inwazyjne biomarkery, metody te oferują wgląd w stres oksydacyjny, toksykodynamikę i toksykogenetykę. Dodatkowe pomiary enzymatyczne związane ze stresem oksydacyjnym mogą służyć jako alternatywne metodologie. Technika analizy różnic kolorów ocenia reakcje tkanek na mikrofotografiach na podstawie różnic kolorystycznych.

W przypadku systemu pigmentowego upewnij się, że kalibracja programu jest zgodna z mikrofotografią. Ta zaawansowana technika ma zasadnicze znaczenie w badaniu, czy ksenobiotyki bezpośrednio wpływają na DNA w różnych typach komórek, odpowiadając na pytania dotyczące uszkodzeń oksydacyjnych i procesów naprawczych materiału genetycznego, których inne techniki cytogenetyczne nie są w stanie rozwiązać.