Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Protokół ten pokazuje niejednorodność składu, struktury i morfologii zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, w zależności od ich bodźca indukującego w porównywalnych warunkach in vitro na ludzkich neutrofilach od zdrowych osób. Uzyskuje się wysoką czystość i żywotność neutrofili. Pozwala to na porównanie stężenia DNA, LL-37 i aktywności enzymatycznej mieloperoksydazy, elastazy i katepsyny G, uwalnianych przez zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili

Protokół ten pozwolił na analizę wpływu czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego lub możliwych terapii lub mechanizmów zamykania produkcji NET w chorobie autoimmunologicznej. Metody te mogą pomóc w badaniu chorób autoimmunologicznych. Ze względu na niekontrolowaną reprodukcję komórek NET i czas trwania wyrównują ich składniki, które są uważane za biomarkery choroby.

Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na uchwycenie obrazu NET pokazującego dyspersję DNA w połączeniu z białkiem takim jak LL37, które kolokalizuje się z mikroorganizmami, pomagając zrozumieć, w jaki sposób się pojawiają. Aby rozpocząć, wykonaj nakłucie żyły, aby zebrać 10 mililitrów krwi obwodowej w probówkach zawierających dipotasowy EDTA jako antykoagulant. Następnie wykonaj standardową biometrię krwi i test białka C-reaktywnego, aby wykluczyć infekcję lub stan zapalny, aby zapewnić jakość próbki.

Odwirować próbkę krwi obwodowej w celu usunięcia osocza bogatopłytkowego, a następnie przeprowadzić drugie odwirowanie i wyrzucić pozostałe osocze. Rozcieńczyć powstały pakiet erytrocytów i leukocytów w stosunku objętościowym jeden do jednego za pomocą jednego 1X DPBS. Następnie w sterylnej szklanej probówce o pojemności 10 mililitrów najpierw umieść jeden mililitr roztworu o gęstości 1,08 grama na mililitr, a następnie jeden mililitr roztworu o gęstości 1,079 grama na mililitr

Następnie dodaj cztery mililitry rozcieńczonego pakietu erytrocytów i leukocytów, wylewając na ścianki. Wirować bez przyspieszania lub zwalniania, aby uniknąć zakłócenia gradientu. Odessać fazę odpowiadającą granulocytom i przenieść do innej sterylnej szklanej probówki o pojemności 10 mililitrów.

Przemyć czterema mililitrami 1X DPBS w 300 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Aby usunąć pozostałe erytrocyty, potraktuj komórki wstrząsem osmotycznym, dodając cztery mililitry 0,2% roztworu soli fizjologicznej. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirować.

Odrzucić supernatant i dodać cztery mililitry 0,65% roztworu soli fizjologicznej. Inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przywrócić integralność błony i powtórzyć wirowanie. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach 1X DPBS, aby usunąć resztki komórkowe.

Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach zimnego buforu HBSS. Aby przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanowego, rozcieńczyć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek w 20 mikrolitrach 0,4% błękitu trypanowego. Policz komórki w nowej komorze altany i określ żywotność komórek za pomocą testu wykluczania.

Następnie zamontuj 5 mikrolitrów zawiesiny ogniw na szkiełku i zabarwiaj barwnikiem Wrighta przez 15 sekund. Natychmiast utrwalić próbkę, przemyć wodą destylowaną i obserwować morfologię pod mikroskopem optycznym. Następnie dodaj jeden razy 10 do piątych komórek do probówek cytometrii przepływowej i zabarwić jednym mikrolitrem 7AAD w 100 mikrolitrach buforu FACS przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Przemyć 500 mikrolitrami buforu FACS o stężeniu 300 G przez 10 minut. Utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 2% paraformaldehydu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy cytometrii przepływowej. W celu kontroli martwych komórek utrwal komórki 200 mikrolitrami 4% paraformaldehydu przez 30 minut i przemyj 500 mikrolitrami 1XPBS przy 300 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Wyrzuć supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 0,1% Triton X-100. Inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj 500 mikrolitrami 1X PBS i zabejcuj 7AAD.

Przeanalizuj przechwycone dane w oprogramowaniu cytometru przepływowego. Załaduj pliki i kliknij dwukrotnie niezabarwiony plik neutrofili. Wybierz rozproszenie do przodu lub FSC na osi X i rozproszenie boczne lub SSC na osi Y, aby wyświetlić populację komórek odpowiadającą neutrofilom.

Następnie wybierz kanał B3-A:PerCP vio 700-A na osi X, aby usunąć autofluorescencję komórek i wybierz histogram na osi Y. Następnie otwórz poplamiony plik neutrofili. Wybierz FSC na osi X i SSC na osi Y, aby wyświetlić populację komórek odpowiadającą neutrofilom.

Ponownie wybierz kanał B3-A:PerCP vio 700-A, aby wyznaczyć populację neutrofili dodatnich dla barwnika 7AAD. Wygeneruj ostateczny histogram, klikając okno prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję kopiuj do edytora układu. Dodaj pseudostrzępki bakteryjne lub grzybicze w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 200 mikrolitrów, czyli pięć mikromolowych CFSC w 1X PBS. Wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 500 mikrolitrów zdekomplementowanego osocza i odwirówkę.

Odrzucić supernatant i przemyć osad jednym mililitrem 1XPBS z odwirowaniem. Następnie ponownie zawiesić mikroorganizmy w 250 mikrolitrach 1X PBS. Przygotuj 50 mikrolitrów podwielokrotności w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra z dwoma razy 10 do siódmej bakterii lub dwa razy 10 do piątych pseudostrzępek do indukcji NET.

Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe o wymiarach 10 na 10 milimetrów w płytce 24-dołkowej. Przykryj 10 mikrolitrami 0,001% poli l-lizyny na godzinę w temperaturze pokojowej i umyj dwukrotnie 100 mikrolitrami 1X PBS. Wysuszyć na powietrzu i naświetlić światłem UV przez 15 minut.

Następnie należy zastąpić roztwór HBSS przygotowanej wcześniej zawiesiny neutrofili pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% subskrypcją autologicznego osocza odgrzybionego termicznie. Dodaj 350 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do 24-dołkowej płytki, aby uzyskać końcowe stężenie dwa razy 10 do piątej neutrofili na studzienkę. Inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby komórki mogły przylgnąć do dna studzienek.

Aby wywołać tworzenie się sieci, dodaj bodźce bakteryjne MOI100 i pseudostrzępki w MOI1. Dodaj również bodźce biochemiczne i przygotuj kontrolę bez bodźca, dodając 50 mikrolitrów HBSS. Uzyskać końcową objętość 400 mikrolitrów na studzienkę i mieszać na wytrząsarce płytkowej z prędkością 140 obr./min przez 30 sekund.

Następnie inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po indukcji netto usunąć supernatant ze studzienek, ostrożnie pipetując i utrwalić komórki 300 mikrolitrami 4% paraformaldehydu przez 30 minut. Umyj komórki 200 mikrolitrami 1X PBS bez wirowania i dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego na 30 minut.

W przypadku barwienia LL37 należy przepuścić komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,2% Triton X-100 w 1X PBS przez 10 minut i dwukrotnie przemyć 1X PBS. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych. DNA barwi komórki dwoma mikrolitrami DAPI i przechowuje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Dynamiczne fazy komórkowe zwizualizowano po oczyszczeniu gradientem podwójnej gęstości. Typowa morfologia neutrofili została potwierdzona przez prawidłowe barwienie. Komórki wykazały również optymalną żywotność zaobserwowaną poprzez wykluczenie błękitu trypanowego bez przerwania błony.

Analiza SSC w porównaniu z FSC za pomocą cytometrii przepływowej potwierdziła populację odpowiadającą PMN o wysokiej czystości komórek. Wykresy punktowe PMN dla komórek niebarwionych w porównaniu z komórkami barwionymi 7AAD i ich odpowiednimi histogramami wykazały wysoką żywotność komórek w świeżo wyizolowanych neutrofilach w porównaniu z przepuszczalnymi komórkami kontrolnymi. Po stymulacji neutrofili stymulantami chemicznymi i mikrobiologicznymi, NET zwizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu DNA DPI i anty-LL37.

Mikroorganizmy zostały wstępnie wybarwione CFSE. Samobójcze tworzenie sieci wywołane PMA, na które wskazuje kolokalizacja z LL37. Podczas gdy NET utworzone za pomocą HOCI wykazywały niewielką dyspersję DNA w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, która odpowiadała tworzeniu się istotnej NET.

NET indukowany przez pseudostrzępki grzybów wykazywał niskie stężenia DNA uwalnianego do przestrzeni zewnątrzkomórkowej o nitkowatych strukturach charakterystycznych dla istotnej formacji NET. S.aureus wykazywał istotną formację NET, podczas gdy P.aeruginosa indukował uwalnianie dużych stężeń DNA o mętnej morfologii, która współlokalizowała się z LL37, co wskazuje na samobójcze tworzenie NET. Zastosowanie metodologii gradientu podwójnej gęstości pozwala na uzyskanie wysokiej czystości i żywotności neutrofili.

I podnosimy prania, unikamy uszkodzenia ich struktury. Podążając tą metodą, możemy przeanalizować wpływ substancji lub komórek na produkcję NET, a także to, czy są one zaangażowane w jakiś mechanizm lub ich zastosowanie jako terapie w chorobach autoimmunologicznych.