Name: Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Poznaj metodę analizy morfologicznej i kompozycyjnej pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych różnymi bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi. Protokół umożliwia badanie heterogeniczności NETs w chorobach autoimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z zakresu nauk podstawowych (#285480) od CONACyT oraz przez Wydział Klinicznych Badań Immunologicznych Wydziału Nauk Biochemicznych, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L i W.J.R.R. mają stypendia doktorskie o numerach CONACyT odpowiednio #799779, #660793 i #827788.

Próbki krwi pozyskano jako darowizny od klinicznie zdrowych uczestników po uzyskaniu świadomej zgody. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Badań nad Ludźmi Wydziału Nauk Biochemicznych Universidad Autónoma 'Benito Juárez' w Oaxaca.
UWAGA: Kryteria włączenia do badania obejmowały brak określonej płci i wieku oraz stan klinicznie zdrowy, oceniany na podstawie odpowiedzi uczestników w kwestionariuszu przed pobraniem próbki krwi. W celu określenia liczby komórek oraz wykluczenia infekcji lub anemii przeprowadzono analizę hematologiczną, a także test na białko C-reaktywne, aby wykluczyć stan zapalny u dawcy.
1. Pobieranie krwi obwodowej oraz uzyskiwanie frakcji erytrocytów i leukocytów
<ol>
	<li>Pobrać 10 mL krwi obwodowej drogą nakłucia żyły do probówek zawierających 1,8 mg/mL K2·EDTA jako antykoagulanta (patrz Tabela materiałów) od klinicznie zdrowych osób po uzyskaniu świadomej zgody. Następnie przeprowadzić standardową biometrię krwi oraz test na białko C-reaktywne, aby wykluczyć infekcję lub stan zapalny, zapewniając wysoką jakość próbki.</li>
	<li>Próbkę krwi obwodowej wirować przy 82 x g przez 15 min w celu usunięcia osocza bogatopłytkowego, a następnie przeprowadzić drugie wirowanie przy 630 x g przez 5 min. Odrzucić pozostałe osocze, aby uzyskać osad erytrocytów i leukocytów.</li>
	<li>Rozcieńczyć go w stosunku 1:1 (v/v) w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>
2. Oczyszczanie neutrofili polimorfonuclearne (PMN) z wykorzystaniem podwójnego gradientu gęstości
UWAGA: Oczyszczanie neutrofili należy przeprowadzić niezwłocznie po pobraniu krwi, ponieważ ich czas przeżycia in vitro jest ograniczony i wynosi około 8 h.
<ol>
	<li>Do sterylnej szklanej probówki o pojemności 10 mL (patrz Tabela materiałów) wprowadź kolejno: 1 mL roztworu o gęstości 1,098 g/mL, 1 mL roztworu o gęstości 1,079 g/mL (patrz Tabela materiałów), a następnie 4 mL rozcieńczonej zawiesiny erytrocytów i leukocytów. Nalej ciecze po ściankach, nie naruszając napięcia powierzchniowego między warstwami, aby zapobiec ich zmieszaniu.</li>
	<li>Wiruj przy 320 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C, unikając gwałtownego przyspieszania i hamowania, aby wysokie siły odśrodkowe nie zakłóciły gradientu.</li>
	<li>Odessa fazę odpowiadającą granulocytom (Rysunek 1A) za pomocą pipety i przenieś ją do drugiej sterylnej szklanej probówki o pojemności 10 mL. Przemyj 4 mL 1x DPBS, wirując przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlej nadsącz i poddaj komórki szokowi osmotycznemu, aby usunąć pozostałe erytrocyty. Dodaj 4 mL 0,2% roztworu soli fizjologicznej na 2 min w temperaturze 4 °C, a następnie wiruj przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odlej nadsącz. Następnie dodaj 4 mL roztworu izotonicznego (0,65% roztwór soli) na 5 min w temperaturze 4 °C w celu przywrócenia integralności błon, i wiruj przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: 0,2% roztwór soli jest ośrodkiem hipotonicznym o niższym stężeniu substancji rozpuszczonych w stosunku do ośrodka wewnątrzkomórkowego erytrocytów. Kontakt z ośrodkiem hipotonicznym powoduje dyfuzję wody do wnętrza erytrocytów, co prowadzi do ich obrzęku i hemolizy. Usunięcie erytrocytów z nadsączu zostało potwierdzone obserwacją mikroskopową.</li>
	<li>Usuń nadsącz. Resuspenduj komórki w 4 mL 1x DPBS w celu usunięcia debris komórkowych, a następnie wiruj przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Na koniec resuspenduj osad komórkowy w 2 mL zimnego buforu HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa).</li>
</ol>
3. Morfologia i żywotność neutrofili (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Test wykluczania błękitu trypanu
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 5 μL zawiesiny komórkowej w 20 μL 0,4% błękitu trypanu (stosunek 1:5). Policzyć komórki w komorze Neubauera i określić żywotność komórek za pomocą testu wykluczania. Komórki, które zachowują integralność błony i nie przepuszczają barwnika, uznać za żywe.</li>
		<li>Nanieść 5 μL zawiesiny komórkowej na szkiełko; wysuszyć i barwić barwnikiem Wrighta przez 15 s. Natychmiast utrwalić próbkę buforem fosforanowym o pH 6,4 przez 30 s. Przemyć odpowiednią ilością wody destylowanej i obserwować morfologię pod mikroskopem optycznym (100x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie 7AAD i analiza cytometryczna
	<ol>
		<li>Do probówek do cytometrii przepływowej dodać 1 x 105 komórek i barwić 1 μL 7AAD w 100 μL buforu FACS (1x DPBS, 0,1% azotku sodu i 10% autologicznej plazmy pozbawionej dopełniacza) przez 15 min w 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Przemyć 500 μL buforu FACS, wirując przy 300 x g przez 10 min. Utrwalić komórki 500 μL 2% paraformaldehydu i przechowywać w 4 °C do czasu analizy w cytometrze przepływowym.</li>
		<li>W celu przygotowania kontroli komórek martwych utrwalić 1 x 105 komórek w 200 μL 4% paraformaldehydu przez 30 min, a następnie przemyć 500 μL 1x PBS przy 300 x g przez 10 min w 4 °C. Odpiwać i odrzucić nadsącz. Następnie dodać 200 μL 0,1% Triton X-100 na 1 h w 4 °C. Przemyć 500 μL 1x PBS i barwić 7AAD zgodnie z krokiem 3.2.1.</li>
		<li>Przy użyciu cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów) przeprowadzić analizę FSC względem SSC w celu oceny czystości komórek oraz SSC względem barwienia 7AAD w celu oceny żywotności komórek. Odczytać 3 x 104 zdarzeń w 100 μL objętości poboru przy średnim przepływie (1 000 komórek/s) w ustawieniach dla granulocytów (FSC, 400-490 i SSC, 300-320).</li>
		<li>Przeanalizować zgromadzone dane w oprogramowaniu cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów) i określić procent czystości oraz odsetek komórek pozytywnych dla 7AAD w populacji granulocytów, prezentując wyniki w postaci wykresów kropkowych i histogramów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie mikroorganizmów CFSE
<ol>
	<li>Do mikroprobówek o pojemności 1,5 mL należy dodać 1 x 108 bakterii lub 1 x 106 pseudohif grzybniowych, a następnie zbarwić je 200 µL 5 µM esteru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) rozpuszczonego w 1x PBS. Mieszamy przez kilka sekund i inkubujemy w 37 °C przez 10 min w ciemności.</li>
	<li>Reakcję należy zatrzymać poprzez dodanie 500 µL osocza zdekomplementowanego, a następnie wirować z prędkością 620 x g przez 10 min w przypadku pseudohif lub 1 800 x g przez 10 min w przypadku bakterii.</li>
	<li>Należy usunąć nadsącz i wypłukać osad 1 mL 1x PBS, wirując zgodnie z opisem w kroku 4.2. Na koniec mikroorganizmy należy resuspendować w 250 µL 1x PBS.</li>
	<li>W mikroprobówkach o pojemności 1,5 mL należy przygotować aliquoty o objętości 50 µL zawierające 2 x 107 bakterii (MOI: 100) lub 2 x 105 pseudohif (MOI: 1) w celu indukcji NET.</li>
</ol>
5. Indukcja NET
<ol>
	<li>Sterylne szkiełka zakrywami o wymiarach 10 mm x 10 mm umieść w płytce 24-dołkowej i pokryj 10 µL 0,001% poli-L-lizyny na 1 h w temperaturze pokojowej. Przemyj dwukrotnie 100 μL 1x PBS, wysusz na powietrzu i naświetlaj światłem UV przez 15 min.</li>
	<li>Roztwór HBSS w zawiesinie neutrofili z kroku 2.5 zastąp medium RPMI 1640 uzupełnionym o 10% osocza autologicznego. Do płytki 24-dołkowej (krok 5.1) dodaj 350 μL tej zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 105 neutrofili/dołek.</li>
	<li>Pozostaw komórki do przyczepienia do dna dołków, inkubując je przez 20 min w 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Dodaj bodźce indukujące tworzenie NET w objętości 50 µL: bodźce mikrobiologiczne – bakterie gram-dodatnie S. aureus (ATCC 25923), bakterie gram-ujemne P. aeruginosa (ATCC 10145) przy MOI 100 oraz pseudohif C. albicans (ATCC 10231) przy MOI:1; bodźce biochemiczne – PMA (200 nM) i HOCl (4,5 mM) oraz kontrolę bez bodźca (50 µL HBSS).</li>
	<li>Uzyskaj końcową objętość 400 µL na dołek. Wymieszaj na potrząsaczu do płytek przy 140 rpm przez 30 s i inkubuj przez 4 h w 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
6. Wizualizacja NETs za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Immunobarwienie DNA i LL37
	<ol>
		<li>Po indukcji NET, ostrożnie usuń pipetą nadsączki z dołków, a następnie utrwal komórki, dodając 300 µL 4% paraformaldehydu na 30 min.</li>
		<li>Przemyj komórki 200 μL 1x PBS bez wirowania, a następnie dodaj 200 µL buforu blokującego (10% osocza bezmiejscowego w 1x PBS) na 30 min.</li>
		<li>W celu barwienia na LL-37, permeabilizuj komórki, dodając 200 µL 0,2% Triton X-100 w 1x PBS na 10 min, aby umożliwić wniknięcie przeciwciała do wnętrza komórek. Przemyj 2x ostrożnie 1x PBS, aby usunąć nadmiar detergentu.</li>
		<li>Zamocuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych (cztery nakrywki na jedno szkiełko). Obarw DNA w komórkach, stosując 2 µL DAPI (patrz Tabela materiałów), zalej nakrywki specjalnym medium i przechowuj w -20 °C do czasu analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja i analiza obrazów fluorescencyjnych
	<ol>
		<li>Wykonaj zdjęcia NET w celu ilościowego oznaczenia ich składników, używając odpowiednich filtrów w konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów) i rejestrując obrazy za pomocą oprogramowania komputerowego. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że DNA jest barwione DAPI (kolor niebieski), z wzbudzeniem przy 360 nm i emisją przy 460 nm. Mikroorganizmy są barwione CFSE (kolor zielony), które ma wzbudzenie przy 492 nm i emisję przy 521 nm. Peptyd LL37 jest znakowany przeciwciałem anty-LL37 Alexa Fluor 594 (kolor czerwony), które ma wzbudzenie przy 594 nm i emisję przy 614 nm.</li>
		<li>Zkalibruj mikroskop. Umieść szkiełko i ustaw ostrość, korzystając z kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) przy włączonym świetle normalnym. Wybierz Live , aby wyświetlić obraz na monitorze.</li>
		<li>Wyłącz światło i wybierz kanał odpowiadający danemu fluorochromowi. Na przykład: filtr 365 nm/blue dla DAPI, 43 HE DsRed dla Alexa 594 lub 38 HE GFP dla CFSE.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia, korzystając z przeciwciała kontrolnego izotypowego dla LL37 oraz niebarwionych komórek dla DAPI i CFSE. Ustaw ten sam czas ekspozycji, napięcie, kontrast i parametry obiektywu, aby zarejestrować wszystkie obrazy w tych samych warunkach. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu czas ekspozycji, napięcie i kontrast ustawiono odpowiednio na 1,0 ms, 4,0 V i 0,0, przy użyciu obiektywu 40x. Wartości te mogą być dostosowane w celu uzyskania najlepszej jakości obrazu dla danej próbki.</li>
		<li>Wybierz Snap , aby zarejestrować obraz. Zapisz pięć obrazów (cztery krawędzie i środek) z każdego dołka oraz obraz kolokalizacji (merge) DNA/LL37/CFSE.</li>
		<li>Zdefiniuj trzy klasy pikseli jako tło na podstawie niezależnych obrazów każdego koloru i przeanalizuj wartość Mean Gray Signal na jednostkę powierzchni za pomocą oprogramowania Image J.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Ilościowe oznaczenie aktywności enzymatycznej
<ol>
	<li>Do płytki 96-dołkowej dodać 90 μL zawiesiny komórek w HBSS zawierającej 1 x 105 neutrofili do indukcji NET, a następnie inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Bezzwłocznie dodać 10 μL odpowiednich stymulatorów (stężenie zgodnie z krokiem 5.4) i inkubować przez 4 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Odpić nadsącz i przemyć komórki 100 μL HBSS. Potraktować stężeniem 1 U/mL DNazy przez 10 min w 37 °C, aby ułatwić uwalnianie struktur białkowo-DNA, a następnie wirować przy 1 800 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zebrać nadsącz i ocenić aktywność enzymatyczną w nadsączu za pomocą reakcji kolorymetrycznych, zgodnie z opisem White i wsp.17.</li>
	<li>Wyznaczyć maksymalną aktywność enzymatyczną NE, CG i MPO w neutrofilach w tych samych warunkach doświadczalnych, lecz bez dodawania stymulatorów indukcji NET. Następnie zamrozić próbkę komórek w temperaturze -70 °C i rozmrozić w 37 °C w łaźni wodnej, wywołując szok termiczny w celu ułatwienia uwalniania białek wewnątrzkomórkowych poprzez lizę komórek. Wirować przy 1 800 x g przez 10 min i zebrać nadsącz.</li>
	<li>Dodać 50 μL nadsączu do każdego dołka w płytkach 96-dołkowych, a następnie dodać 50 μL każdego substratu, zgodnie ze wskazówkami w kroku 7.7.</li>
	<li>Jako substrat dla NE dodać 0,5 M N-metoksysukcynylo-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroaniliny oraz 1 mM N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidu dla CG. Inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej. Dla MPO dodać 1,6 mM 3,3', 5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 50 μL roztworu zatrzymującego (0,5 M H2SO4) dla MPO i zmierzyć absorbancję przy 405 nm dla NE i CG oraz 450 nm dla MPO, używając spektrofotometru.</li>
	<li>Porównać uzyskane wartości z odpowiednimi krzywymi kalibracyjnymi i przedstawić wyniki dla każdego warunku w stosunku do maksymalnej aktywności enzymatycznej (100%).</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeanalizuj dane pomiarowe w trzech powtórzeniach dla każdego niezależnego eksperymentu (n = 10) i przeprowadź analizę ANOVA w celu analizy statystycznej poprzez porównanie grup z poziomem ufności 95%.</li>
</ol>
<img alt="Schemat frakcjonowania krwi i indukcji NET; analiza mikroskopowa i spektrofotometryczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64522/64522fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Protokół oczyszczania PMN i indukcji NET. (A) Osocze zostało usunięte z krwi obwodowej w celu uzyskania osadu erytrocytów i leukocytów, a następnie rozcieńczone 1:1 (v/v) w 1x DPBS. Następnie 4 mL rozcieńczenia dodano po ściance do probówki z gradientem podwójnej gęstości i odwirowano przy 320 x g przez 20 min w 4 °C, uzyskując rozdzielenie różnych warstw komórek i odzyskując warstwę odpowiadającą PMN. (B) Oczyszczone komórki przeliczono, a ich morfologię przeanalizowano za pomocą barwienia Wrighta. Żywotność określono metodą wykluczania błękitu trypanu oraz barwienia 7AAD z użyciem cytometrii przepływowej. Po zweryfikowaniu optymalnej czystości i żywotności neutrofili, indukowano tworzenie NET poprzez dodanie drobnoustrojów (S. aureus, P. aeruginosa i C. albicans) lub substancji chemicznych (PMA, HOCl) w płytkach 24-dołkowych w celu analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z barwieniem DAPI-DNA, przeciwciałami anty-LL37 Alexa Fluor 594 oraz barwieniem mikroorganizmów CFSE. Do ilościowego oznaczania enzymów, NET indukowano w płytkach 96-dołkowych przez 3 h i traktowano DNazą, po czym dodawano substraty dla każdego enzymu: NE, CG i MPO; zmiany barwy oznaczono spektrofotometrycznie. DPBS = fosforanowy bufor soli Dulbecco; PBMC = mononuklearne komórki krwi obwodowej; PMN = wielojądrzaste neutrofile; NE = elastaza neutrofilowa; CG = katepsyna G; MPO = mieloperoksydaza; PMA = octan mirystanu forbolu; HOCl = kwas podchlorawy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64522/64522fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).</li>
<li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways%3A+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li>
<li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+%28PMA%29+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437(2017).</li>
<li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853(2022).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81(2017).</li>
<li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+%28NET%29+induced+by+different+stimuli%3A+A+comparative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946(2019).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li>
<li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+in+wound+healing%3A+When+enough+Is+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494(2021).</li>
<li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li>
<li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li>
<li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization%2C+quantification%2C+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li>
<li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+NET+or+not+to+NET%3A+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li>
<li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Aby indukować uwalnianie NET, należy uzyskać wysoce czystą populację żywotnych neutrofili, ponieważ komórki te mają ograniczony czas życia ex vivo , wynoszący średnio 8 godzin, w którym należy przeprowadzić wszystkie eksperymenty. W tym celu idealną metodologią jest gradient podwójnej gęstości w celu optymalizacji czasu oczyszczania poprzez izolację nieaktywowanych komórek bardziej wrażliwych na stymulację egzogenną, w przeciwieństwie do gradientu Ficoll-Histopaque lub technik sedymentacji dekstranu<sup class="x...

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami w krwiobiegu, odgrywając istotną rolę podczas usuwania czynników chorobotwórczych przez kilka mechanizmów, w tym uwalnianie dużych struktur chromatyny złożonych z DNA i kilku jądrowych, cytoplazmatycznych i ziarnistych białek przeciwbakteryjnych1,2. Bezpośredni poprzednik opisujący tę przeciwdrobnoustrojową rolę neutrofili został stworzony przez Takei et al.3 w 1996 roku. Autorzy ci opisali nową formę śmierci różniącą się od apoptozy i nekroptozy u neutrofili, wykazali zmiany morfologiczne wykazujące pęknięcie jądra, a następnie rozlanie się nukleoplazmy do cytoplazmy oraz wzrost przepuszczalności błony od 3 godzin inkubacji octanem mirystynianu forbolu (PMA)2,3. Jednak dopiero w 2004 roku zaczęto używać terminu "pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET)"4.
NET zaobserwowano w różnych warunkach, takich jak bakteryjne, grzybowe5, wirusowe6, oraz infekcje pasożytnicze, do neutralizacji, zabijania i zapobiegania rozprzestrzenianiu się drobnoustrojów7. Inne badania pokazują, że może również wystąpić w warunkach niepatogennych przez sterylne bodźce, takie jak cytokiny, kwas monosodowy moczowy lub kryształy cholesterolu, autoprzeciwciała, kompleksy immunologiczne i aktywowane płytki krwi7. Lipopolisacharyd (LPS), interleukina-8 (IL-8) i PMA były jednymi z pierwszych bodźców in vitro opisanych jako induktory NET, a udział NET in vivo w procesach patogennych wykazano w dwóch modelach ostrego zapalenia: eksperymentalnej czerwonki i spontanicznego ludzkiego zapalenia wyrostka robaczkowego4. DNA jest istotnym składnikiem NET. Jego odpowiednia struktura i skład są niezbędne do sekwestracji i zabijania mikroorganizmów poprzez dostarczanie wysokiego lokalnego stężenia cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych w kierunku wychwyconych drobnoustrojów, jak wykazano za pomocą krótkiej obróbki dezoksyrybonukleazą (DNazy), która dezintegruje NET i ich właściwości bakteriobójcze4. Oprócz DNA, NET zawierają przyłączone białka, takie jak między innymi histony, elastaza neutrofilowa (NE), katepsyna G (CG), proteinaza 3, laktoferyna, żelatynaza, mieloperoksydaza (MPO) i peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), takie jak kationowy prozapalny peptyd katelicydyna LL-37 między innymi8,9. Agregaty takie mogą tworzyć większe gwinty o średnicach do 50 nm. Czynniki te mogą zakłócać mikrobiologiczne czynniki wirulencji lub integralność błony komórkowej patogenu; dodatkowo AMP mogą stabilizować DNA pochodzące z NET przed degradacją przez nukleazy bakteryjne10.
Konkretne mechanizmy regulujące powstawanie NET nie zostały jeszcze całkowicie wyjaśnione. Najlepiej scharakteryzowanym szlakiem prowadzącym do uwolnienia NET jest sygnalizacja ERK, która prowadzi do aktywacji oksydazy NADPH i produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), a także zwiększonego wewnątrzkomórkowego wapnia, który wyzwala aktywację szlaku MPO. To z kolei przekształca nadtlenek wodoru w kwas podchlorawy, aktywując NE przez utlenianie11,12. NE jest odpowiedzialny za degradację włókien aktynowych cytoszkieletu w celu zablokowania fagocytozy i translokacji ich do jądra w celu przetworzenia przez rozszczepienie proteolityczne i deaminację przez PAD4, które napędzają odczulanie włókien chromatyny, które wiążą się z ziarnistościami i białkami cytoplazmatycznymi, a następnie są uwalniane zewnątrzkomórkowo7. Proteazy te obejmują te uwalniane z kompleksu azurosomu granulek azurofilowych i innych proteaz, takich jak katepsyna G13.
W zależności od zmian morfologicznych w neutrofilach, NET dzielą się na dwa typy: samobójcze lub lityczne tworzenie NET prowadzące do śmierci komórki4, oraz żywotne lub nielityczne tworzenie NET wytwarzane przez żywotne komórki, w których pośredniczy pęcherzykowe uwalnianie jądrowego lub mitochondrialnego DNA, z pozostałością bezjądrzastego cytoplastu o zdolności fagocytarnej14,15. Ogólnie rzecz biorąc, NET złożone z mitochondrialnego DNA mają wydłużoną morfologię włókna14, podczas gdy te zbudowane z jądrowego DNA mają wygląd podobny do chmury3. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób neutrofile wybierają pochodzenie DNA. W przeciwieństwie do poprzednich badań, które opisywały kanoniczne ścieżki NET jako wymagające kilku godzin, szlak życiowy jest szybko aktywowany w ciągu zaledwie 5-60 minut15.
Pomimo tych postępów, skład NET różni się w zależności od bodźca; na przykład, różne śluzowate i nieśluzowate szczepy P. aeruginosa indukują powstawanie NET zawierających 33 powszechne białka i do 50 zmiennych białek7. W związku z tym konieczne jest ujednolicenie technik pozwalających na generowanie obiektywnych wniosków w grupach badawczych. W artykule opisano protokół z różnymi technikami, które umożliwiają porównanie i ocenę składu, struktury i morfologii NET indukowanych różnymi mikroorganizmami: Staphylococcus aureus (bakteria Gram-dodatnia), Pseudomonas aeruginosa (bakteria Gram-ujemna) i Candida albicans (grzyb), a także bodźcami chemicznymi (PMA, HOCl) u ludzkich neutrofili od zdrowych osób. Reprezentatywne wyniki wskazują na niejednorodność NET w zależności od ich bodźca indukującego w porównywalnych warunkach in vitro, charakteryzujących się barwieniem DNA-DAPI, barwieniem immunologicznym LL37 i kwantyfikacją aktywności enzymatycznej (NE, CG i MPO).

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-668981E</td><td></td></tr><tr><td>96 Płytka studzienkowa do hodowli komórkowych</td><td>Costar</td><td>3596</td><td>Mieszadło z płaskim dnem</td></tr><tr><td></td><td>CRM Globe</td><td>CRM-OS1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LL37</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166770</td><td></td></tr><tr><td>Krew probówki zbiorcze</td><td>BD VACUTAINER</td><td>368171</td><td>K2 EDTA 7,2 mg</td></tr><tr><td>Karboksyfluoresceina ester sukcynimidylowy (CFSE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hettich</td><td>1406-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Madesa</td><td>M03-CUB-22X22</td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco&#180; s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Keson</td><td>1201022</td><td></td></tr><tr><td>probówki Falcon 50 ml</td><td>Probówki</td><td></td> do cytometrii przepływowej CORNING 430829 <td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>5 ml - bez nasadek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>Analiza danych cytometrii</td><td></td> przepływowej</tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>DM 2000</td><td>LEICA</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI</td><td>Inkubator Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>UN-4750</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analizator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>Cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Fotometr</td><td>Clarkson Laboratory - CL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 1,5 ml</td><td>Zhejiang Runlab Tech</td><td>35200N</td><td>zatrzask drutowy</td></tr><tr><td>Minitab Oprogramowanie</td><td>Minitab</td><td></td><td>analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Igły</td><td>BD VACUTAINER</td><td>301746</td><td>Średnica 1,34 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>VELAB</td><td>VE-B50</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>Roztwór do gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Keson</td><td>PBL07-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane Pyrex</td><td>CORNING</td><td>CLS982025</td><td>N&#176; 9820</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x</td><td>Corning</td><td>10-104-CV</td><td>zawiera Glutagro</td></tr><tr><td>Slides</td><td>Madesa</td><td>PDI257550</td><td>22 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>Trypan Blue roztwór 0,4%</td><td>SIGMA</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrofile funkcjonują jako pierwsza linia obrony komórkowej we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, wykorzystując różne mechanizmy, takie jak tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). W badaniu przeanalizowano zmiany morfologiczne i składowe w NET wywołane bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi przy użyciu standaryzowanych metodologii in vitro do indukcji i charakterystyki NET w komórkach ludzkich. Opisane tutaj procedury pozwalają na analizę morfologii NET (litycznej lub nielitycznej) i składu (struktury DNA-białkowe i aktywność enzymatyczna) oraz wpływu czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego na takie cechy. Ponadto opisane tutaj techniki mogą być modyfikowane w celu oceny wpływu egzogennych czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego na skład NET.
Stosowane techniki obejmują oczyszczanie komórek wielojądrzastych z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu gradientu podwójnej gęstości (1,079-1,098 g/ml), gwarantując optymalną czystość i żywotność (≥ 95%), jak wykazano za pomocą barwienia Wrighta, wykluczenia błękitu trypanowego i cytometrii przepływowej, w tym analizy FSC kontra SSC i barwienia 7AAD. Tworzenie NET jest indukowane bodźcami mikrobiologicznymi (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans) i chemicznymi (octan mirystynianu forbolu, HOCl), a NET charakteryzują się barwieniem DNA-DAPI, barwieniem immunologicznym peptydu przeciwdrobnoustrojowego katelicydyny (LL37) i oznaczaniem ilościowym aktywności enzymatycznej (elastaza neutrofilowa, katepsyna G i mieloperoksydaza). Obrazy są pozyskiwane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizowane za pomocą ImageJ.

Czystość i żywotność neutrofilów 
Dynamiczne fazy komórkowe są widoczne w probówce po oczyszczaniu w podwójnym gradiencie gęstości. W obrębie tych warstw, warstwa odpowiadająca granulocytom znajduje się powyżej warstwy o gęstości 1,079 g/mL, co odróżnia ją od faz mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) oraz erytrocytów (Rycina 1A). Morfologię oczyszczonych komórek zweryfikowano za pomocą barwienia Wrighta, obserwując komórki o segmentowanych jądrach połączonych nit...

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Protokół ten pokazuje niejednorodność składu, struktury i morfologii zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, w zależności od ich bodźca indukującego w porównywalnych warunkach in vitro na ludzkich neutrofilach od zdrowych osób. Uzyskuje się wysoką czystość i żywotność neutrofili. Pozwala to na porównanie stężenia DNA, LL-37 i aktywności enzymatycznej mieloperoksydazy, elastazy i katepsyny G, uwalnianych przez zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili.Protokół ten pozwolił na analizę wpływu czynników rozpuszczalnych lub kontaktu komórkowego lub możliwych terapii lub mechanizmów zamykania produkcji NET w chorobie autoimmunologicznej. Metody te mogą pomóc w badaniu chorób autoimmunologicznych. Ze względu na niekontrolowaną reprodukcję komórek NET i czas trwania wyrównują ich składniki, które są uważane za biomarkery choroby.Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na uchwycenie obrazu NET pokazującego dyspersję DNA w połączeniu z białkiem takim jak LL37, które kolokalizuje się z mikroorganizmami, pomagając zrozumieć, w jaki sposób się pojawiają. Aby rozpocząć, wykonaj nakłucie żyły, aby zebrać 10 mililitrów krwi obwodowej w probówkach zawierających dipotasowy EDTA jako antykoagulant. Następnie wykonaj standardową biometrię krwi i test białka C-reaktywnego, aby wykluczyć infekcję lub stan zapalny, aby zapewnić jakość próbki.Odwirować próbkę krwi obwodowej w celu usunięcia osocza bogatopłytkowego, a następnie przeprowadzić drugie odwirowanie i wyrzucić pozostałe osocze. Rozcieńczyć powstały pakiet erytrocytów i leukocytów w stosunku objętościowym jeden do jednego za pomocą jednego 1X DPBS. Następnie w sterylnej szklanej probówce o pojemności 10 mililitrów najpierw umieść jeden mililitr roztworu o gęstości 1,08 grama na mililitr, a następnie jeden mililitr roztworu o gęstości 1,079 grama na mililitr.Następnie dodaj cztery mililitry rozcieńczonego pakietu erytrocytów i leukocytów, wylewając na ścianki. Wirować bez przyspieszania lub zwalniania, aby uniknąć zakłócenia gradientu. Odessać fazę odpowiadającą granulocytom i przenieść do innej sterylnej szklanej probówki o pojemności 10 mililitrów.Przemyć czterema mililitrami 1X DPBS w 300 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Aby usunąć pozostałe erytrocyty, potraktuj komórki wstrząsem osmotycznym, dodając cztery mililitry 0,2% roztworu soli fizjologicznej. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirować.Odrzucić supernatant i dodać cztery mililitry 0,65% roztworu soli fizjologicznej. Inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby przywrócić integralność błony i powtórzyć wirowanie. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach 1X DPBS, aby usunąć resztki komórkowe.Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach zimnego buforu HBSS. Aby przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanowego, rozcieńczyć pięć mikrolitrów zawiesiny komórek w 20 mikrolitrach 0,4% błękitu trypanowego. Policz komórki w nowej komorze altany i określ żywotność komórek za pomocą testu wykluczania.Następnie zamontuj 5 mikrolitrów zawiesiny ogniw na szkiełku i zabarwiaj barwnikiem Wrighta przez 15 sekund. Natychmiast utrwalić próbkę, przemyć wodą destylowaną i obserwować morfologię pod mikroskopem optycznym. Następnie dodaj jeden razy 10 do piątych komórek do probówek cytometrii przepływowej i zabarwić jednym mikrolitrem 7AAD w 100 mikrolitrach buforu FACS przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Przemyć 500 mikrolitrami buforu FACS o stężeniu 300 G przez 10 minut. Utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 2% paraformaldehydu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy cytometrii przepływowej. W celu kontroli martwych komórek utrwal komórki 200 mikrolitrami 4% paraformaldehydu przez 30 minut i przemyj 500 mikrolitrami 1XPBS przy 300 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Wyrzuć supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 0,1% Triton X-100. Inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj 500 mikrolitrami 1X PBS i zabejcuj 7AAD.Przeanalizuj przechwycone dane w oprogramowaniu cytometru przepływowego. Załaduj pliki i kliknij dwukrotnie niezabarwiony plik neutrofili. Wybierz rozproszenie do przodu lub FSC na osi X i rozproszenie boczne lub SSC na osi Y, aby wyświetlić populację komórek odpowiadającą neutrofilom.Następnie wybierz kanał B3-A:PerCP vio 700-A na osi X, aby usunąć autofluorescencję komórek i wybierz histogram na osi Y. Następnie otwórz poplamiony plik neutrofili. Wybierz FSC na osi X i SSC na osi Y, aby wyświetlić populację komórek odpowiadającą neutrofilom.Ponownie wybierz kanał B3-A:PerCP vio 700-A, aby wyznaczyć populację neutrofili dodatnich dla barwnika 7AAD. Wygeneruj ostateczny histogram, klikając okno prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję kopiuj do edytora układu. Dodaj pseudostrzępki bakteryjne lub grzybicze w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 200 mikrolitrów, czyli pięć mikromolowych CFSC w 1X PBS. Wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 500 mikrolitrów zdekomplementowanego osocza i odwirówkę.Odrzucić supernatant i przemyć osad jednym mililitrem 1XPBS z odwirowaniem. Następnie ponownie zawiesić mikroorganizmy w 250 mikrolitrach 1X PBS. Przygotuj 50 mikrolitrów podwielokrotności w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra z dwoma razy 10 do siódmej bakterii lub dwa razy 10 do piątych pseudostrzępek do indukcji NET.Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe o wymiarach 10 na 10 milimetrów w płytce 24-dołkowej. Przykryj 10 mikrolitrami 0,001% poli l-lizyny na godzinę w temperaturze pokojowej i umyj dwukrotnie 100 mikrolitrami 1X PBS. Wysuszyć na powietrzu i naświetlić światłem UV przez 15 minut.Następnie należy zastąpić roztwór HBSS przygotowanej wcześniej zawiesiny neutrofili pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% subskrypcją autologicznego osocza odgrzybionego termicznie. Dodaj 350 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do 24-dołkowej płytki, aby uzyskać końcowe stężenie dwa razy 10 do piątej neutrofili na studzienkę. Inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby komórki mogły przylgnąć do dna studzienek.Aby wywołać tworzenie się sieci, dodaj bodźce bakteryjne MOI100 i pseudostrzępki w MOI1. Dodaj również bodźce biochemiczne i przygotuj kontrolę bez bodźca, dodając 50 mikrolitrów HBSS. Uzyskać końcową objętość 400 mikrolitrów na studzienkę i mieszać na wytrząsarce płytkowej z prędkością 140 obr./min przez 30 sekund.Następnie inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po indukcji netto usunąć supernatant ze studzienek, ostrożnie pipetując i utrwalić komórki 300 mikrolitrami 4% paraformaldehydu przez 30 minut. Umyj komórki 200 mikrolitrami 1X PBS bez wirowania i dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego na 30 minut.W przypadku barwienia LL37 należy przepuścić komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,2% Triton X-100 w 1X PBS przez 10 minut i dwukrotnie przemyć 1X PBS. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych. DNA barwi komórki dwoma mikrolitrami DAPI i przechowuje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.Dynamiczne fazy komórkowe zwizualizowano po oczyszczeniu gradientem podwójnej gęstości. Typowa morfologia neutrofili została potwierdzona przez prawidłowe barwienie. Komórki wykazały również optymalną żywotność zaobserwowaną poprzez wykluczenie błękitu trypanowego bez przerwania błony.Analiza SSC w porównaniu z FSC za pomocą cytometrii przepływowej potwierdziła populację odpowiadającą PMN o wysokiej czystości komórek. Wykresy punktowe PMN dla komórek niebarwionych w porównaniu z komórkami barwionymi 7AAD i ich odpowiednimi histogramami wykazały wysoką żywotność komórek w świeżo wyizolowanych neutrofilach w porównaniu z przepuszczalnymi komórkami kontrolnymi. Po stymulacji neutrofili stymulantami chemicznymi i mikrobiologicznymi, NET zwizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu DNA DPI i anty-LL37.Mikroorganizmy zostały wstępnie wybarwione CFSE. Samobójcze tworzenie sieci wywołane PMA, na które wskazuje kolokalizacja z LL37. Podczas gdy NET utworzone za pomocą HOCI wykazywały niewielką dyspersję DNA w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, która odpowiadała tworzeniu się istotnej NET.NET indukowany przez pseudostrzępki grzybów wykazywał niskie stężenia DNA uwalnianego do przestrzeni zewnątrzkomórkowej o nitkowatych strukturach charakterystycznych dla istotnej formacji NET. S.aureus wykazywał istotną formację NET, podczas gdy P.aeruginosa indukował uwalnianie dużych stężeń DNA o mętnej morfologii, która współlokalizowała się z LL37, co wskazuje na samobójcze tworzenie NET. Zastosowanie metodologii gradientu podwójnej gęstości pozwala na uzyskanie wysokiej czystości i żywotności neutrofili.I podnosimy prania, unikamy uszkodzenia ich struktury. Podążając tą metodą, możemy przeanalizować wpływ substancji lub komórek na produkcję NET, a także to, czy są one zaangażowane w jakiś mechanizm lub ich zastosowanie jako terapie w chorobach autoimmunologicznych.

morphological-compositional-analysis-neutrophil-extracellular-traps

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę analizy morfologicznej i kompozycyjnej pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych różnymi bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi. Protokół umożliwia badanie heterogeniczności NETs w chorobach autoimmunologicznych.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi (Wideo) | JoVE Journal

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Przeglądaj więcej filmów