Name: Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę pomiaru napływu wapnia w pierwotnych limfocytach T myszy z jednoczesną oceną fenotypu powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Wielkie podziękowania dla naszych kolegów z Cytek za ciągłe dyskusje na temat pełnej analizy cytometrii spektralnej w oprogramowaniu Aurora i SpectroFlo. Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

<ol><li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation%3A+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li>
<li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+calcium+mobilization+study+%28flow+cytometry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).</li>
<li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).</li>
<li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+%28ITK%29+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+%28RLK%29+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li>
<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
<li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase%2C+Itk%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022).</li>
<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022).</li>
<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje zoptymalizowany test przeznaczony do pomiaru odpowiedzi wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T obciążonych miareczkowanym barwnikiem wskaźnikowym Indo-1 przy użyciu cytometrii przepływowejo pełnym spektrum 7,8. Zaletą wykonywania testów strumienia wapnia przy użyciu cytometrii przepływowej w pełnym spektrum jest możliwość multipleksowania markerów komórek powierzchniowych w połączeniu z oceną fluorescencji Indo-1. Cytometria przepływowa o ...

Napływ wapnia wywołany receptorem limfocytów T (TCR) jest użytecznym miernikiem aktywacji limfocytów T i jest często używany do określenia, czy populacja limfocytów T ma upośledzone odpowiedzi w proksymalnych krokach szlaku sygnałowego TCR1. Pomiary napływu wapnia są zazwyczaj wykonywane przez wstępne znakowanie limfocytów T jednym lub parą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych wapnia, a następnie badanie sygnałów fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w czasie rzeczywistym po usieciowaniu TCR2,3,4. Indo-1, barwnik wapniowy o stosunku metrycznym, jest wzbudzany przez laser UV z pikowymi emisjami na dwóch różnych długościach fal w zależności od wiązania wapnia5, i jest powszechnie stosowanym barwnikiem wskaźnikowym do analizy cytometrii przepływowej odpowiedzi wapnia w żywych limfocytach. Ponieważ profil emisji Indo-1 jest dość szeroki, połączenie oceny Indo-1 z jednoczesną analizą wielu markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej może być trudne. Ograniczenie to ogranicza wykorzystanie analizy cytometrii przepływowej odpowiedzi wapnia na wstępnie oczyszczone populacje limfocytów T lub do populacji zidentyfikowanych przez ograniczony zestaw cząsteczek na powierzchni komórki.
Aby rozwiązać problemy z pomiarem odpowiedzi wapnia w heterogenicznych populacjach pierwotnych limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej, opracowano protokół pomiaru fluorescencji Indo-1 za pomocą cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Metoda ta pozwala na multipleksowanie Indo-1 panelami przeciwciał skierowanych na cząsteczki powierzchniowe komórki, wykorzystując wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Zaletą stosowania cytometrii przepływowej o pełnym spektrum w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową jest jej zdolność do odróżniania sygnałów fluorescencyjnych od silnie nakładających się barwników, zwiększając w ten sposób liczbę markerów powierzchniowych, które można jednocześnie ocenić w każdej próbce. Konwencjonalna cytometria przepływowa wykorzystuje filtry pasmowoprzepustowe i jest ograniczona do jednego fluorochromu na system detektorów6. Cytometria przepływowa o pełnym spektrum zbiera sygnały w całym spektrum fluorochromu za pomocą 64 detektorów w systemie pięciolaserowej spektralnej cytometrii przepływowej7,8. Ponadto cytometria przepływowa o pełnym spektrum wykorzystuje detektory APD (Avalanche Photo Diode), które mają zwiększoną czułość w stosunku do detektorów fotopowielaczy obecnych w konwencjonalnych cytometrach przepływowych8. W związku z tym podejście to jest idealne dla heterogenicznych populacji komórek, takich jak komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub zawiesiny mysich wtórnych komórek narządów limfatycznych, ponieważ eliminuje potrzebę izolacji określonych populacji komórek T przed znakowaniem barwnikiem wapniowym. Zamiast tego profile ekspresji markerów powierzchniowych komórek i bramkowanie cytometrii przepływowej po zebraniu danych mogą być wykorzystane do oceny odpowiedzi wapnia w każdej populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Jak wykazano w tym raporcie, Indo-1 można łatwo połączyć z ośmioma przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem, co daje w sumie 10 unikalnych sygnatur spektralnych. Co więcej, metoda ta może być łatwo zastosowana do mieszanin komórek z genetycznie odmiennych linii myszy, co pozwala na jednoczesną analizę odpowiedzi wapnia w limfocytach T typu dzikiego w porównaniu z komórkami z linii myszy ukierunkowanej na gen.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowe płytki z powłoką TC</td><td>Cell Treat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowy</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>50 ml polipropylenowe probówki wirówkowe z nasadką</td></tr><tr><td>5 ml probówki przepływowe z poliodoru</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>5 ml Strzykawka BD</td><td>309646</td><td>tylko tłokiem jest używana</td></tr><tr><td>Filtr 70uM</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC Bufor do lizy</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Przepływocytometr spektralny</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do kąpieli</td><td>coleparmer</td><td>Pozycja # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramer APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Formalne naukowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>narzędzia do preparacji Kleszcze</td><td>McKesson</td><td>#487593</td><td>Kleszcze do tkanek McKesson Adson 4-3/4 cala długości Klasa biurowa Niesterylny nieblokujący uchwyt kciuka ze stali nierdzewnej 1 x 2 zęby</td></tr><tr><td>Narzędzia do preparowania Nożyczki</td><td>McKesson</td><td>#970135</td><td>Nożyczki operacyjne McKesson Argent&trade; 4-1/2-calowy chirurgiczny uchwyt pierścieniowy ze stali nierdzewnej Prosta ostra końcówka / Ostra końcówka</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Hyclond</td><td>SH30071.03</td><td>lot AE29165301</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-AM Ester Dye</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>Barwnik ładujący wapń&nbsp;</td></tr><tr><td>jonomycyna</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy duch 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-mysz CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC Block</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>&nbsp;+ czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>RPMI bez fenoli</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&nbsp;-czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gamma;/&delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet odczynników Vi-Cell Blu Nr</td><td></td><td>produktu: C06019</td><td>Zawiera suchą</td></tr> kąpiel <tr><td></td><td></td>Tripan<td></td><td></td></tr> <tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr> Waterbath marki Fisher</tbody></table>

analiza indukowanego przez receptor limfocytów t napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach t za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Napływ wapnia w odpowiedzi na stymulację receptora limfocytów T jest powszechną miarą sygnalizacji komórek T. Opracowano kilka barwników wskaźnikowych wapnia do oceny sygnalizacji wapniowej za pomocą cytometrii przepływowej pasmowo-przepustowej. Protokół ten ma na celu pomiar odpowiedzi wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T przy użyciu cytometrii przepływowej o pełnym spektrum. Całkowite splenocyty są znakowane ratiometrycznym barwnikiem wskaźnikowym wapnia Indo-1 wraz z panelem przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do cząsteczek na powierzchni komórki. Wykorzystanie możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum stanowi platformę do wykorzystania szerokiej gamy barwień powierzchni komórek w połączeniu z Indo-1. Komórki są następnie analizowane w czasie rzeczywistym w temperaturze 37 °C przed i po dodaniu przeciwciała anty-CD3 w celu stymulacji receptora limfocytów T. Po rozmieszaniu sygnałów spektralnych oblicza się stosunek Indo-1 związanego z wapniem do bezwapniowego i można go wizualizować w czasie dla każdej bramkowanej populacji splenocytów. Technika ta może pozwolić na jednoczesną analizę odpowiedzi wapnia w wielu populacjach komórek.

Schemat doświadczalny oceny odpowiedzi wapniowej w pierwotnych limfocytach T myszy z wykorzystaniem ratiometrycznego barwnika Indo-1 oraz multipleksowego barwienia powierzchniowego przedstawiono na Rysunku 1. Po pobraniu i przetworzeniu splenocytów mysich do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, komórki barwi się estrem Indo-1 AM oraz przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami w celu barwienia powierzchniowego. Po zakończeniu ładowania barwnika i barwienia przeciwciałami, próbki limfocytó...

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Protokół umożliwia badaczom jednoczesny pomiar odpowiedzi wapnia w pierwotnych limfocytach T wraz z oceną ich podzbioru i fenotypu powierzchniowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uniknąć konieczności izolowania określonych podzbiorów komórek przed zbadaniem ich odpowiedzi na wapń. Na początek przygotuj jeden mikrogram na mikrolitr roztworu podstawowego Indo-1 AM, dodając 50 mikrolitrów DMSO do fiolki zawierającej 50 mikrogramów Indo-1 AM. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do odpowiedniej objętości cRPMI i stężeniu sześciu mikrogramów na mililitr.Umieść pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj tego podłoża do rozcieńczenia wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać od pięciu do 6 milionów komórek na mililitr. Następnie, do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek na studzienkę na warunki eksperymentalne.Przygotować pojedynczą barwioną próbkę kontrolną dla Indo-1 wolnego od wapnia, dodając EGTA do komórek obciążonych barwnikiem Indo-1. Przygotować studzienkę do biologicznej kontroli ujemnej bez fluoroforów i barwnika Indo-1. Przygotować kontrolę pozytywną Indo-1, dodając jonomycynę o stężeniu 50 mikromoli do zawiesiny komórek obciążonej barwnikiem na cytometrze przepływowym.Przygotuj również studzienkę do kontroli pojedynczego barwienia dla dodatkowych populacji komórek za pomocą fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami. Następnie dodać dwa mikrogramy przeciwciała blokującego receptor FC na milion komórek i inkubować płytkę przez 45 minut, stukając co 15 minut w celu ponownego zawieszenia komórek. Po inkubacji wymieszaj i usuń całą objętość komórek z płytki i dodaj ją do 1,7 mililitrowych probówek wirówkowych.Odwirować i zdekantować supernatant. Po umyciu komórek jednym mililitrem wstępnie podgrzanego cRPMI, ponownie osadzać i dekantować supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze cRPMI i inkubować każdą probówkę, pozostawiając górną część probówki lekko otwartą na wymianę gazową, umożliwiając całkowitą deestryfikację wewnątrzkomórkowych estrów AM.Następnie przygotuj główną mieszankę wszystkich zdefiniowanych przez użytkownika przeciwciał sprzężonych z fluorochromem i dodaj ją do komórek spoczynkowych na jeden mililitr objętości komórki. Po odpoczynku rozpuść ogniwa i umyj osad, ponownie zawieszając w jednym mililitrze cRPMI schłodzonym do czterech stopni Celsjusza. Powtórz ten krok i umieść rurki na lodzie.Zawiesić poszczególne próbki w 500 mikrolitrach cRPMI bez czerwieni fenolowej za pomocą pięciomililitrowej rurki przepływowej z polistyrenu z nakrętką. Aby utrzymać temperaturę za pomocą analizy strumienia wapnia, przygotuj kąpiel perełkową, dodając kulki do kąpieli do małej łaźni wodnej i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie przetnij 50-mililitrową tubkę kroniki na pół i wyrzuć górną część tuby.Napełnij trzy czwarte pozostałej rurki kulkami do kąpieli i pozwól jej osiągnąć 37 stopni Celsjusza w kąpieli perełkowej. Umieść wannę perełkową w pobliżu cytometru przepływowego wraz ze styropianowym stojakiem, aby ustawić rurkę. Przed analizą na cytometrze przepływowym należy ogrzać probówki pojedynczo do 37 stopni Celsjusza przez siedem minut.Zaloguj się do oprogramowania cytometru przepływowego i kliknij kartę Biblioteka. Następnie wybierz znaczniki fluorescencyjne, aby dodać Indo-1 związany z wapniem i Indo-1 wolny od wapnia. Następnie wybierz Laser UV w grupach znaczników fluorescencyjnych i kliknij dodaj, aby dodać nazwę znacznika fluorescencyjnego.Wybierz długość fali wzbudzenia i emisji lasera, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Przejdź do konfiguracji eksperymentalnej. Kliknij zakładkę Akwizycja, otwórz/Utwórz nowy eksperyment i dodaj do niego żądane znaczniki fluorescencyjne.Utwórz grupę odniesienia i nową grupę próbki dla eksperymentu, a następnie oznacz obie grupy. Na karcie Przejęcia ustaw zdarzenia do nagrywania na maksimum na 10 milionów, zatrzymanie głośności do maksymalnej objętości 3000 mikrolitrów i czas zatrzymania na maksimum 36 000 sekund. Uzyskaj pojedyncze barwione kontrole dla zdefiniowanych przez użytkownika sprzężonych przeciwciał zawartych w panelu wielokolorowym oraz dla barwnika funkcjonalnego Indo-1.Dodaj 50 mikromoli jonomycyny do związanej z wapniem kontroli pozytywnej Indo-1 i wiru. Dodaj rurkę przepływową do płytki iniekcyjnej próbki i kliknij przycisk Nagraj. Następnie dodaj bezwapniową kontrolę ujemną Indo-1 do cytometru przepływowego i kliknij Nagraj.Rozmieszaj pojedyncze poplamione kontrolki, klikając przycisk Rozmieszaj. Po zakończeniu wymieszania utwórz wykresy sekwencyjne za pomocą niezmieszanego arkusza roboczego, takiego jak SSC-A kontra FSC-A do usuwania zanieczyszczeń z próbki i SSC-A do usuwania dubletów. Następnie utwórz bramy, klikając Działka.Dodaj wykres do arkusza roboczego i kliknij dwukrotnie wewnątrz bramy, aby utworzyć podrzędną populację bramkowaną. Kontynuuj, aż wszystkie populacje będące przedmiotem zainteresowania zostaną uwzględnione. Następnie należy podgrzać wcześniej przygotowane pojedyncze barwione próbki kontrolne do 37 stopni Celsjusza w celu analizy sekwencyjnej.Zainstaluj oprogramowanie do cytometrii przepływowej i uruchom DI w lodowatej wodzie na dwie do trzech minut, aby zapewnić stabilność płynną cytometru przepływowego. Skonfiguruj wykresy sekwencyjne w niemieszanym arkuszu, tworząc bramki za pomocą przycisków bramki wielokąta, prostokąta lub elipsy, aby uwzględnić interesującą populację. Kliknij dwukrotnie wewnątrz bramki i zmień parametry osi y i x na SSC-A lub SSC-H.Zakończ definiowanie parametrów osi, klikając ją lewym przyciskiem myszy. Utwórz wykres z sygnałem barwnika SSC-A w porównaniu z żywotnością. Bramka żywych komórek, które są ujemne pod względem barwienia barwnikiem aminowym.Żywe komórki ujemne dla barwienia żywych żywych zmarłych będą skupiać się na znaku zerowym zarówno na osi y, jak i x. Kliknij dwukrotnie wykres wewnętrzny, aby utworzyć nowy wykres zawierający tylko żywe limfocyty z pojedynczych komórek. Zmień oś Y na Indo-1 w funkcji czasu na osi x, aby zobrazować napływ wapnia.Następnie umieść podgrzaną próbkę biologiczną w SIT maszyny. Próbki należy badać z prędkością od 2 500 do 3000 zdarzeń na sekundę przy średnim natężeniu przepływu, aby uwidocznić napływ wapnia w ograniczonej liczbie populacji komórek. Dodaj następną rurkę do kąpieli perełkowej w kontroli pozyskiwania.Naciśnij przycisk Nagrywaj, aby rejestrować dane początkowe przez 30 sekund w celu uzyskania podstawowego poziomu sygnalizacji wapnia w próbce. Następnie kliknij Stop i wyjmij probówkę z portu wtrysku próbki. Dodać 30 mikrogramów niesprzężonego anty-CD3 bezpośrednio do probówki z próbką, aby zainicjować napływ wapnia.Szybko umieść probówkę z powrotem w porcie wstrzykiwania próbki i naciśnij przycisk Nagraj w oprogramowaniu. Rejestruj dane przez siedem minut, obserwując czas, który upłynął pod kontrolą akwizycji w oprogramowaniu. Następnie naciśnij Stop w oprogramowaniu.Dodaj jeden mikrogram na mililitr jonomycyny i nagrywaj przez 30 sekund, aby uzyskać maksymalny sygnał wapnia w interesujących komórkach. Przejdź do następnej próbki i powtarzaj proces pracy, aż wszystkie próbki zostaną zebrane. Zapisz eksperyment i kliknij plik zip eksportu.Niezmieszane pliki są przesyłane do zewnętrznego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Stabilny, spójny sygnał na wykresie czasu w funkcji rozrzutu bocznego wskazywał na stabilność płynu. Populacja limfocytów została bramkowana, a następnie rozróżniona podkoszulki na wykresie wysokości rozrzutu bocznego w funkcji powierzchni.Podkoszulki oceniono pod kątem żywotności. Następnie zastosowano bramkowanie w populacji CD19-ujemnej. Te podzbiory limfocytów T oceniano za pomocą przeciwciał przeciwko CD4 i CD8, wizualizując fluorescencję Indo-1 związaną z wapniem w czasie.W poszczególnych populacjach komórek wykres Indo-1 związanego z wapniem w funkcji czasu wykazał linię wyjściową przed stymulacją. Szczytowa odpowiedź, gdy wewnątrzkomórkowy poziom wapnia spadł, a odpowiedź wapniowa została wywołana przez dodanie jonomycyny. Przed dodaniem przeciwciała anty-CD3 wykryto słaby sygnał Indo-1 związany z wapniem.Podczas szczytowej odpowiedzi komórki wykazywały silny sygnał Indo-1 związany z wapniem i redukował Indo-1 wolny od wapnia. Pięć minut po szczycie fluorescencja Indo-1 prawie powróciła do wartości wyjściowej. Po dodaniu jonomycyny uwidoczniono silny sygnał Indo-1 związanego z wapniem, co wskazuje na odpowiednie obciążenie komórek barwnikiem.Analizę rzadkich populacji przeprowadzono poprzez wykreślenie Indo-1 związanego z wapniem w porównaniu z Indo-1 bez wapnia po bramkowaniu na każdej interesującej populacji. I analiza odpowiedzi wapnia w całym przebiegu czasowym dla każdego podzbioru. Strumień wapnia przy użyciu profilowania w pełnym spektrum może prowadzić do analizy cytometrycznej przepływowej o wysokich parametrach w różnych podzbiorach immunologicznych.Analiza wysokowymiarowa do bezstronnego grupowania podzbiorów limfocytów T może być stosowana w połączeniu z cytometrią przepływową o wysokich parametrach do zaawansowanej analizy. Technika ta została opracowana do analizy wielu podzbiorów immunologicznych w połączeniu ze sobą w próbce zbiorczej.

analysis-t-cell-receptor-induced-calcium-influx-primary-murine-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Ten film prezentuje ocenę aktywacji limfocytów B poprzez wykorzystanie antygenowych liposomów. Limfocyty B potraktowane wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 rozróżnia się za pomocą cytometrii przepływowej i analizuje się ich stosunek fluorescencji fioletowej do niebieskiej. Gdy komórki napotykają liposomy antygenowe, wyzwala to aktywację limfocytów B poprzez napływ wapnia, stopniowo zwiększając z czasem stosunek sygnału fluorescencji fioletowej do niebieskiej.

Monitorowanie aktywacji limfocytów B za pomocą liposomów antygenowych przy użyciu testu strumienia wapnia

Ten film analizuje indukowany przez receptory limfocytów T napływ wapnia do komórek T. Przeciwciała anty-CD3 aktywują szlaki sygnałowe limfocytów T, co prowadzi do wzrostu wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, które wiążą się z barwnikiem Indo-1. W cytometrii przepływowej przesunięcie widma ze stanu wolnego od wapnia do stanu związanego z wapniem koreluje z napływem wapnia wywołanym przez receptor komórek T.

Ocena napływu wapnia indukowanego przez receptor limfocytów T za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Poznaj metodę pomiaru napływu wapnia w pierwotnych limfocytach T myszy z jednoczesną oceną fenotypu powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum (Wideo) | JoVE Journal

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Przeglądaj więcej filmów