Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg
17 lutego 2023
Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.
Ten konfokalny protokół mikroskopowy pozwoli na interpretację zachowania ekologicznego i adaptacji mikroalg z ekstremalnych środowisk o powolnym wzroście w laboratorium przy użyciu autofluorescencji ich pigmentów. Technika ta nie jest inwazyjna i minimalizuje artefakty, ponieważ nie stosuje się związków chemicznych. Znajomość właściwości pigmentów autotrofów i odpowiadającego im wzrostu pozwoli na zaprojektowanie metod kontroli, które cieszą się największym zainteresowaniem w przypadku jaskiń turystycznych i zabytków architektury.
Przygotowanie inokulum Chroothece mobilis należy rozpocząć od przeniesienia go z kultury agarowej do pożywki z wodą morską lub płynnej pożywki SWES. Utrzymuj wszystkie kultury przez dwa tygodnie z 16 do 8 jasnym ciemnym okresem fotograficznym w temperaturze 20 stopni Celsjusza przy niskim natężeniu białego światła i bez wstrząsania, aż do uzyskania pożądanej gęstości komórek. Użyj jednego mililitra kultury fazy wykładniczej o gęstości komórek pięć razy 10 do trzeciej na mililitr komórek, aby zaszczepić na 24-dołkowej płytce do różnych eksperymentów.
Aby odtworzyć monochromatyczny efekt świetlny, należy użyć zielonego filtra przepuszczającego zielone światło od 470 do 570 nanometrów ze szczytem na długości fali 506 nanometrów oraz do światła czerwonego dostosowanego za pomocą filtra między 590 a 720 nanometrów i szczytem przy 678 nanometrach. Wystaw kultury komórkowe na działanie tego światła przez dwa tygodnie. Włącz wszystkie elementy odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, w tym laser.
Zamontuj komórki w pożywce wzrostowej SWES z każdej studzienki doświadczalnej 24-dołkowej płytki do 35-milimetrowego szklanego dna w celu obrazowania. Wybierz aperturę numeryczną 63X lub 1.30 lub obiektyw zanurzeniowy z glicerolem NA i umieść glicerol na obiektywie. Następnie umieść płytkę studzienki na stoliku mikroskopu, upewniając się, że próbka nie porusza się podczas akwizycji obrazu.
Wyśrodkuj próbkę na ścieżce światła i skup się na środku komórki, wybierając płaszczyznę o największej intensywności fluorescencji. Po zakończeniu otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz lambda XY z listy rozwijanej w trybie akwizycji. Wybierz linię wzbudzenia lasera 561 nanometrów, osiem bitów zakresu dynamicznego i 1024 na 1024 piksele.
Zbierz widma emisji fluorescencji w paśmie 10 nanometrów i wielkość kroku lambda wynoszącą cztery nanometry w zakresie od 570 do 760 nanometrów. Ustaw otwór na jednej jednostce powietrznej i uruchom akwizycję skanowania lambda. Po powtórzeniu tego procesu w różnych polach widzenia i w różnych warunkach czerwonych i zielonych świateł, zapisz wszystkie dane.
Po uzyskaniu skanu lambda należy kliknąć na okno kwantyfikacji w górnej części oprogramowania, aby ocenić zebrane widma emisji fluorescencji. Przejdź do otwartego okna projektu i wybierz jeden plik lambda XY. Wybierz analizę profilu warstwowego w oprogramowaniu do obrazowania i zdefiniuj obszar zainteresowania o powierzchni czterech mikrometrów kwadratowych w środku komórki, aby przeanalizować średnią intensywność fluorescencji.
Wyeksportuj dane i plik CSV przed powtórzeniem procesu z różnymi komórkami w różnych warunkach. Następnie otwórz pliki CSV, aby wybrać różne piki emisji fluorescencji we wszystkich mierzonych obszarach zainteresowania, wybierając maksymalne dane fluorescencji fikoerytryny, fikocyjaniliny, C. fikocyjaniny, allofikocyjaniny i chlorofilu A odpowiednio w pliku CSV. Po zakończeniu utwórz nową tabelę ze wszystkimi maksymalnymi wartościami fluorescencji uzyskanymi z każdego piku fikobiliproteiny i chlorofilu i wykreśl dane na wykresie.
Zaobserwowano istotne różnice w średnim natężeniu fluorescencji. Średnia intensywność fluorescencji fikoerytryny fikocyjanobiliny znacznie się zmniejszyła, gdy komórki były wystawione na monochromatyczne światło zielone. Natomiast w świetle czerwonym nie zaobserwowano różnicy w porównaniu z kontrolą.
Zielone światło miało odwrotny wpływ na allofikocyjaninę i chlorofil A, w których średnia intensywność fluorescencji znacznie wzrosła w wyniku adaptacji kompleksów antenowych m.in. ze względu na zwiększoną ilość lub poprawę łączności kompleksów antenowych. Czerwone światło spowodowało nieznaczny wzrost fluorescencji allofikocyjaniny i chlorofilu. Aby zbadać wpływ różnych warunków wzrostu na komórki w hodowli, ważne jest, aby wykonywać pomiary przy dokładnie tych samych ustawieniach mikroskopu.
Możliwa jest analiza innych parametrów środowiskowych istotnych dla hodowli organizmów autofluorescencyjnych, a także sygnału fluorescencji w widmie widzialnym. Ta technika jest bardzo potężnym podejściem do badania organizmów żywych za pomocą kilku pigmentów autofluorescencyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje nieniszczącą metodę oceny zmian w fykobiliproteinach w czerwonowachach za pomocą autofluorescencyjnego obrazowania. Jest on szczególnie przydatny do badania adaptacji komórkowych w ekstremalnych środowiskach, gdzie tradycyjne metody hodowania są trudne.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Ekologia
Tło
- Mikroalgi często zamieszkują ekstremalne środowiska.
- Tradycyjne metody hodowli laboratoryjnej mogą być nieskuteczne.
- Autofluorescencyjne obrazowanie zapewnia analizę bez stosowania markerów.
- Ta technika minimalizuje artefakty poprzez unikanie związków chemicznych.
Cel badania
- Analiza zachowania ekologicznego mikroalg.
- Zrozumienie adaptacji do ekstremalnych siedlisk.
- Rozwój metod monitorowania wydajności autotrofów.
Stosowane metody
- Przygotowanie inokulum z hodowli na agarze do pożywki morskiej.
- Utrzymanie kultur w specyficznych warunkach świetlnych i temperaturowych.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej do obrazowania.
- Ocena autofluorescencji pigmentów w celu analizy.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie fykobiliprotein w czerwonowachach.
- Wgląd w ekologiczne adaptacje mikroalg.
- Wykazanie skuteczności technik nieinwazyjnych.
- Potencjalne zastosowania w monitorowaniu środowisk, takich jak jaskinie turystyczne.
Wnioski
- Autofluorescencyjne obrazowanie jest cennym narzędziem do badania mikroalg.
- Ta metoda może pomóc w zrozumieniu dynamiki ekologicznej.
- Otwiera możliwości dalszych badań w ekstremalnych środowiskach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Autofluorescence imaging of red algae pigments enables non-invasive, quantitative assessment of photosynthetic adaptation under variable light conditions, supporting early-stage discovery in photosynthetic organism research. This approach is particularly valuable for evaluating physiological responses in slow-growing or extreme-environment strains, where traditional culturing is impractical. The method enhances predictive confidence in selecting and optimizing model systems for biopharma R&D pipelines focused on photosynthetic biology and pigment-based functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of pigment adaptation mechanisms at the cellular level.
- Supports functional validation of photosynthetic targets under controlled light conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying pigment responses to environmental variables.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible fluorescence readouts for assay development.
- Allows preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
- Enables quantitative comparison of pigment responses across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pigment adaptation data with environmental relevance for translational model selection.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in photosynthetic research.
- Reduces risk in advancing slow-growing or extreme-environment strains for further study.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for photosynthetic organism research, enabling robust hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies pigment adaptation to light, clarifying photosynthetic pathway responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides emission spectra and intensity data for statistical comparison of experimental variables.
- Translational Research: Informs model selection for studies in environmentally relevant or extreme conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, non-destructive platform for pigment-based physiological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pigment function and adaptation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for advancing photosynthetic models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of slow-growing or extreme-environment strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and spectral analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of microscope settings for cross-condition comparability.
- May require adaptation for different pigment profiles or organism types.
- Limited to organisms with detectable autofluorescent pigments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Sample Preparation for Reproducing Monochromatic Light Effect
1:50
Autofluorescence Imaging
3:16
Parameters to Evaluate Chroothece’s Physiology
4:21
Results: Autofluorescence Imaging and Evaluation of Phycobiliprotein Changes in Red Algae Based on Spectral Analysis
5:08
Conclusion
