Name: Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj projektowanie cyfrowych obwodów genowych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem systemów CRISPR-dCas i białek anty-CRISPR. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej w biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować wszystkim studentom laboratorium Biologii Syntetycznej - SPST, TJU - za ich ogólną pomoc, a także Zhi Li i Xiangyang Zhang za ich pomoc w eksperymentach FACS.

<ol><li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).</li>
<li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Institute+of+Electrical+Engineers%22%5BJournal%5D)">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li>
<li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+finger+tools%3A+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li>
<li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459(2017).</li>
<li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194(2019).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bare+dSpCas9%2C+scaffold+gRNA%2C+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li>
<li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning.+Fourth+edition%22">Molecular Cloning. Fourth edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li>
<li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19(2016).</li>
<li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li>
<li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li>
<li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flowCore%3A+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106(2009).</li>
<li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11(2018).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół pokazał możliwy kompletny przepływ pracy dla obwodów cyfrowych syntetycznych genów, zgodnie z cyklem inżynierii biologicznej "Zaprojektuj-zbuduj-Testuj-Naucz się" (DBTL) i dotyczy zarówno eksperymentów w laboratorium suchym, jak i mokrym. W tym przypadku skupiliśmy się na systemie CRISPR-Cas, głównie dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a i odpowiednich białkach anty-CRISPR, projektując i budując w S. cerevisiae małe sieci transkrypcyjne. Niektóre z nich naśladowały bramki Boole'a, które są podstawowymi elemen...

W 2011 roku badacze zaproponowali metodę obliczeniową i opracowali odpowiadające jej oprogramowanie do automatycznego projektowania cyfrowych syntetycznych obwodów genetycznych1. Użytkownik musiał określić liczbę wejść (trzy lub cztery) i wypełnić tabelę prawdy obwodu; dostarczyło to wszystkich niezbędnych informacji do wyprowadzenia struktury obwodu przy użyciu technik z zakresu elektroniki. Tabela prawdy została przetłumaczona na dwa wzory Boole'a via metodą map Karnaugh2. Każdy wzór Boole'a składa się z klauzul opisujących operacje logiczne (sumę lub mnożenie) pomiędzy (częścią) wejść obwodu a ich negacjami (literałami). Klauzule z kolei są albo sumowane (OR), albo mnożone (AND) w celu obliczenia wyjścia obwodu. Każdy obwód może zostać zrealizowany zgodnie z każdym z dwóch odpowiadających mu wzorów: jednym zapisanym w formie POS (iloczyn sum) oraz drugim w reprezentacji SOP (suma iloczynów). Pierwszy składa się z mnożenia klauzul (tj. bramek Boole'a), które zawierają sumę logiczną literałów. Drugi natomiast jest sumą klauzul, w których literały są mnożone.
Obwody elektryczne można zrealizować na płytce stykowej poprzez fizyczne połączenie różnych bramek przewodami. Prąd elektryczny umożliwia wymianę sygnałów pomiędzy bramkami, co prowadzi do obliczenia wartości wyjściowej.
W biologii sytuacja jest bardziej złożona. Bramkę logiczną (Boolean gate) można zrealizować jako jednostkę transkrypcyjną (TU; tzn. sekwencję „promotor-region kodujący-terminator” w komórkach eukariotycznych), w której regulowana jest transkrypcja lub translacja (lub obie te czynności). W ten sposób co najmniej dwa rodzaje cząsteczek tworzą biologiczne połączenia: białka czynników transkrypcyjnych oraz niekodujące RNA antysensowne1.
Cyfrowy obwód genowy składa się z dwóch lub trzech warstw bramek, mianowicie: 1) warstwy wejściowej, która składa się z bramek YES (bufora) i NOT i przekształca substancje chemiczne wejściowe w cząsteczki łączące; 2) warstwy wewnętrznej, która składa się z takiej liczby jednostek transkrypcyjnych (TU), jaka odpowiada liczbie klauzul w odpowiedniej formule Boole'a. Jeśli obwód jest zaprojektowany zgodnie z formułą sumy produktów (SOP), każda klauzula w warstwie wewnętrznej będzie generować sygnał wyjściowy obwodu (np. fluorescencję) w tzw. rozproszonej architekturze wyjściowej. W przypadku zastosowania formuły produktu sum (POS) wymagana jest 3) warstwa końcowa, która zawiera pojedynczą bramkę mnożącą zbierającą cząsteczki łączące z warstwy wewnętrznej.
Ogólnie rzecz biorąc, w biologii syntetycznej dla tego samego obwodu można zaprojektować wiele różnych schematów. Różnią się one liczbą i rodzajem zarówno jednostek transkrypcyjnych (TU), jak i cząsteczek łączących. Aby wybrać najprostsze rozwiązanie do implementacji w komórkach drożdży, każdemu projektowi obwodu przypisuje się wskaźnik złożoności S, zdefiniowany jako
<img alt="Równanie stanu równowagi statycznej: \( S = 2^{A-1} + 2^{R-1} + a \); schemat formuły." src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">
gdzie A oznacza liczbę aktywatorów, R oznacza liczbę represorów, a a jest ilością cząsteczek RNA antysensownego. Jeśli w obwodzie brakuje aktywatorów lub represorów, ich wkład w S wynosi zero. W związku z tym trudniej jest zrealizować schemat obwodu w laboratorium (wysokie S), gdy wymaga on dużej liczby ortogonalnych czynników transkrypcyjnych. Oznacza to, że w celu realizacji pełnego okablowania wewnątrz obwodów cyfrowych należy zaprojektować nowe aktywatory i represory de novo. W zasadzie nowe białka wiążące DNA mogą zostać zmontowane, wykorzystując białka z motywem palca cynkowego3 oraz efektory TAL4 jako matryce. Jednak opcja ta wydaje się zbyt żmudna i czasochłonna; dlatego w celu sfinalizowania złożonych obwodów genowych należy polegać głównie na małych cząsteczkach RNA i regulacji translacji.
Pierwotnie metoda ta została opracowana do tworzenia obwodów cyfrowych w bakteriach. Rzeczywiście, w komórkach eukariotycznych, zamiast o RNA antysensownym, bardziej zasadne jest mówienie o mikroRNA (miRNA) lub krótkich interferujących RNA (siRNA)5. Jednak ścieżka RNAi nie występuje w drożdżach S. cerevisiae. W związku z tym należy zdecydować się na sieci w pełni transkrypcyjne. Przyjmijmy, że obwód wymaga pięciu aktywatorów i pięciu represorów; jego wskaźnik złożoności wynosiłby S = 32. Złożoność obwodu można zmniejszyć, zastępując 10 czynników transkrypcyjnych pojedynczym dCas96 (Cas9 pozbawionym aktywności nukleazowej) połączonym z domeną aktywującą (AD). Jak pokazano w7, dCas9-AD działa jako represor w drożdżach, gdy wiąże się z promotorem pomiędzy skrzynką TATA a TSS (miejscem rozpoczęcia transkrypcji), oraz jako aktywator, gdy wiąże się daleko powyżej skrzynki TATA. Zatem 10 czynników transkrypcyjnych można zastąpić jednym białkiem fuzyjnym dCas9-AD oraz 10 sgRNA (pojedynczymi RNA przewodnimi), co daje całkowity wskaźnik złożoności S = 11. Synteza dziesięciu sgRNA jest szybka i łatwa, podczas gdy, jak wspomniano wcześniej, montaż 10 białek wymagałby znacznie dłuższej i bardziej skomplikowanej pracy.
Alternatywnie można wykorzystać dwa ortogonalne białka dCas (np. dCas9 i dCas12a): jedno do fuzji z AD, a drugie w formie wolnej lub w połączeniu z domeną represyjną. Wskaźnik złożoności wzrósłby wówczas jedynie o jedną jednostkę (S = 12). Zatem systemy CRISPR-dCas stanowią klucz do konstruowania bardzo skomplikowanych cyfrowych obwodów genowych w S. cerevisiae.
Niniejsza praca szczegółowo charakteryzuje wydajność represorów i aktywatorów opartych zarówno na dCas9, jak i dCas12a w drożdżach. Wyniki wykazują, że nie wymagają one dużej ilości sgRNA do optymalizacji swojej aktywności, dlatego preferowane jest unikanie plazmidów episomalnych. Co więcej, aktywatory oparte na dCas9 są znacznie skuteczniejsze przy użyciu rusztowania RNA (scRNA), które rekrutuje kopie domeny aktywacyjnej VP64 AD. W przeciwieństwie do tego, dCas12a działa dobrze po bezpośrednim połączeniu z silną domeną VPR AD. Ponadto syntetyczny aktywowany promotor wymaga zmiennej liczby miejsc docelowych, w zależności od konfiguracji aktywatora (np. trzech w przypadku dCas12a-VPR, sześciu dla dCas9-VP64 i tylko jednego przy użyciu dCas9 oraz scRNA). Jako represor dCas12a wydaje się być bardziej skutecznym, gdy wiąże się z regionem kodującym, a nie z promotorem.
Wadą jest jednak fakt, że układy CRISPR-dCas9/dCas12a nie oddziałują bezpośrednio z substancjami chemicznymi. W związku z tym mogą one być bezużyteczne w warstwie wejściowej. Z tego powodu badano alternatywne projekty bramek Booleanowskich zawierające białka anty-CRISPR (Acrs). Białka Acrs oddziałują na białka (d)Cas i hamują ich działanie8. Stanowią one zatem środek do modulowania aktywności systemów CRISPR-(d)Cas. Niniejsza praca szczegółowo analizuje oddziaływania między Acrs typu II a (d)Cas9, a także między Acrs typu V a (d)Cas12a w S. cerevisiae. Ponieważ białka Acrs są znacznie mniejsze od białek Cas, zbudowano bramkę NOT reagującą na estrogen β-estradiol poprzez fuzję domeny wiążącej hormon ludzkiego receptora estrogenowego9-HBD(hER)-z AcrIIA4. Ponadto zrealizowano kilka bramek YES i NOT, w których dCas12a(-AD) była wyrażana konstytutywnie, a AcrVAs po indukcji galaktozą. Obecnie bramki te służą jedynie jako dowód koncepcji. Stanowią one jednak również pierwszy krok w stronę głębokiego przemyślenia algorytmu służącego do komputerowego, automatycznego projektowania syntetycznych cyfrowych obwodów genowych w komórkach drożdży.

<table><tbody><tr><td>0,1 ml probówki do PCR 8-paskowe</td><td>NEST</td><td>403112</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml probówki do PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroprobówki</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Mikroprobówki</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza-klasa biologii molekularnej</td><td>Invitrogen</td><td>75510-019</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Applied biosystems veriti 96-dołkowy termocykler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA AxyPrep</td><td>Axygen</td><td>AP-GX-250</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSuite CS& Amp; Koraliki badawcze T</td><td>BD</td><td>650621</td><td>Koraliki fluorescencyjne</td></tr><tr><td>BD FACSPerse cytometr przepływowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> BD <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>E. coli kompetentne komórki (szczep DH5&alpha;)</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>ECL select Western Blotting odczynnik do wykrywania</td> GE <td>Healthcare</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>Pekin JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td><td>JY300C</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie 8-paskowe nakrętki</td><td>NEST</td><td>406012</td><td></td></tr><tr><td>Firma zajmująca się syntezą genów</td><td>Azenta Life Sciences</td><td></td><td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA HiFiScript</td> Zestaw <td>CW2569M CWBIO</td><td></td><td>używany w kroku 6.2.2.1</td></tr><tr><td>Roztwór lizatu (Zymolyase)</td><td>zymoresearch</td><td>E1004-A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td>- </td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet&mdash; 10 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet&mdash; 1000 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet&mdash; 200 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>pRSII403</td><td>Addgene</td><td>35436</td><td></td></tr><tr><td>pRSII404</td><td>Addgene</td><td>35438</td><td></td></tr><tr><td>pRSII405</td><td>Addgene</td><td>35440</td><td></td></tr><tr><td>pRSII406 Addgene</td><td></td><td>35442</td><td></td></tr><tr><td>pRSII424</td><td>Addgene</td><td>35466</td><td></td></tr><tr><td>pTPGI_dSpCas9_VP64&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>49013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny-Acc65I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0599</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny-BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny-SacI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny-XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 96&nbsp;</td><td>Instrument do PCR w czasie rzeczywistym</td> <td>Roche</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae CEN. PK2-1C</td> <td>-</td><td></td> <td>Szczep macierzysty. Genotyp to: MATa; jego3D1; leu2-3_112; ura3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Zestaw</td></tr><tr><td>pętli trzpienia</td> SUC2 <td>SparkJade</td><td>AG0502</td><td>Zestaw używany w kroku 6.2.1.3</td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>BIO-RAD</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T5 Egzonukleaza</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0363</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA Taq</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0208</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>New England Biolabs</td><td>M0495</td><td></td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td><td>Takara</td><td>RR820Q</td><td></td></tr><tr><td>YeaStar RNA kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1002</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr></tbody></table>

genowe obwody cyfrowe oparte na systemach crispr-cas i białkach anty-crispr

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Syntetyczne bramki Boole'a i obwody cyfrowe mają szeroki zakres zastosowań, od diagnostyki medycznej po ochronę środowiska. Odkrycie systemów CRISPR-Cas i ich naturalnych inhibitorów – białek anty-CRISPR (Acrs) – dostarcza nowego narzędzia do projektowania i wdrażania cyfrowych obwodów genowych in vivo. W tym miejscu opisujemy protokół, który jest zgodny z ideą cyklu inżynierii biologicznej "Zaprojektuj-Zbuduj-Przetestuj-Naucz się" i wykorzystuje dCas9/dCas12a wraz z odpowiadającymi im Acr do ustanowienia małych sieci transkrypcyjnych, z których niektóre zachowują się jak bramki Boole'a, w Saccharomyces cerevisiae. Wyniki te wskazują na właściwości dCas9/dCas12a jako czynników transkrypcyjnych. W szczególności, aby osiągnąć maksymalną aktywację ekspresji genów, dSpCas9 musi wchodzić w interakcje ze zmodyfikowanym rusztowaniem RNA, które zbiera wiele kopii domeny aktywacji VP64 (AD). Natomiast dCas12a powinien być stopiony, na końcu C, z silnym VP64-p65-Rta (VPR) AD. Co więcej, aktywność obu białek Cas nie jest zwiększona przez zwiększenie ilości sgRNA/crRNA w komórce. W tym artykule wyjaśniono również, jak tworzyć bramki logiczne w oparciu o interakcję CRISPR-dCas-Acr. Skondensowana domena wiążąca hormony AcrIIA4 ludzkiego receptora estrogenowego jest rdzeniem bramki NOT reagującej na β-estradiol, podczas gdy AcrVA syntetyzowane przez indukowalny promotor GAL1 pozwala naśladować zarówno bramki YES, jak i NOT z galaktozą jako wejściem. W tych ostatnich obwodach AcrVA5 wraz z dLbCas12a wykazywał najlepsze zachowanie logiczne.

Ekspresja sgRNA/crRNA za pomocą promotora polimerazy RNA typu III 
W pierwszej kolejności w pracy tej zajęto się inżynierią obwodu aktywacji transkrypcyjnej (obwód 1) przedstawionego na Rysunku 1A. Składał się on z trzech podstawowych elementów: 1) genu kodującego yEGFP (reporter), poprzedzonego serią różnych syntetycznych promotorów, które stanowiły miejsca docelowe dla dCas9/dCas12a-AD; 2) zoptymalizowanej pod kodony drożdżowe wersji dCas9 lub dCas12a połączonej z domen...

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Nasz protokół wyjaśnia, jak projektować, budować i analizować obwody cyfrowe genów drożdży, które wykorzystują systemy CRISPR dCas typu drugiego i piątego oraz odpowiadające im białka anty-CRISPR. Jest to pobyt montażowy, ponieważ nie gromadzi żadnych standardowych procedur do montażu i testowania syntetycznych sieci transkrypcyjnych w usługach. Na początek przygotuj mieszaninę reakcyjną zawierającą od 20 do 40 nanogramów matrycy DNA, jeden mikrolitr startera do przodu, jeden mikrolitr startera wstecznego, pięć mikrolitrów mieszanki DNTP, 0,5 mikrolitra polimerazy DNA, 10 mikrolitrów 5x buforu reakcyjnego polimerazy DNA i podwójnie destylowaną wodę do całkowitej objętości 50 mikrolitrów.Amplifikuj sekwencje DNA za pomocą programu touchdown PCR na termocyklerze, jak opisano w manuskrypcie. Wyizolować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i rozcieńczyć sekwencje DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA. Korzystając z metody montażu Gibsona, wprowadź oczyszczone produkty PCR do rozciętego wektora wahadłowego, wpuszczając równomolową mieszaninę DNA w temperaturze 50 stopni Celsjusza na jedną godzinę.Skonstruuj wektor akceptacyjny dCas12a za pomocą PCR z przyłożeniem i metody montażu Gibsona, jak pokazano wcześniej. Wstaw zoptymalizowane pod kątem kodonu drożdżowego białka dCas12a do dwóch nowo skonstruowanych wektorów akceptorowych poprzez trawienie z BamH1 i Xhol1 oraz ligację z ligazą DNA T4. Podobnie, skonstruuj plazmidy w oparciu o wektor wahadłowy pRS2403 w celu ekspresji białek anty-CRISPR za pomocą touchdown PCR i metody składania Gibsona.Aby przeprowadzić mikroskopowe wykrywanie komórek, umieść dwa mikrolitry roztworu komórkowego na szkiełku podstawowym i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, włączając fluorescencyjne źródło światła, mikroskop i komputer. Po zapisaniu numeru źródła światła fluorescencyjnego otwórz oprogramowanie mikroskopu na komputerze.Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu 40x, obserwując komórki w zielonym świetle. Przesuwaj pokrętło ostrości kursu, aż pojawi się kontur komórek drożdży i delikatne pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość komórek. Aby wykryć komórki, po zamknięciu pola widzenia mikroskopu przełącz się na ekran komputera i kliknij na żywo.Poczekaj od trzech do pięciu sekund. Kliknij przechwyć, aby zrobić zdjęcie i zapisać zdjęcie. Następnie wyłącz komputer, mikroskop i fluorescencyjne źródło światła.Włącz maszynę FACS 20 minut przed pomiarami, aby rozgrzać laser i wymieszać 20 mikrolitrów kultury komórkowej z 300 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Uruchom oprogramowanie FACS na komputerze podłączonym do komputera FACS i utwórz nowy eksperyment. Następnie ustaw parametry pomiaru.Następnie wybierz filtr zgodnie z długościami fal wzbudzenia i emisji próbek i ustaw numer komórki akwizycyjnej na 10 000. Dostosuj napięcie filtra FITC, mierząc intensywność koralików fluorescencyjnych, upewniając się, że względna różnica w intensywności koralików między dwoma kolejnymi eksperymentami nie przekracza 5%Umyj maszynę podwójnie destylowaną wodą przez kilka sekund, aby usunąć ewentualny nadmiar kulek. Zmierz intensywność fluorescencji próbki i kliknij podgląd, czekając od trzech do pięciu sekund na stabilność wstrzyknięcia próbki.Na koniec kliknij nabyć. Zmierz koraliki ponownie pod koniec eksperymentu. Po sprawdzeniu, czy względna różnica między dwoma pomiarami ściegów przekracza 5%Eksportuj dane FACS jako pliki FCS.Otwórz program R Studio i załaduj skrypt BDverse_analysis. R, aby przeanalizować pliki FCS. Ustaw nazwę eksperymentu jako ename, ścieżkę katalogu, w którym pliki FCS są przechowywane jako dir_d, a pliki wynikowe zostaną utworzone jako dir_r.Następnie ustaw kanał fluorescencji. Ustaw liczbę próbek, które zostały zmierzone. Wymiary wykresów punktowych i maksymalna długość osi x i y dla wykresów słupkowych i pudełkowych.Wybierz metodę oceniania, usuwając hashtag z odpowiednich linii. Wybierz obiekt flowSet bramkowany odpowiadający wybranej metodzie bramkowania i rozdzielczości wykresu kropkowego, która powinna być co najmniej równa 256. Odkomentuj dwie instrukcje filtrowania, aby usunąć pomiary, w których fluorescencja jest ujemna, oraz usunąć wartości odstające wynikające z innych eksperymentów, jak opisano w manuskrypcie.Naciśnij przycisk source i uruchom skrypt. Wszystkie pliki zawierające wyniki analizy są tworzone w dir_r. Najlepszą skuteczność aktywacji dSpCas9-VP64 osiągnięto, gdy na syntetycznym promotorze znajdowało się sześć miejsc docelowych lexOp.Natomiast w przypadku dCas12a-VPR najwyższa skuteczność aktywacji po wprowadzeniu trzech kopii lexOp do syntetycznego promotora. Aktywacja przez CRISPR RNA i pojedynczy przewodnik RNA zlokalizowany na zintegrowanym plazmidzie była od 1,4 do 2,4 i od 1,1 do 1,5 razy wyższa niż po umieszczeniu na plazmidzie episomalnym. Wyniki RT-qPCR wykazały, że wektor episomalny wytwarzał znacznie wyższy poziom pojedynczego przewodnika RNA CRISPR RNA niż wektor integracyjny, niezależnie od systemu ekspresji.Przetestowano skuteczność aktywacji kompleksu dSpCas9 i rusztowania RNA rekrutującego MCP-VP64. RNA rusztowania zawierające pojedynczy typ dziki i spinkę do włosów F6MS2 dało odpowiednio 5,27 i 4,3-krotną aktywację. Jednak połączenie dwóch spinów do włosów zaowocowało 7,54-krotnością przy najwyższej skuteczności aktywacji.Cztery różne promotory użyto do napędzania ekspresji trzech rodzajów anty CRISPR typu drugiego, wykazując, że działają one w sposób zależny od dawki. Silny promotor obniżył poziom fluorescencji odpowiednio do 0,21, 0,11 i 0,13 jej wartości. Krzywa miareczkowania pokazuje, że obwód zachowuje się jak chód węzłowy ze stosunkiem włączeń do wyłączeń zbliżającym się do 2,3.Anty-CRISPR typu piątego A zmniejsza ekspresję fluorescencji zarówno denAS-Cas12a, jak i dLB-Cas12a jako aktywatorów z 19% do 71%Badano związek między aktywatorami a represorami, w którym Acr-VA wykazywał duże wahania wydajności, gdy był wytwarzany przez pGAL1 pod pTEF1 i genetycznym CYC1t-pCYC1noTata typ piąty anty-CRISPR-A1 wykazał pewną represję tylko na gołym dLB Cas12a. Maszyna FACS jest krucha, dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie. Roztwór komórkowy nigdy nie powinien być zbyt gęsty, a maszyna powinna być utrzymywana w czystości.

gene-digital-circuits-based-on-crispr-cas-systems-anti-crispr

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Poznaj projektowanie cyfrowych obwodów genowych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem systemów CRISPR-dCas i białek anty-CRISPR. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej w biologii syntetycznej.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Przeglądaj więcej filmów