Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Nasz protokół wyjaśnia, jak projektować, budować i analizować obwody cyfrowe genów drożdży, które wykorzystują systemy CRISPR dCas typu drugiego i piątego oraz odpowiadające im białka anty-CRISPR. Jest to pobyt montażowy, ponieważ nie gromadzi żadnych standardowych procedur do montażu i testowania syntetycznych sieci transkrypcyjnych w usługach. Na początek przygotuj mieszaninę reakcyjną zawierającą od 20 do 40 nanogramów matrycy DNA, jeden mikrolitr startera do przodu, jeden mikrolitr startera wstecznego, pięć mikrolitrów mieszanki DNTP, 0,5 mikrolitra polimerazy DNA, 10 mikrolitrów 5x buforu reakcyjnego polimerazy DNA i podwójnie destylowaną wodę do całkowitej objętości 50 mikrolitrów.

Amplifikuj sekwencje DNA za pomocą programu touchdown PCR na termocyklerze, jak opisano w manuskrypcie. Wyizolować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i rozcieńczyć sekwencje DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA. Korzystając z metody montażu Gibsona, wprowadź oczyszczone produkty PCR do rozciętego wektora wahadłowego, wpuszczając równomolową mieszaninę DNA w temperaturze 50 stopni Celsjusza na jedną godzinę.

Skonstruuj wektor akceptacyjny dCas12a za pomocą PCR z przyłożeniem i metody montażu Gibsona, jak pokazano wcześniej. Wstaw zoptymalizowane pod kątem kodonu drożdżowego białka dCas12a do dwóch nowo skonstruowanych wektorów akceptorowych poprzez trawienie z BamH1 i Xhol1 oraz ligację z ligazą DNA T4. Podobnie, skonstruuj plazmidy w oparciu o wektor wahadłowy pRS2403 w celu ekspresji białek anty-CRISPR za pomocą touchdown PCR i metody składania Gibsona.

Aby przeprowadzić mikroskopowe wykrywanie komórek, umieść dwa mikrolitry roztworu komórkowego na szkiełku podstawowym i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, włączając fluorescencyjne źródło światła, mikroskop i komputer. Po zapisaniu numeru źródła światła fluorescencyjnego otwórz oprogramowanie mikroskopu na komputerze.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu 40x, obserwując komórki w zielonym świetle. Przesuwaj pokrętło ostrości kursu, aż pojawi się kontur komórek drożdży i delikatne pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość komórek. Aby wykryć komórki, po zamknięciu pola widzenia mikroskopu przełącz się na ekran komputera i kliknij na żywo.

Poczekaj od trzech do pięciu sekund. Kliknij przechwyć, aby zrobić zdjęcie i zapisać zdjęcie. Następnie wyłącz komputer, mikroskop i fluorescencyjne źródło światła.

Włącz maszynę FACS 20 minut przed pomiarami, aby rozgrzać laser i wymieszać 20 mikrolitrów kultury komórkowej z 300 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Uruchom oprogramowanie FACS na komputerze podłączonym do komputera FACS i utwórz nowy eksperyment. Następnie ustaw parametry pomiaru.

Następnie wybierz filtr zgodnie z długościami fal wzbudzenia i emisji próbek i ustaw numer komórki akwizycyjnej na 10 000. Dostosuj napięcie filtra FITC, mierząc intensywność koralików fluorescencyjnych, upewniając się, że względna różnica w intensywności koralików między dwoma kolejnymi eksperymentami nie przekracza 5%Umyj maszynę podwójnie destylowaną wodą przez kilka sekund, aby usunąć ewentualny nadmiar kulek. Zmierz intensywność fluorescencji próbki i kliknij podgląd, czekając od trzech do pięciu sekund na stabilność wstrzyknięcia próbki.

Na koniec kliknij nabyć. Zmierz koraliki ponownie pod koniec eksperymentu. Po sprawdzeniu, czy względna różnica między dwoma pomiarami ściegów przekracza 5%Eksportuj dane FACS jako pliki FCS.

Otwórz program R Studio i załaduj skrypt BDverse_analysis. R, aby przeanalizować pliki FCS. Ustaw nazwę eksperymentu jako ename, ścieżkę katalogu, w którym pliki FCS są przechowywane jako dir_d, a pliki wynikowe zostaną utworzone jako dir_r.

Następnie ustaw kanał fluorescencji. Ustaw liczbę próbek, które zostały zmierzone. Wymiary wykresów punktowych i maksymalna długość osi x i y dla wykresów słupkowych i pudełkowych.

Wybierz metodę oceniania, usuwając hashtag z odpowiednich linii. Wybierz obiekt flowSet bramkowany odpowiadający wybranej metodzie bramkowania i rozdzielczości wykresu kropkowego, która powinna być co najmniej równa 256. Odkomentuj dwie instrukcje filtrowania, aby usunąć pomiary, w których fluorescencja jest ujemna, oraz usunąć wartości odstające wynikające z innych eksperymentów, jak opisano w manuskrypcie.

Naciśnij przycisk source i uruchom skrypt. Wszystkie pliki zawierające wyniki analizy są tworzone w dir_r. Najlepszą skuteczność aktywacji dSpCas9-VP64 osiągnięto, gdy na syntetycznym promotorze znajdowało się sześć miejsc docelowych lexOp.

Natomiast w przypadku dCas12a-VPR najwyższa skuteczność aktywacji po wprowadzeniu trzech kopii lexOp do syntetycznego promotora. Aktywacja przez CRISPR RNA i pojedynczy przewodnik RNA zlokalizowany na zintegrowanym plazmidzie była od 1,4 do 2,4 i od 1,1 do 1,5 razy wyższa niż po umieszczeniu na plazmidzie episomalnym. Wyniki RT-qPCR wykazały, że wektor episomalny wytwarzał znacznie wyższy poziom pojedynczego przewodnika RNA CRISPR RNA niż wektor integracyjny, niezależnie od systemu ekspresji.

Przetestowano skuteczność aktywacji kompleksu dSpCas9 i rusztowania RNA rekrutującego MCP-VP64. RNA rusztowania zawierające pojedynczy typ dziki i spinkę do włosów F6MS2 dało odpowiednio 5,27 i 4,3-krotną aktywację. Jednak połączenie dwóch spinów do włosów zaowocowało 7,54-krotnością przy najwyższej skuteczności aktywacji.

Cztery różne promotory użyto do napędzania ekspresji trzech rodzajów anty CRISPR typu drugiego, wykazując, że działają one w sposób zależny od dawki. Silny promotor obniżył poziom fluorescencji odpowiednio do 0,21, 0,11 i 0,13 jej wartości. Krzywa miareczkowania pokazuje, że obwód zachowuje się jak chód węzłowy ze stosunkiem włączeń do wyłączeń zbliżającym się do 2,3.

Anty-CRISPR typu piątego A zmniejsza ekspresję fluorescencji zarówno denAS-Cas12a, jak i dLB-Cas12a jako aktywatorów z 19% do 71%Badano związek między aktywatorami a represorami, w którym Acr-VA wykazywał duże wahania wydajności, gdy był wytwarzany przez pGAL1 pod pTEF1 i genetycznym CYC1t-pCYC1noTata typ piąty anty-CRISPR-A1 wykazał pewną represję tylko na gołym dLB Cas12a. Maszyna FACS jest krucha, dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie. Roztwór komórkowy nigdy nie powinien być zbyt gęsty, a maszyna powinna być utrzymywana w czystości.