Name: Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj automatyzację testu mikrojądrowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej ze zobrazowaniem i sztucznej inteligencji. Ta metoda usprawnia ocenę uszkodzeń DNA i umożliwia wysokoprzepustowe badania toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Pozyskiwanie danych za pomocą cytometrii przepływowej z obrazowaniem
UWAGA: Należy odnieść się do pracy Rodrigues i wsp.16 z następującymi modyfikacjami, przy czym należy pamiętać, że obszary akwizycji przy użyciu IFC mogą wymagać modyfikacji w celu optymalnego zarejestrowania obrazu:
<ol>
	<li>W przypadku metody non-Cyt-B należy przeprowadzić liczenie komórek przy użyciu dostępnego w sprzedaży licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów) na każdej hodowli bezpośrednio przed hodowlą oraz bezpośrednio po okresie rekonwalescencji.</li>
	<li>Jeśli próbki są analizowane na przepływowym cytometrze obrazującym z jedną kamerą, należy umieścić Jasne pole (BF) w Kanał 4Zastąp M01 z M04, i M07 z M01. 
	UWAGA: „M” odnosi się do kanału kamery w IFC.</li>
	<li>Podczas akwizycji należy użyć powiększenia 40x.</li>
	<li>Na wykresie zależności powierzchni BF od współczynnika kształtu BF (BF aspect ratio) podczas akwizycji, należy użyć następujących współrzędnych obszaru: 
	Współrzędne X: 100 i 900; Współrzędne Y: 0,7 i 1 (metoda Cyt-B) 
	Współrzędne X: 100 i 600; współrzędne Y: 0,7 i 1</li>
	<li>Na wykresie intensywności barwienia Hoechst należy zastosować następujące współrzędne obszaru: 
	Współrzędne X: 55 i 75; współrzędne Y: 9,5 i 15 (metoda Cyt-B) 
	Współrzędne X: 55 i 75; współrzędne Y: 13 i 21 (metoda bez użycia Cyt-B)</li>
	<li>Aby usunąć z danych obrazy obiektów apoptotycznych i nekrotycznych, należy uruchomić pakiet oprogramowania IDEAS 6.3 (dalej nazywany „oprogramowaniem do analizy obrazu”; patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Oprogramowanie AI zostało zaprojektowane do pracy z plikami .daf przetworzonymi przy użyciu najnowszej wersji oprogramowania do analizy obrazu. Należy upewnić się, że oprogramowanie do analizy obrazu jest aktualne.</li>
	<li>Zapisz tę pracę jako plik szablonu (.ast).</li>
</ol>
2. Tworzenie plików .daf dla wszystkich plików .rif
<ol>
	<li>Oprogramowanie AI umożliwia import wyłącznie plików .daf. Przetwórz wszystkie pliki .rif z eksperymentu w pliki .daf za pomocą przetwarzania wsadowego.</li>
	<li>W menu Tools kliknij Batch Data Files , a następnie Add Batch.</li>
	<li>W nowym oknie wybierz Add Files i zaznacz pliki .rif, które mają zostać dodane do serii. W opcji Select a Template or Data Analysis File (.ast, .daf) wybierz plik .ast utworzony wcześniej.</li>
	<li>W razie potrzeby przypisz nazwę serii i kliknij OK , aby utworzyć pliki .daf dla wszystkich wczytanych plików .rif.</li>
</ol>
3. Tworzenie eksperymentu w oprogramowaniu AI
<ol>
	<li>Należy zapoznać się ze schematem blokowym na Rysunku 1, który opisuje proces tworzenia modelu głębokiego uczenia przy użyciu oprogramowania AI.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie AI i upewnij się, że zainstalowana jest najnowsza wersja, klikając About w lewym dolnym rogu okna. Jeśli najnowsza wersja nie jest zainstalowana, skontaktuj się z support@luminexcorp.com w celu jej uzyskania.</li>
	<li>Ekranem domyślnym w oprogramowaniu jest ekran New Experiment . Użyj ikony Folder , aby wybrać miejsce zapisu eksperymentu, a następnie wpisz nazwę eksperymentu (np. „MN model”).</li>
	<li>W sekcji Experiment Type kliknij przycisk radiowy obok opcji Train , aby rozpocząć eksperyment treningowy w celu budowy modelu CNN. Kliknij Next.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: jeśli wcześniej wytrenowano już model, można go użyć jako szablonu dla nowego modelu AI, wybierając go na ekranie Select Template Model. Jeśli nie istnieje model szablonowy, pomiń ten krok, klikając Next.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnym ekranem jest ekran Define New Model . W polu Model automatycznie pojawi się nazwa nadana modelowi w kroku 3.3.
	<ol>
		<li>W sekcji Description wpisz opis modelu (opcjonalnie) i pozostaw maksymalny rozmiar obrazu na poziomie 150 pikseli.</li>
		<li>W sekcji Channels kliknij Add BF, aby dodać do listy kanał jasnego pola (brightfield). W kolumnie Name kliknij dwukrotnie Brightfield i zmień nazwę tego kanału na BF. Kliknij Add FL, aby dodać do listy kanał fluorescencyjny. W kolumnie Name kliknij dwukrotnie Fluorescent i zmień nazwę tego kanału na DNA.</li>
		<li>W sekcji Class Names kliknij Add. W oknie pop-up wpisz Mononucleated i kliknij OK. Dzięki temu klasa jednojądrowa zostanie dodana do listy nazw klas. Powtórz ten proces, aby upewnić się, że na liście zdefiniowano następujące sześć klas: 
		Mononucleated 
		Mononucleated with MN 
		Binucleated 
		Binucleated with MN 
		Polynucleated 
		Irregular morphology 
		​Kliknij Next. 
		UWAGA: Te sześć klas modelu prawdy obiektywnej (ground truth) będzie reprezentować kluczowe zdarzenia podlegające ocenie, a także obrazy o morfologii odbiegającej od przyjętych kryteriów oceny5.
		<ol>
			<li>Opcjonalnie: jeśli jest to pożądane, można dołączyć szablon analizy z punktu 1.7, aby wykorzystać funkcje z oprogramowania do analizy obrazu. Jeśli chcesz uwzględnić te funkcje w modelu AI, wyszukaj plik .ast, a następnie z rozwijanych list specyficznych dla kanałów wybierz podzbiory cech, które chcesz dołączyć.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W sekcji Select Files kliknij Add Files i wyszukaj pliki, które mają zostać dodane do oprogramowania AI w celu budowy danych prawdy obiektywnej. Kliknij Next. 
		UWAGA: Ważne jest dodanie wielu plików danych (np. danych kontroli pozytywnej i negatywnej), które zawierają wystarczającą liczbę wszystkich kluczowych zdarzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie, na ekranie Select Base Populations , zlokalizuj populację Non-Apoptotic w hierarchii populacji. Kliknij prawym przyciskiem myszy na populację Non-Apoptotic i wybierz Select All Matching Populations. Kliknij Next. 
	UWAGA: Ważne jest wykluczenie wszelkich populacji, które nie powinny być klasyfikowane (np. kulek, debris, dubletów itp.)</li>
	<li>Ten ekran to ekran Select Truth Populations .
	<ol>
		<li>Jeśli w oprogramowaniu do analizy obrazu nie utworzono otagowanych populacji prawdy obiektywnej dla kluczowych zdarzeń, kliknij Next.</li>
		<li>Jeśli otagowane populacje prawdy obiektywnej zostały utworzone w oprogramowaniu do analizy obrazu, przypisz je do odpowiedniej klasy modelu.</li>
		<li>Aby przypisać otagowaną populację prawdy obiektywnej dla komórek MONO z MN, kliknij klasę Mononucleated with MN w sekcji Model Classes po lewej stronie. Następnie kliknij po prawej stronie odpowiednią otagowaną populację prawdy obiektywnej, która zawiera te zdarzenia.</li>
		<li>Jeśli otagowane populacje prawdy obiektywnej zostały utworzone w więcej niż jednym pliku danych, kliknij prawym przyciskiem myszy jedną z populacji prawdy obiektywnej i wybierz Select All Matching Populations, aby dodać otagowane populacje z wielu plików do odpowiedniej klasy.</li>
		<li>Po przypisaniu wszystkich odpowiednich populacji prawdy obiektywnej kliknij Next.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na ekranie Select Channels wybierz odpowiednie kanały dla eksperymentu. Tutaj ustaw BF na kanał 1 oraz Hoechst na kanał 7. Kliknij prawym przyciskiem myszy na kanale i wybierz Apply to All. Kliknij Next.</li>
	<li>Na koniec, na ekranie Confirmation, kliknij Create Experiment.</li>
	<li>Oprogramowanie AI ładuje obrazy z plików danych i tworzy klasy modelu zdefiniowane w kroku 3.5.3 z obrazami prawdy obiektywnej przypisanymi w kroku 3.7. Kliknij Finish.</li>
	<li>Po utworzeniu eksperymentu prezentowanych jest pięć opcji: 
	Experiment: dostarcza szczegółów eksperymentu, w tym załadowanych plików danych, wybranych kanałów i zdefiniowanych klas modelu prawdy obiektywnej. 
	Tagging: uruchamia narzędzie do tagowania, za pomocą którego użytkownicy mogą uzupełniać dane prawdy obiektywnej. 
	Training: trenuje model na podstawie danych prawdy obiektywnej. 
	Classify: wykorzystuje wytrenowane modele do klasyfikacji danych. 
	​Results: dostarcza wyników zarówno z eksperymentu treningowego, jak i eksperymentu klasyfikacyjnego.</li>
</ol>
4. Uzupełnianie danych prawdy obiektywnej (ground truth) przy użyciu narzędzi do tagowania wspomaganych przez AI
<ol>
	<li>Kliknij Tagging, aby uruchomić interfejs narzędzia do tagowania.
	<ol>
		<li>Kliknij narzędzia powiększania (ikony lupy), aby przyciąć obrazy w celu łatwiejszego przeglądania.</li>
		<li>Kliknij pasek suwaka, aby dostosować rozmiar obrazów i zmienić liczbę obrazów wyświetlanych w galerii.</li>
		<li>Kliknij opcję Display Setting i wybierz Min-Max, co zapewni obraz o najlepszym kontraście do identyfikacji wszystkich kluczowych zdarzeń.</li>
		<li>Kliknij Setup Gallery Display, aby zmienić kolor obrazu DNA na żółty lub biały, co poprawi wizualizację małych obiektów (np. MN).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij Cluster, aby uruchomić algorytm grupujący obiekty o podobnej morfologii. Po zakończeniu klastrowania poszczególne klastry wraz z liczbą obiektów w każdym klastrze zostaną wyświetlone na liście pod nagłówkiem Unknown Populations. Wybierz poszczególne klastry, aby przejrzeć obiekty w nich zawarte i przypisać te obiekty do odpowiednich klas modelowych.</li>
	<li>Po przypisaniu minimum 25 obiektów do każdej klasy modelowej dostępny zostanie algorytm Predict. Kliknij Predict. 
	UWAGA: Obiekty, które nie pasują do żadnej populacji, pozostają zaklasyfikowane jako Unknown. W miarę dodawania kolejnych obiektów do populacji wzorcowych (truth populations) dokładność predykcji wzrasta.</li>
	<li>Kontynuuj uzupełnianie klas modelowych ground truth odpowiednimi obrazami, aż do osiągnięcia wystarczającej liczby obiektów w każdej klasie.</li>
	<li>Po przypisaniu minimum 100 obiektów do każdej klasy modelowej kliknij kartę Training u góry ekranu. Kliknij przycisk Train, aby utworzyć model przy użyciu algorytmów Random Forest i CNN. 
	UWAGA: Oprogramowanie AI tworzy modele z wykorzystaniem obu algorytmów, Random Forest oraz CNN; pola wyboru umożliwiają tworzenie modeli przy użyciu wyłącznie algorytmu Random Forest lub wyłącznie CNN.</li>
</ol>
5. Ocena dokładności modelu
<ol>
	<li>Po zakończeniu trenowania modelu kliknij View Results.</li>
	<li>Użyj ekranu wyników, aby ocenić dokładność modelu. Skorzystaj z menu rozwijanego, aby przełączyć się między Random Forest a CNN. 
	UWAGA: Populacje referencyjne mogą zostać zaktualizowane, a model może zostać ponownie wytrenowany lub wykorzystany w obecnej formie do klasyfikacji dodatkowych danych.
	<ol>
		<li>Aby zaktualizować populacje referencyjne, kliknij Tagging na górze i postępuj zgodnie z sekcją 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Klasyfikacja danych przy użyciu modelu
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie AI. Ekranem domyślnym jest ekran New Experiment. Użyj ikony Folder, aby wybrać miejsce zapisu eksperymentu, a następnie wpisz nazwę eksperymentu.</li>
	<li>W sekcji Experiment Type kliknij przycisk radiowy obok opcji Classify, aby rozpocząć eksperyment klasyfikacji. Kliknij Next.</li>
	<li>Kliknij model, który ma zostać użyty do klasyfikacji, a następnie kliknij Next.</li>
	<li>Na ekranie Select Files kliknij Add Files i wyszukaj pliki, które mają zostać sklasyfikowane przez model CNN. Kliknij Next.</li>
	<li>Następnie, na ekranie Select Base Populations, zaznacz pole wyboru obok populacji Non-Apoptotic w jednym z wczytanych plików. Kliknij prawym przyciskiem myszy na populację Non-Apoptotic i wybierz Select All Matching Populations, aby wybrać tę populację ze wszystkich wczytanych plików. Kliknij Next.</li>
	<li>Opcjonalnie: jeśli dane do klasyfikacji zawierają populacje prawdy (truth populations), można je przypisać do odpowiednich klas modelu na ekranie Select Truth Populations. W przeciwnym razie kliknij Next, aby pominąć ten krok.</li>
	<li>Na ekranie Select Channels wybierz Channel 1 dla jasnego pola (brightfield) oraz Channel 7 dla barwienia DNA. Kliknij prawym przyciskiem myszy na kanał i wybierz Apply to All. Następnie kliknij Next.</li>
	<li>Na koniec, na ekranie Confirmation, kliknij Create Experiment. Oprogramowanie AI wczyta wybrany model oraz wszystkie obrazy z wybranych plików danych. Kliknij Finish.</li>
	<li>Kliknij Classify, aby otworzyć ekran klasyfikacji. Kliknij przycisk Classify. Rozpocznie to proces wykorzystania modeli RF i CNN do klasyfikacji dodatkowych danych i identyfikacji wszystkich obiektów należących do określonych klas modelu. 
	UWAGA: Pola wyboru mogą służyć do wyboru modelu RF i/lub modelu CNN.</li>
	<li>Po zakończeniu klasyfikacji kliknij View Results.</li>
	<li>Kliknij przycisk Update DAFs, aby wyświetlić okno Update DAFs with Classification Results. Kliknij OK, aby zaktualizować pliki .daf.</li>
</ol>
7. Generowanie raportu z wyników klasyfikacji
<ol>
	<li>Na ekranie Results kliknij Generate Report. Zaznacz pole wyboru obok Create Report for Each Input DAF, jeśli wymagany jest oddzielny raport dla każdego wejściowego pliku DAF. Kliknij OK.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu otwórz folder, w którym zapisano pliki raportów. W folderze znajduje się raport z eksperymentu w formacie .pdf oraz folder Resources.</li>
	<li>Otwórz plik .pdf, aby wyświetlić raport. Raport zawiera informacje o modelu i eksperymencie, listę wejściowych plików .daf, liczbę i procentowy udział klas w formie tabelarycznej i histogramów oraz macierz pomyłek podsumowującą medianę prawdopodobieństwa predykcji dla wszystkich wejściowych plików .daf.</li>
	<li>Otwórz folder Resources, a następnie folder CNN. W tym folderze znajdują się pliki .png z wykresami słupkowymi liczby i procentowego udziału klas, a także macierz pomyłek. Dodatkowo dostępne są pliki .csv zawierające liczbę i procentowy udział klas dla każdego pliku wejściowego.</li>
</ol>
8. Określanie częstotliwości występowania MN oraz cytotoksyczności
<ol>
	<li>Obliczanie częstości MN
	<ol>
		<li>Metoda Non Cyt-B: Aby wyznaczyć częstość MN, otwórz plik class_count.csv z kroku 7.4. Dla każdego pliku wejściowego podziel liczbę komórek w populacji „Mononucleated with MN” przez liczbę komórek w populacji „Mononucleated” i pomnóż wynik przez 100: 
		<img alt="Wzór na częstość mikrojąder, przedstawiający stosunek komórek mononuklearnych z MN na schemacie." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Metoda Cyt-B: Aby wyznaczyć częstość MN, otwórz plik class_count.csv z kroku 7.4. Dla każdego plika wejściowego podziel liczbę komórek w populacji „Binucleated with MN” przez liczbę komórek w populacji „Binucleated” i pomnóż wynik przez 100: 
		<img alt="Wzór na stosunek komórek binuklearnych, biologia komórki, równanie do kwantyfikacji binukleacji z mikrojądrami." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie cytotoksyczności
	<ol>
		<li>Metoda Non Cyt-B:
		<ol>
			<li>Wykorzystując początkową liczbę komórek oraz liczbę komórek po zakończeniu inkubacji, oblicz najpierw liczbę podwojeń populacji (PD) dla każdej próbki2: 
			<img alt="Wzór na obliczenie PD: log stosunku końcowej do początkowej liczby komórek podzielony przez log 2 dla proliferacji komórek." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"></li>
			<li>Następnie oblicz względną liczbę podwojeń populacji2: 
			<img alt="Wzór na procentową RPD, równanie, kwantyfikacja względnego wzrostu w kulturach komórek traktowanych w porównaniu do kontrolnych." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"></li>
			<li>Na koniec oblicz cytotoksyczność2 dla każdej próbki: 
			<img alt="Wzór na cytotoksyczność: cytotoksyczność = 100 - RPD, istotne dla analizy danych biologicznych" src="/files/ftp_upload/64549/64549eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>Metoda Cyt-B:
		<ol>
			<li>Aby obliczyć indeks proliferacji z blokadą cytokinezy (CBPI)2, wykorzystaj liczby komórek w klasach mononuklearnych, binuklearnych i polinuklearnych dla każdej próbki z pliku class_count.csv: 
			<img alt="Wzór na CBPI dla analizy podziałów jądrowych; równanie pokazujące obliczanie indeksu proliferacji z blokadą cytokinezy." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq06v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"></li>
			<li>Aby obliczyć cytotoksyczność2, wykorzystaj CBPI z kultur kontrolnych (C) i kultur eksponowanych (T): 
			<img alt="Wzór na cytotoksyczność, równanie, stosunek CBPI w badaniu toksykologicznym dla analizy żywotności komórek." src="/files/ftp_upload/64549/64549eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 7"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project+initiative+and+review+of+validation%2C+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hygiene+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li>
<li>OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals</a>. , OECD Publishing. Paris. (2016).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li>
<li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test%3A+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations%2C+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated%2C+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li>
<li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li>
<li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li>
<li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry%3A+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li>
<li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream%C2%AE+imaging+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+FlowSight%C2%AE+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li>
<li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Systems+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20(2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324(2019).</li>
<li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li>
</ol>

Autorzy są zatrudnieni przez Luminex Corporation, firmę należącą do DiaSorin, producenta cytometru przepływowego do obrazowania ImageStream oraz oprogramowania Amnis AI wykorzystanego w tej pracy.

Prezentowana praca opisuje wykorzystanie algorytmów głębokiego uczenia się do automatyzacji punktacji testu MN. Kilka ostatnich publikacji wykazało, że intuicyjne, interaktywne narzędzia pozwalają na tworzenie modeli głębokiego uczenia się w celu analizy danych obrazowych bez konieczności posiadania dogłębnej wiedzy obliczeniowej18,19. Protokół opisany w tej pracy, wykorzystujący pakiet oprogramowania oparty na interfejsie użytkownika, został zaprojektowany tak, ...

Test mikrojądrowy (MN) ma fundamentalne znaczenie w toksykologii genetycznej do oceny uszkodzeń DNA podczas opracowywania kosmetyków, farmaceutyków i substancji chemicznych stosowanych u ludzi1,2,3,4. Mikrojądra powstają z całych chromosomów lub fragmentów chromosomów, które nie włączają się do jądra po podziale i kondensują się w małe, koliste ciała oddzielone od jądra. W związku z tym MN może być używany jako punkt końcowy do ilościowego określania uszkodzeń DNA w testach genotoksyczności1.
Preferowaną metodą do ilościowego oznaczania MN jest blokowanie podziału za pomocą Cytochalasin-B (Cyt-B). W tej wersji testu cytotoksyczność jest również oceniana poprzez ocenę komórek jednojądrowych (MONO) i wielojądrowych (POLY). Test można również przeprowadzić, oceniając MN w niezablokowanych komórkach MONO, co jest szybsze i łatwiejsze do oceny, przy czym cytotoksyczność ocenia się za pomocą liczby komórek przed i po ekspozycji w celu oceny proliferacji5,6.
Historycznie fizyczna ocena testu była przeprowadzana za pomocą ręcznej mikroskopii, ponieważ pozwala to na wizualne potwierdzenie wszystkich kluczowych zdarzeń. Jednak mikroskopia manualna jest trudna i subiektywna1. W ten sposób opracowano zautomatyzowane techniki, w tym skanowanie szkiełek mikroskopowych i cytometrię przepływową, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. Podczas gdy metody skanowania slajdów umożliwiają wizualizację kluczowych wydarzeń, slajdy muszą być tworzone w optymalnej gęstości komórek, co może być trudne do osiągnięcia. Ponadto w tej technice często brakuje wizualizacji cytoplazmatycznej, co może zagrozić punktacji komórek MONO i POLY7,8. Podczas gdy cytometria przepływowa zapewnia wysokoprzepustowe przechwytywanie danych, komórki muszą być poddawane lizie, co nie pozwala na użycie formy Cyt-B testu. Dodatkowo, jako technika nieobrazowa, konwencjonalna cytometria przepływowa nie zapewnia wizualnej walidacji kluczowych zdarzeń9,10.
Dlatego też badano obrazową cytometrię przepływową (IFC) w celu przeprowadzenia testu MN. ImageStreamX Mk II łączy w sobie szybkość i niezawodność statystyczną konwencjonalnej cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania mikroskopowego w wysokiej rozdzielczości w jednym systemie11. Wykazano, że korzystając z IFC, obrazy wszystkich kluczowych zdarzeń w wysokiej rozdzielczości mogą być rejestrowane i automatycznie oceniane za pomocą feature-based12,13 lub technik sztucznej inteligencji (AI)14,15. Dzięki zastosowaniu IFC do przeprowadzenia testu MN możliwe jest uzyskanie automatycznej oceny znacznie większej liczby komórek w porównaniu z mikroskopią w krótszym czasie.
Ta praca odbiega od wcześniej opisanego przepływu pracy analizy obrazu16 i omawia wszystkie kroki wymagane do opracowania i wytrenowania modelu Random Forest (RF) i/lub konwolucyjnej sieci neuronowej (CNN) przy użyciu oprogramowania Amnis AI (zwanego dalej "oprogramowaniem AI"). Opisano wszystkie niezbędne kroki, w tym wypełnianie danych o prawdzie gruntowej za pomocą narzędzi do tagowania wspomaganych przez sztuczną inteligencję, interpretację wyników trenowania modelu oraz zastosowanie modelu do klasyfikacji dodatkowych danych, co pozwala na obliczenie genotoksyczności i cytotoksyczności15.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Pojemnik do napełniania 200 ml środka czyszczącego.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-86-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning butelkowy filtr próżniowy&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430769</td><td>0,22 i mikro; m filtr, butelka 500 ml</td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>MiliporeSigma</td><td>14930-96-2</td><td>Butelka 5 mg</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Napełnij pojemnik 200 ml Debubbler.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X</td><td>EMD Milipore</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++MG++ Bezpłatny&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>To jest to, co jest używane do 4% i 1% formaliny. UWAGA: Formalina/formaldehyd toksyczny przez drogi oddechowe i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Może powodować uczulenie przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Potencjalne zagrożenie rakiem.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Analizator komórek Guava Muse</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td>Zastosowano analizator komórek Guava Muse o standardowej konfiguracji.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>10 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Miliporów mannitoluSigma</td><td></td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne 100X</td><td>Hyklon</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>Luminex, firma DiaSorin</td> Zastosowano kamerę <td>100220</td><td>A 2 ImageStreamX Mark II wyposażoną w lasery 405 nm, 488 nm i 642 nm.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy MIFC - IDEAS</td><td>Luminex, firma należąca do DiaSorin</td><td>100220</td><td>"Oprogramowanie do analizy obrazu" Oprogramowanie towarzyszące MIFC (ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MIFC - INSPIRE</td><td>Luminex, firma należąca do DiaSorin</td><td>100220</td><td>"Oprogramowanie do akwizycji obrazu" Jest to oprogramowanie, które uruchamia oprogramowanie MIFC (ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Amnis AI</td><td>Luminex, firma</td> <td>DiaSorin100221</td> <td>"Oprogramowanie AI" Jest to oprogramowanie, które pozwala na tworzenie modeli sztucznej inteligencji do analizy danych</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>MiliporeSigma</td><td>50-07-7</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina NEAA 100x</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycyna/Glutamina roztwór 100X</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Płukanie - Woda ultraczysta lub woda dejonizowana</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Użyj dowolnej wody ultraczystej lub wody dejonizowanej.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml płukania.</td></tr><tr><td>RNase</td><td>MilliporeSigma</td><td>9001-99-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Osłona - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>To jest to samo, co sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x&nbsp; Ca++MG++ za darmo.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml pochwy.</td></tr><tr><td>Sterylizator</td><td>HyClone</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr> - <tr><td>0.4%&ndash; 0,7% podchlorynu</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Jest to zdecydowanie 10% wybielacza Clorox, który można uzyskać, rozcieńczając wybielacz Clorox wodą. Napełnij pojemnik 200 ml sterylizatora.</td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa TK6</td><td>MilliporeSigma</td><td>95111735</td><td></td></tr></tbody></table>

automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Test mikrojądrowy (MN) jest używany na całym świecie przez organy regulacyjne do oceny chemikaliów pod kątem toksyczności genetycznej. Test można przeprowadzić na dwa sposoby: poprzez ocenę MN w raz podzielonych, zablokowanych przez cytokinezę komórkach dwujądrowych lub w pełni podzielonych komórkach jednojądrowych. Historycznie rzecz biorąc, mikroskopia świetlna była złotym standardem metody oceny testu, ale jest pracochłonna i subiektywna. Cytometria przepływowa była stosowana w ostatnich latach do oceny testu, ale jest ograniczona przez niemożność wizualnego potwierdzenia kluczowych aspektów obrazowania komórkowego. Obrazowa cytometria przepływowa (IFC) łączy w sobie wysokoprzepustowe przechwytywanie obrazu i zautomatyzowaną analizę obrazu i jest z powodzeniem stosowana do szybkiego pozyskiwania obrazów i oceny wszystkich kluczowych zdarzeń w teście MN. Ostatnio wykazano, że metody sztucznej inteligencji (AI) oparte na konwolucyjnych sieciach neuronowych mogą być wykorzystywane do oceny danych testowych MN pozyskanych przez IFC. W tym dokumencie opisano wszystkie kroki korzystania z oprogramowania sztucznej inteligencji do tworzenia modelu uczenia głębokiego w celu oceny wszystkich kluczowych zdarzeń i zastosowania tego modelu do automatycznego oceniania dodatkowych danych. Wyniki z modelu głębokiego uczenia się AI wypadają dobrze w porównaniu z mikroskopią ręczną, umożliwiając w ten sposób w pełni zautomatyzowaną ocenę testu MN poprzez połączenie IFC i AI.

Rysunek 1 przedstawia schemat pracy z wykorzystaniem oprogramowania AI w celu stworzenia modelu dla analizy MN. Użytkownik ładuje wybrane pliki .daf do oprogramowania AI, a następnie przypisuje obiekty do klas modelu prawdy terenowej (ground truth), korzystając z algorytmów tagowania: klastrowania wspomaganego przez AI (Rysunek 2) oraz predykcji (Rysunek 3>). Po uzupełnieniu wszystkich klas modelu prawdy terenowej odpowiednią liczbą...

Test mikrojądrowy (MN) jest sprawdzonym testem do ilościowego określania uszkodzeń DNA. Jednak ocena testu przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak mikroskopia ręczna lub analiza obrazu oparta na cechach, jest pracochłonna i wymagająca. W artykule opisano metodologię opracowania modelu sztucznej inteligencji do oceny testu MN przy użyciu danych z obrazowej cytometrii przepływowej.

Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Wykonanie testu mikrojądrowego za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej pozwala przezwyciężyć wiele ograniczeń tradycyjnych metod, w tym niską przepustowość, zmienność punktacji i brak wizualnego potwierdzenia zdarzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie kluczowe zdarzenia można uzyskać za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej i przeanalizować za pomocą sztucznej inteligencji. Metoda ta może być potencjalnie wykorzystana w badaniach przesiewowych na dużą skalę chemikaliów i innych związków w celu zbadania toksyczności przy wyższej przepustowości niż jest to obecnie dostępne.Podczas budowy nowego modelu AI głównym wyzwaniem jest uzyskanie wystarczającej ilości obrazów komórek z mikrojądrami, dlatego ważne jest wykorzystanie algorytmów tagowania obrazów. Aby rozpocząć, uruchom sztuczną inteligencję lub oprogramowanie AI. W obszarze Typ eksperymentu kliknij przycisk radiowy obok opcji Trenuj, aby rozpocząć eksperyment szkoleniowy dotyczący tworzenia konwolucyjnej sieci neuronowej lub modelu CNN, a następnie kliknij przycisk Dalej.W obszarze Nazwy klas kliknij przycisk Dodaj. W wyskakującym okienku wpisz Mononucleated i kliknij OK, aby dodać klasę monojądrową do listy nazw klas. Powtórz ten proces, aby dodać inne nazwy klas, takie jak Mononucleated with MN, Binucleated, Binucleated with MN, Polynucleated i Nieregularna morfologia.W obszarze Wybierz pliki kliknij Dodaj pliki i wyszukaj żądane pliki, które mają zostać dodane do oprogramowania AI, aby zbudować podstawowe dane prawdy. Następnie na ekranie Wybierz populację bazową zlokalizuj populację nieapoptotyczną w hierarchii populacji. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy populację nieapopotyczną, wybierz Wybierz wszystkie pasujące populacje i kliknij Dalej.Aby przypisać oznaczoną populację komórek jednojądrowych z mikrojądrem, kliknij klasę Mononucleated with MN w obszarze Model Classes po lewej stronie, a następnie kliknij odpowiednią populację oznaczoną prawdą po prawej stronie. Po przypisaniu wszystkich odpowiednich populacji prawdy kliknij przycisk Dalej. Na ekranie Select Channels (Wybierz kanały) upewnij się, że wybrano odpowiednie kanały do eksperymentu.Tutaj wybierz Bright Field lub BF jako kanał pierwszy, stada dla DNA jako kanał siódmy, a następnie kliknij Dalej. Na koniec na ekranie potwierdzenia kliknij Utwórz eksperyment. Kliknij Tagowanie, aby uruchomić interfejs narzędzia do tagowania.Następnie kliknij narzędzia powiększania, aby przyciąć obrazy w celu łatwiejszego przeglądania. I kliknij suwak, aby dostosować rozmiar obrazu i zdecydować o liczbie obrazów, które mają być wyświetlane w galerii. Kliknij opcję Ustawienia wyświetlania i wybierz min-max, który zapewnia najlepszy kontrast obrazu do identyfikacji wszystkich kluczowych zdarzeń.Następnie kliknij Setup Gallery Display, aby zmienić kolor obrazu DNA na żółty lub biały, co poprawi wizualizację małych obiektów. Kliknij Klaster, aby uruchomić algorytm w celu grupowania obrazów o podobnej morfologii. Po zakończeniu klastrowania kliknij poszczególne klastry i rozpocznij przypisywanie obrazów do odpowiednich klas modeli.Po przypisaniu co najmniej 25 obiektów do każdej klasy modelu algorytm przewidywania staje się dostępny. Kliknij Przewiduj. Po zakończeniu działania algorytmu przewidywania dodaj obiekty z przewidywanych klas do odpowiednich klas modelu.Po przypisaniu co najmniej 100 obiektów do każdej klasy modelu kliknij kartę Trening u góry ekranu, a następnie kliknij przycisk Trenuj. Po zakończeniu trenowania modelu kliknij pozycję Wyświetl wyniki, aby ocenić dokładność modelu. Po zakończeniu trenowania modelu kliknij przycisk menu, aby zdefiniować nowy eksperyment.W obszarze Typ eksperymentu kliknij przycisk radiowy obok opcji Klasyfikuj, aby rozpocząć eksperyment klasyfikacyjny, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij model, który ma zostać użyty do klasyfikacji, a następnie kliknij przycisk Dalej. Na ekranie Wybierz pliki kliknij Dodaj pliki.Wyszukaj pliki, które mają zostać sklasyfikowane według modelu CNN, a następnie kliknij przycisk Dalej. Następnie, na ekranie Wybierz populację bazową, kliknij pole wyboru obok populacji nieapoptotycznej w jednym z załadowanych plików. Kliknij prawym przyciskiem myszy populację nieapoptotyczną, kliknij Wybierz wszystkie pasujące populacje, aby wybrać tę populację ze wszystkich załadowanych plików, a następnie kliknij Dalej.Na ekranie Select Channels (Wybierz kanały) sprawdź, czy kanał pierwszy jest wybrany dla Bright Field, a kanał siódmy jest wybrany dla barwienia DNA, a następnie kliknij przycisk Next (Dalej). Na koniec na ekranie potwierdzenia kliknij Utwórz eksperyment. Oprogramowanie AI ładuje wybrany model i wszystkie obrazy z wybranych plików danych.Po załadowaniu kliknij Zakończ. Następnie kliknij Klasyfikuj, aby uruchomić ekran klasyfikacji. Użyj pól wyboru, aby wybrać użycie lasu losowego lub RF i CNN.Następnie kliknij przycisk Klasyfikuj. Rozpoczyna to proces używania modeli RF i CNN do klasyfikowania dodatkowych danych i identyfikowania wszystkich obiektów, które należą do określonych klas modeli. Po zakończeniu klasyfikacji kliknij Wyświetl wyniki.Kliknij przycisk Aktualizuj DAF, aby wyświetlić okno aktualizacji DAF z wynikami klasyfikacji, a następnie kliknij OK, aby zaktualizować pliki DAF. Aby wygenerować raport, na ekranie wyników kliknij przycisk Generuj raport. Jeśli wymagany jest osobny raport dla każdego wejściowego DAF, zaznacz pole wyboru Utwórz raport dla każdego wejściowego DAF.W przeciwnym razie po prostu kliknij OK, aby uzyskać raporty. Algorytm klastrów wspomagany sztuczną inteligencją grupuje podobne obiekty w segmencie, zgodnie z morfologią zarówno obiektów niesklasyfikowanych, jak i obiektów, które zostały przypisane do klas modeli prawdy podstawowej. Klastry zawierające komórki jednojądrowe znajdują się po jednej stronie mapy obiektu, podczas gdy komórki wielojądrowe znajdują się po przeciwnej stronie.Skupiska komórek dwujądrowych mieszczą się między skupiskami komórek jedno- i wielojądrowych. Wreszcie klastry o nieregularnej morfologii, przypadają w różnych obszarach mapy obiektów. Algorytm przewidywania jest bardziej niezawodny niż algorytm klastrowy w identyfikowaniu subtelnych morfologii na obrazach.Na przykład komórki jednojądrzaste z MN kontra komórki jednojądrzaste bez MN. Wydajność modelu można ocenić za pomocą narzędzi, w tym histogramów rozkładu klas, statystyk dokładności i interaktywnej macierzy pomyłek. W histogramach rozkładu klas im bliższe są wartości procentowe między prawdą a przewidywaną populacją, tym dokładniejszy jest model. W statystykach dokładności im bliżej tych metryk jest 100%, tym dokładniejszy jest model w identyfikowaniu zdarzeń w klasach modelu.Na koniec interaktywna macierz pomyłek wskazuje, gdzie model błędnie klasyfikuje zdarzenia. Genotoksyczność mierzono za pomocą procentu mikrojąder za pomocą mikroskopii, wskazywanego przez przezroczyste paski, oraz AI oznaczanej przez kropkowane paski po 3-godzinnej ekspozycji i 24-godzinnym powrocie do zdrowia, dla mannitolu, etopozydu i mitomycyny C, przy użyciu zarówno metody cytochalazyny B, jak i niecytochalazyny B. Podczas tworzenia eksperymentu szkoleniowego upewnij się, że załadowane dane zawierają obrazy z dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych.Mikrojądra są rzadkie, a do zbudowania dokładnego modelu sztucznej inteligencji wymagana jest wystarczająca ilość obrazów. Procedura ta pozwala na tworzenie modeli sztucznej inteligencji do analizy danych mikrojądrowych przepływu obrazowania w dowolnej dziedzinie nauki, takiej jak biodozymetria promieniowania. Szybka i niezawodna metoda identyfikacji mikrojąder oparta na sztucznej inteligencji może zostać rozszerzona na inne zastosowania, takie jak ilościowe określanie mikrojąder, które mogą być predykcyjne w odniesieniu do ryzyka rozwoju raka.

automation-micronucleus-assay-using-imaging-flow-cytometry-artificial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Ten artykuł opisuje krok po kroku metody automatyzacji kwantyfikacji jąder na podstawie obrazów za pomocą programu wykonywalnego o otwartym kodzie źródłowym, sprawdzanego w różnych gęstościach komórek. Ten program stanowi alternatywę, która usuwa bariery związane z kosztami, dostępnością dla użytkowników o ograniczonych umiejętnościach technologicznych oraz walidacją specyficzną dla aplikacji, która może ograniczać użyteczność istniejących technologii.

Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Poznaj automatyzację testu mikrojądrowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej ze zobrazowaniem i sztucznej inteligencji. Ta metoda usprawnia ocenę uszkodzeń DNA i umożliwia wysokoprzepustowe badania toksyczności.

Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

Przeglądaj więcej filmów