Name: Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj metodę analizy populacyjnej i jednokomórkowej trwałości antybiotyków w Escherichia coli. Technika łączy klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem komórek żywych, umożliwiając charakterystykę fenotypu trwałości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Van Melderen jest wspierana przez działania ARC 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. jest wspierany przez stypendium ULB. T.S. jest wspierany przez stypendium FRIA (FNRS). J.C. jest wspierany przez stypendium podoktorskie "chargé de recherches" (FNRS).

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li>
<li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+mutagenesis%2C+gambler+cells%2C+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074(2022).</li>
<li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li>
<li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413(2018).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986(2020).</li>
<li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25(2013).</li>
<li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034(2020).</li>
<li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li>
<li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li>
<li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286(2022).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis%3A+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state%5BTitle%5D)+AND+%22microLife%22%5BJournal%5D)">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+%C3%9F-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426(2019).</li>
<li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118(2021).</li>
<li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li>
<li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194(2021).</li>
<li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li>
<li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14(2018).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li>
<li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolone+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li>
<li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolones%3A+Action+and+resistance+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibiotics+kill+bacteria%3A+From+targets+to+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li>
<li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li>
<li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET%3A+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522(2014).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+A+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Przedstawiony w niniejszej pracy protokół pozwala na analizę fenotypu trwałości obserwowanego w odpowiedzi na antybiotykoterapię na poziomie populacji i pojedynczych komórek. Eksperymenty przeprowadzono na szczepie E. coli MG1655, który był hodowany w chemicznie zdefiniowanym podłożu (MOPS glicerol 0,4%). Testy zabijające czas i eksperymenty mikroskopowe przeprowadzono na kulturach o fazie wykładniczej. Użyliśmy OFX, fluorochinolonu, w stężeniu 5 μg·mL−1, aby ujawnić trwałe komórki. Opisane tutaj podejścia można zastosować do innych antybiotyków bakteriobójczych, takich jak β-laktamy, aminoglikozydy lub związki przeciwdrobnoustrojowe31. W związku z tym można zastosować inne szczepy bakterii, pożywki lub warunki wzrostu. Monitorowanie różnych fuzji fluorescencyjnych w konfiguracji podobnej do opisanej tutaj może być przydatne do śledzenia procesów komórkowych, takich jak replikacja DNA32, naprawa DNA25,33 i podział komórki34 przed, w trakcie i po antybiotykoterapii. Podobnie, reportery fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów fizjologii komórki, takich jak wewnątrzkomórkowe poziomy pH35, ATP36 lub ROS37. Alternatywnie do fuzji fluorescencyjnych można również zastosować barwniki chemiczne. Na przykład fuzję hupA-mCherry można zastąpić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi DNA38. Należy jednak unikać wykonywania mikroskopii poklatkowej w połączeniu z takimi barwnikami fluorescencyjnymi, ponieważ te techniki barwienia mogą zaburzać dynamikę cyklu komórkowego podczas eksperymentów poklatkowych. Alternatywnie, takie eksperymenty można zastąpić analizami przebiegu czasowego obrazowania z migawki w odpowiednich punktach czasowych.
Chociaż takie fluorescencyjne reportery są pomocne, nie należy zaniedbywać ilości informacji, które można uzyskać dzięki analizie obrazów z kontrastem fazowym. W tym przypadku monitorowaliśmy ewolucję długości komórek na wszystkich etapach wzrostu, leczenia OFX i rekonwalescencji. Inne parametry oparte na obrazach z kontrastem fazowym, takie jak szerokość komórki, intensywność kontrastu fazowego i krzywizny komórek bakteryjnych, można również łatwo wyodrębnić za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak MicrobeJ27.
Podsumowując, opisana tutaj procedura może być zastosowana do innych schorzeń i gatunków bakterii w celu monitorowania odpowiedzi komórkowych na zmieniające się środowisko lub stresory18,19. Dzięki zastosowaniu innych reporterów fluorescencyjnych (reporterów transkrypcyjnych i translacyjnych, barwnika chemicznego) w połączeniu z analizą populacji, taką jak cytometria przepływowa/FACS, można odpowiedzieć na interesujące pytania w wieloskalowych ramach.

Ten protokół ma na celu analizę fenotypu trwałości bakterii w odpowiedzi na specyficzne leczenie antybiotykami na poziomie pojedynczej komórki i populacji. Trwałość opisuje zdolność małych subpopulacji w populacji izogenicznej do znoszenia wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych (fluorochinolonów, aminoglikozydów, β-laktamów itp.), przy czym minimalne stężenie hamujące (MIC) tak zwanych komórek trwałych jest identyczne z stężeniem większości populacji. Dwufazowa dynamika zabijania, mierząca przeżywalność bakterii w czasie w obecności antybiotyku, ujawnia obecność komórek przejściowo tolerujących leki, z początkową szybką eliminacją komórek nietrwałych, po której następuje znacznie wolniejsze tempo zabijania komórek trwałych. Po usunięciu antybiotyku komórki te dają początek genetycznie identycznej populacji, która wykazuje podobną dynamikę zabijania, gdy jest traktowana tym samym antybiotykiem1,2. W przeciwieństwie do trwałości, oporność na antybiotyki jest definiowana na poziomie populacji i jest na ogół konsekwencją mutacji de novo lub horyzontalnego transferu genów plazmidu nadającego oporność3. Podczas gdy mutacje odpowiedzialne za oporność są w większości zlokalizowane w miejscu docelowym leku lub w regionach promotora pomp wypływu leku, geny zmieniające częstotliwość trwałości zidentyfikowane za pomocą metod analizy całego genomu i ukierunkowanej analizy mutantów okazały się liczne i różnorodne2,3,4,5,6,7,8. W związku z tym jest prawdopodobne, że komórki bakteryjne mogą wejść w stan trwałości przez wiele ścieżek9,10,11, a podejścia do badania zjawiska trwałości na poziomie pojedynczej komórki są potrzebne do scharakteryzowania fizjologii tych trwałych komórek.
Niedawny rozwój narzędzi mikroprzepływowych używanych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną utorował drogę do charakterystyki fenotypu trwałości i podkreślił rolę kluczowych procesów komórkowych, takich jak replikacja chromosomów12, naprawa DNA13, oraz podział komórek14, w tworzeniu komórek trwałych. W tym artykule opisujemy zintegrowane podejście łączące klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem żywych komórek pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania trwałych komórek generowanych w wykładniczo rosnących kulturach Escherichia coli traktowanych wysoką dawką ofloksacyny. Opisany tutaj protokół może być zastosowany do badania zjawiska trwałości antybiotyków u innych gatunków bakterii, takich jak Bacillus subtilis15, lub warunków (np. utrzymywanie się antybiotyków po leczeniu β-laktamami16) i może być łatwo zmodyfikowany w celu zbadania wielu zjawisk związanych z heterogenicznością fenotypową17,18,19. Co więcej, konfiguracja opisana w tym artykule może być łączona z innymi fluorescencyjnymi reporterami w celu zbadania różnych parametrów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, takich jak wewnątrzkomórkowe poziomy pH20 lub ATP21 na poziomie pojedynczej komórki, co może potencjalnie dostarczyć nowych informacji na temat zjawiska trwałości antybiotyków.

<table><tbody><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0250</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX Microfluidic System&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-S0000&nbsp;</td><td>Układ mikroprzepływowy</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>Merck</td><td>ONIX2 1.0.1&nbsp;</td><td>Oprogramowanie mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Rozdzielacz CellASIC ONIX2 Podstawowy&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-MBC20</td><td>System kolektorów</td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td>Merck</td><td>1.02539.0100</td><td>Dla MOPS glukozy 0.4% i glicerolu MOPS 0.4% podłoża wzrostu</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Merck</td><td>1.02790.0250</td><td>Dla MOPS glukozy 0.4% i glicerolu MOPS 0.4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>Źródło węgla dla glukozy MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)Szczep</td><td></td> referencyjny <td>BE10</td><td>wt, szczep laboratoryjny</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td><td></td><td>BE16</td><td>HU-mFuzja wiśni zintegrowana poprzez transdukcję P1 w natywnym locus, szczep laboratoryjny</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>24244.232</td><td>Do MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4%</td></tr><tr><td>podłoża wzrostowego</td><td>Fidżi</td><td>ImageJ https://fiji.sc/&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do tworzenia obrazów; Schindelin i wsp., jeśli są używane w publikacji</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>56815</td><td>Źródło węgla dla MOPS glicerol 0,4% pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; wielodołkowa płytka hodowlana</td><td>Merck</td><td>M8812-100EA</td><td>24-dołkowa przezroczysta płaska płytka hodowlana o pojemności 2 ml do automatycznego czytnika płytek</td></tr><tr><td>H3BO3&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td>Do MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Hamamatsu</td><td></td><td>C13440-20CU</td><td>Cyfrowe pozyskiwanie obrazu</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Merck</td><td>1.05099.1000</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża</td></tr><tr><td>wzrostu KOH</td><td>Merck</td><td>1.05029.1000</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoże</td></tr><tr><td>wzrostowe K2SO4&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05153.0500</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Pożywka agarowa Luria-Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22700041</td><td>Pożywka wzrostowa do testu galwanicznego</td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Broth Pożywka</td><td>12780029</td><td>Invitrogen</td><td>Pożywka wzrostowa do oznaczania MIC</td></tr><tr><td>MgCl2,6H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05832.1000</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>Roztwór rozcieńczający do testu przeżycia bakterii stosowany przy 10mM</td></tr><tr><td>MicrobeJ&nbsp;</td><td>Wtyczka Imagej/Fiji</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>Wtyczka do analizy obrazu mikroskopowego. Ducret i wsp. w publikacji; Ustawienia wykrywania: Dla bakterii : Obszar (&mu; m2): 0,1-max; Długość (&mu; m): 0,5-max; Szerokość (&mu; m): 0,6-max; Zakres (&mu; m): 0,5-max; Kątowość (rad): 0-0,3; 0-max dla wszystkich innych parametrów.&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki mikroprzepływowe CellASIC ONIX</td><td>Merck</td><td>B04A-03-5PK&nbsp;</td><td>Płytka do układu mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.05927.0100</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>MOPS, wolny kwas ULTROL&reg; Klasa</td><td>Merck</td><td>475898-500GM</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostu</td></tr> <tr><td>(NH4)6Mo7O24,4H2O</td><td>Merck</td><td>1.01180.0250</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Ofloksacyna</td><td>Merck</td><td>82419-36-1</td><td>Antybiotyk fluorochinolonowy stosowany w leczeniu komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4, 1x</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td>Bufor rozcieńczający</td></tr><tr><td>GENESYS 10S Spektrofotometr UV-Visible</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 840-208200</td><td>Spektrofotometr UV-widzialny, uchwyt pojedynczy/sześciokomórkowy z drukarkąPomiar gęstości optycznej OD600nm</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Oprogramowanie do czytnika mikropłytek</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>N-[Tris(hydrox&eacute; thyl)-m&eacute; thyl]-glycine</td><td>Merck</td><td>1.08602.0250</td><td>Do MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Zeiss&reg; Olejek immersyjny 518F</td><td>Olejek immersyjny Zeiss</td><td></td><td>zwiększający rozdzielczość mikroskopu</td></tr><tr><td>Zen3.2 Pro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Mikroskopowe oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania obrazów</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.08883.0500</td><td>Dla MOPS glukozy 0,4% i glicerolu MOPS 0,4% podłoża wzrostowego</td></tr></tbody></table>

analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Trwałość antybiotyku odnosi się do zdolności małych subpopulacji bakteryjnych do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Po zastosowaniu antybiotykobójczej antybiotykobójczej większości populacji bakterii dochodzi do szybkiego zabicia. Po tej pierwszej szybkiej fazie zabijania następuje znaczny spadek tempa zabijania, ponieważ trwałe komórki pozostają żywotne. Klasycznie trwałość określa się na poziomie populacji za pomocą testów czasu/uśmiercenia przeprowadzonych przy użyciu wysokich dawek antybiotyków i dla określonych czasów ekspozycji. Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat poziomu komórek trwałych i kinetyki zabijania, nie odzwierciedla wewnętrznej heterogeniczności między komórkami leżącej u podstaw zjawiska trwałości. Opisany tutaj protokół łączy klasyczne testy czasu/zabicia z analizą pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Dzięki zastosowaniu odpowiednich reporterów fluorescencyjnych, obrazowanie mikroskopowe żywych komórek może dostarczyć informacji na temat wpływu antybiotyku na procesy komórkowe, takie jak replikacja i segregacja chromosomów, wydłużanie komórek i podział komórek. Połączenie analizy populacyjnej i pojedynczej komórki pozwala na molekularną i komórkową charakterystykę fenotypu trwałości.

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Opisany tutaj protokół zapewnia metodę integracyjną łączącą klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem na żywo pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania komórek przetrwałych Escherichia coli po leczeniu wysokim poziomem ofloksacyny. Główną zaletą tej techniki jest analiza zjawiska trwałości na poziomie populacji i pojedynczej komórki. Połączenie analizy populacyjnej i pojedynczej komórki pozwala na molekularną i komórkową charakterystykę fenotypu trwałości.Na początek rozprowadź interesujący Cię szczep bakteryjny z zamrożonego wywaru glicerolu na płytce agarowej LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przez okres od 15 do 19 godzin, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Zaszczepić izolowaną kolonię w szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki wzrostowej MOPS uzupełnionej 0,4% glukozy i, jeśli to konieczne, dodać selektywny antybiotyk do pożywki. Umieść probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 180 obr./min na noc.Następnego dnia odwirować jeden mililitr kultury przy 2,300 g przez trzy minuty, aby osadzać komórki, i delikatnie ponownie zawiesić osad z tą samą objętością PBS. Zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nanometrach i oblicz objętość potrzebną do początkowego OD600 wynoszącego 0,01 w końcowej objętości dwóch mililitrów. Następnie dodaj dwa mililitry glicerolu MOPS 0,4% pożywki do studzienki na przezroczystej, 24-dołkowej płytce i zaszczepij obliczoną objętością kultury przez noc.Umieścić 24-dołkową płytkę w automatycznym czytniku mikropłytek, aby monitorować OD600 przez 24 godziny. Ustaw czytnik mikropłytek tak, aby mierzył OD600 co 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy dużym obrocie orbitalnym 140 obr./min. Rozpuść 100 mililitrów agaru LB i napełnij kolbę temperaturą 55 stopni Celsjusza, aby uniknąć zestalenia.Przygotować sześć małych szklanych kolb i odpipetować pięć mililitrów płynnego podłoża agarowego LB do każdej kolby za pomocą sterylnej pipety. Weź 10 mikrolitrów z pięciu miligramów na mililitr roztworu podstawowego ofloksacyny i rozcieńcz w 90 mikrolitrach ultraczystej wody. Dodawać zwiększające się objętości rozcieńczonej ofloksacyny do każdej z sześciu szklanych kolb zawierających podłoże agarowe LB, aby uzyskać końcowe stężenie od zera do 0,1 mikrograma na mililitr ofloksacyny.Wymieszać roztwór, obracając kilkakrotnie kolby, a następnie wlać pożywkę agarową LB z dodatkiem antybiotyku do sześciodołkowej płytki hodowlanej. Pozwól agarowi ostygnąć aż do zestalenia i wysusz płytkę przed użyciem. Rozcieńczyć hodowlę bakteryjną przez noc do końcowej gęstości komórek od jednego razy 10 do siódmej CFU na mililitr za pomocą PBS.Umieść dwa mikrolitry rozcieńczonej kultury na każdym dołku wysuszonej płytki sześciodołkowej. Pozostaw plamy do wyschnięcia przed umieszczeniem płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia sprawdź, przy jakim stężeniu ofloksacyny zahamowany jest wzrost kolonii bakterii.Wlej około 25 mililitrów przygotowanego agaru LB na szalkę Petriego. Następnie dodaj pięć do ośmiu sterylnych szklanych koralików do każdej zestalonej i wysuszonej płytki. Odwróć i oznacz talerze.Następnie przygotuj dziesięciokrotnie seryjne szklane probówki zawierające 900 mikrolitrów 0,01-molowego roztworu siarczanu magnezu. W szklanej probówce rozcieńczyć kulturę przez noc w świeżej pożywce o dostosowanej temperaturze do końcowego OD600 około 0,001 i pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w inkubatorze. Następnego dnia, gdy OD600 osiągnie 0,3, przenieś 100 mikrolitrów kultury do rozcieńczenia zgodnie z danymi z testu punktowego.Wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczanie kultury bakteryjnej. Następnie rozłóż 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na przygotowanych płytkach agarowych LB. Dodać żądane stężenie ofloksacyny do kultury bakteryjnej i kontynuować inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając.W odpowiednich punktach czasowych pobrać 100 mikrolitrów kultury i rozcieńczyć kulturę zgodnie z danymi z testu punktowego. Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na płytkach agarowych LB. Następnego dnia policz kolonie na nocnych inkubowanych płytkach w dwóch najwyższych rozcieńczeniach, dla których można wykryć kolonie.Oblicz współczynnik przeżycia, normalizując CFU na mililitr w każdym punkcie czasowym na CFU na mililitr w T0 i wykreśl znormalizowaną wartość o podstawie logarytmu 10 w funkcji czasu. Usuń roztwór konserwujący z każdej studzienki płytki mikroprzepływowej i zastąp go świeżą pożywką hodowlaną. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową z układem kolektora, klikając przycisk Seal lub za pomocą oprogramowania mikroprzepływowego.Następnie, w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego, wykonaj pierwszą sekwencję zalewania, klikając Uruchom sekwencję zalewania cieczy. Inkubować płytkę w termostatycznie sterowanej komorze mikroskopu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem obrazowania mikroskopowego. Następnie rozpocznij drugą sekwencję zalewania cieczą przed rozpoczęciem eksperymentu.Uszczelnij płytkę mikroprzepływową, klikając przycisk Unseal Plate (Rozpieczętuj płytkę) w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego. Zastąp pożywkę w studzienkach 200 mikrolitrami świeżej pożywki, świeżej pożywki zawierającej antybiotyk i próbką kultury rozcieńczoną 0,01 OD w świeżej pożywce. Po uszczelnieniu płytki mikroprzepływowej, jak pokazano wcześniej, umieść płytkę na obiektywie mikroskopu wewnątrz szafki mikroskopu.W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij przycisk Uruchom sekwencję ładowania komórek, aby umożliwić załadowanie komórek do płytki mikroprzepływowej. Ustaw optymalną ostrość w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka obszarów zainteresowania, w których można zaobserwować odpowiednią liczbę komórek do 300 komórek na pole. W oprogramowaniu mikroprzepływowym edytuj Uruchom niestandardową sekwencję, aby zaprogramować wstrzykiwanie świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez sześć godzin do dołka pierwszego i drugiego, następnie pożywki zawierającej antybiotyk o stężeniu 6,9 kilopaskali lub sześciu godzin do dołka trzeciego, a na końcu świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez 24 godziny do dołka czwartego i piątego.Wykonaj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z jedną klatką co 15 minut przy użyciu światła przechodzącego i źródła światła wzbudzającego dla reportera fluorescencyjnego i uruchom program mikroprzepływowy. Otwórz oprogramowanie ImageJ lub Fiji na komputerze i przeciągnij obrazy z mikroskopii poklatkowej hyperstack na pasek ładowania Fiji. Użyj opcji Obraz, a następnie Kolor, a następnie Utwórz kompozyt, aby połączyć różne kanały hyperstack.Użyj opcji Obraz, Kolor, a następnie Rozmieść kanały, jeśli kanały nie odpowiadają żądanemu kolorowi. Otwórz wtyczkę MicrobeJ i wykryj komórki bakteryjne za pomocą interfejsu edycji ręcznej. Usuń automatycznie wykryte komórki i ręcznie obrysuj interesujące komórki trwałe klatka po klatce.Po wykryciu użyj ikony Wynik w interfejsie ręcznej edycji MicrobeJ, aby wygenerować tabelę ResultJ. Użyj tabeli ResultJ, aby uzyskać wgląd w różne parametry interesujące analizę jednokomórkową i zapisać plik ResultJ. Wartość MIC ofloksacyny dla obu szczepów określono na 0,06 mikrograma na mililitr, co wskazuje, że fuzja hupA-mCherry nie wpłynęła na czułość ofloksacyny w porównaniu z izogenicznym szczepem typu dzikiego.Test punktowy wykazał izolowane klony w odpowiednich rozcieńczeniach w czasie, na przykład od 10 do ujemnego piątego rozcieńczenia w czasie zero. W teście zabijania w czasie zaobserwowano typową krzywą dwufazową, w której pierwsze nachylenie odzwierciedla szybkie zabijanie populacji nietrwałej. Druga faza wykazała wolniejsze tempo zabijania, ujawniając obecność komórek trwałych tolerujących leki.Warto zauważyć, że krzywa zabijania czasu pokazuje, że białko fuzyjne hupA-mCherry nie wpłynęło na kinetykę zabijania czasu. W eksperymencie mikroprzepływowym pierwsza faza wzrostu wskazuje, że komórki były żywotne i dzieliły się przed leczeniem ofloksacyną. Po tej pierwszej fazie wzrostu podział komórek został zablokowany, gdy tylko antybiotyk dotarł do komórek.Po leczeniu ofloksacyną, po perfuzji ze świeżą pożywką, zdecydowana większość komórek nie była w stanie wznowić wzrostu. W przeciwieństwie do tego, mała subpopulacja może wydłużać się i generować komórki nitkowate, które definiuje się jako komórki trwałe. Dzielące się trwałe włókno wygenerowało wiele komórek potomnych, z których większość zaczęła rosnąć i dzielić się podobnie jak komórki nieleczone.Wzrost długości komórki korelował ze wzrostem całkowitej intensywności fluorescencji mCherry, co odzwierciedla wznowienie replikacji i wzrost liczebności nukleoidów. W przypadku stosowania szczepu zawierającego wewnątrzkomórkowy reporter do badania trwałości, ważne jest, aby obecność reportera nie zakłócała wzrostu, MIC i zabijania w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Opisana tutaj procedura może być zastosowana do innych schorzeń i gatunków bakterii w celu monitorowania odpowiedzi komórkowych na zmieniające się środowisko lub stres.Używając innych reporterów fluorescencyjnych w identycznej konfiguracji, można uzyskać nowe informacje na temat fizjologii komórek przetrwałych.

population-single-cell-analysis-antibiotic-persistence-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Oms, T., et al. Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)Ten film przedstawia protokół monitorowania poszczególnych komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję znakowanego fluorescencyjnie białka wiążącego DNA w układzie mikroprzepływowym. Ilustruje to, w jaki sposób antybiotyki hamują większość komórek, podczas gdy subpopulacja komórek przetrwałych przeżywa leczenie i odrasta po usunięciu antybiotyku.

Mikroprzepływowa mikroskopia poklatkowa do badania trwałości antybiotyków w bakteriach

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

ScanLag to wysokoprzepustowa metoda pomiaru opóźnienia wzrostu, a mianowicie czasu opóźnienia, a także tempa wzrostu kolonii dla tysięcy komórek równolegle. Badania przesiewowe za pomocą ScanLag umożliwiają rozróżnienie między długim czasem opóźnienia a powolnym wzrostem na poziomie pojedynczego wariantu.

ScanLag: Wysokoprzepustowa kwantyfikacja wzrostu kolonii i czasu opóźnienia

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

Ten protokół pozwala na czasowy opis wzrostu bakterii w warunkach stresu na poziomie pojedynczej komórki i populacji komórek.

Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem

W tym artykule metodycznym prezentujemy strategię wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji związków chemicznych, takich jak osmolity, które mają znaczący wpływ na trwałość bakterii.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków chemicznych w celu wyjaśnienia ich wpływu na trwałość bakterii

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i identyfikacji bakterii opornych na antybiotyki z wody oraz molekularną charakterystykę ich genów oporności na antybiotyki (ARG). Zastosowanie technik opartych na kulturach i nieopartych na kulturach (analiza metagenomiczna) dostarcza pełnych informacji na temat całkowitej różnorodności bakterii i całkowitej puli różnych ARG obecnych w wodach słodkich z Bombaju w Indiach.

Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj metodę analizy populacyjnej i jednokomórkowej trwałości antybiotyków w Escherichia coli. Technika łączy klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem komórek żywych, umożliwiając charakterystykę fenotypu trwałości.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów