Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Opisany tutaj protokół zapewnia metodę integracyjną łączącą klasyczne testy mikrobiologiczne z obrazowaniem na żywo pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania komórek przetrwałych Escherichia coli po leczeniu wysokim poziomem ofloksacyny. Główną zaletą tej techniki jest analiza zjawiska trwałości na poziomie populacji i pojedynczej komórki. Połączenie analizy populacyjnej i pojedynczej komórki pozwala na molekularną i komórkową charakterystykę fenotypu trwałości.

Na początek rozprowadź interesujący Cię szczep bakteryjny z zamrożonego wywaru glicerolu na płytce agarowej LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przez okres od 15 do 19 godzin, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Zaszczepić izolowaną kolonię w szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki wzrostowej MOPS uzupełnionej 0,4% glukozy i, jeśli to konieczne, dodać selektywny antybiotyk do pożywki. Umieść probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 180 obr./min na noc.

Następnego dnia odwirować jeden mililitr kultury przy 2,300 g przez trzy minuty, aby osadzać komórki, i delikatnie ponownie zawiesić osad z tą samą objętością PBS. Zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nanometrach i oblicz objętość potrzebną do początkowego OD600 wynoszącego 0,01 w końcowej objętości dwóch mililitrów. Następnie dodaj dwa mililitry glicerolu MOPS 0,4% pożywki do studzienki na przezroczystej, 24-dołkowej płytce i zaszczepij obliczoną objętością kultury przez noc.

Umieścić 24-dołkową płytkę w automatycznym czytniku mikropłytek, aby monitorować OD600 przez 24 godziny. Ustaw czytnik mikropłytek tak, aby mierzył OD600 co 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy dużym obrocie orbitalnym 140 obr./min. Rozpuść 100 mililitrów agaru LB i napełnij kolbę temperaturą 55 stopni Celsjusza, aby uniknąć zestalenia.

Przygotować sześć małych szklanych kolb i odpipetować pięć mililitrów płynnego podłoża agarowego LB do każdej kolby za pomocą sterylnej pipety. Weź 10 mikrolitrów z pięciu miligramów na mililitr roztworu podstawowego ofloksacyny i rozcieńcz w 90 mikrolitrach ultraczystej wody. Dodawać zwiększające się objętości rozcieńczonej ofloksacyny do każdej z sześciu szklanych kolb zawierających podłoże agarowe LB, aby uzyskać końcowe stężenie od zera do 0,1 mikrograma na mililitr ofloksacyny.

Wymieszać roztwór, obracając kilkakrotnie kolby, a następnie wlać pożywkę agarową LB z dodatkiem antybiotyku do sześciodołkowej płytki hodowlanej. Pozwól agarowi ostygnąć aż do zestalenia i wysusz płytkę przed użyciem. Rozcieńczyć hodowlę bakteryjną przez noc do końcowej gęstości komórek od jednego razy 10 do siódmej CFU na mililitr za pomocą PBS.

Umieść dwa mikrolitry rozcieńczonej kultury na każdym dołku wysuszonej płytki sześciodołkowej. Pozostaw plamy do wyschnięcia przed umieszczeniem płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia sprawdź, przy jakim stężeniu ofloksacyny zahamowany jest wzrost kolonii bakterii.

Wlej około 25 mililitrów przygotowanego agaru LB na szalkę Petriego. Następnie dodaj pięć do ośmiu sterylnych szklanych koralików do każdej zestalonej i wysuszonej płytki. Odwróć i oznacz talerze.

Następnie przygotuj dziesięciokrotnie seryjne szklane probówki zawierające 900 mikrolitrów 0,01-molowego roztworu siarczanu magnezu. W szklanej probówce rozcieńczyć kulturę przez noc w świeżej pożywce o dostosowanej temperaturze do końcowego OD600 około 0,001 i pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w inkubatorze. Następnego dnia, gdy OD600 osiągnie 0,3, przenieś 100 mikrolitrów kultury do rozcieńczenia zgodnie z danymi z testu punktowego.

Wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczanie kultury bakteryjnej. Następnie rozłóż 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na przygotowanych płytkach agarowych LB. Dodać żądane stężenie ofloksacyny do kultury bakteryjnej i kontynuować inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając.

W odpowiednich punktach czasowych pobrać 100 mikrolitrów kultury i rozcieńczyć kulturę zgodnie z danymi z testu punktowego. Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na płytkach agarowych LB. Następnego dnia policz kolonie na nocnych inkubowanych płytkach w dwóch najwyższych rozcieńczeniach, dla których można wykryć kolonie.

Oblicz współczynnik przeżycia, normalizując CFU na mililitr w każdym punkcie czasowym na CFU na mililitr w T0 i wykreśl znormalizowaną wartość o podstawie logarytmu 10 w funkcji czasu. Usuń roztwór konserwujący z każdej studzienki płytki mikroprzepływowej i zastąp go świeżą pożywką hodowlaną. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową z układem kolektora, klikając przycisk Seal lub za pomocą oprogramowania mikroprzepływowego.

Następnie, w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego, wykonaj pierwszą sekwencję zalewania, klikając Uruchom sekwencję zalewania cieczy. Inkubować płytkę w termostatycznie sterowanej komorze mikroskopu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem obrazowania mikroskopowego. Następnie rozpocznij drugą sekwencję zalewania cieczą przed rozpoczęciem eksperymentu.

Uszczelnij płytkę mikroprzepływową, klikając przycisk Unseal Plate (Rozpieczętuj płytkę) w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego. Zastąp pożywkę w studzienkach 200 mikrolitrami świeżej pożywki, świeżej pożywki zawierającej antybiotyk i próbką kultury rozcieńczoną 0,01 OD w świeżej pożywce. Po uszczelnieniu płytki mikroprzepływowej, jak pokazano wcześniej, umieść płytkę na obiektywie mikroskopu wewnątrz szafki mikroskopu.

W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij przycisk Uruchom sekwencję ładowania komórek, aby umożliwić załadowanie komórek do płytki mikroprzepływowej. Ustaw optymalną ostrość w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka obszarów zainteresowania, w których można zaobserwować odpowiednią liczbę komórek do 300 komórek na pole. W oprogramowaniu mikroprzepływowym edytuj Uruchom niestandardową sekwencję, aby zaprogramować wstrzykiwanie świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez sześć godzin do dołka pierwszego i drugiego, następnie pożywki zawierającej antybiotyk o stężeniu 6,9 kilopaskali lub sześciu godzin do dołka trzeciego, a na końcu świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez 24 godziny do dołka czwartego i piątego.

Wykonaj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z jedną klatką co 15 minut przy użyciu światła przechodzącego i źródła światła wzbudzającego dla reportera fluorescencyjnego i uruchom program mikroprzepływowy. Otwórz oprogramowanie ImageJ lub Fiji na komputerze i przeciągnij obrazy z mikroskopii poklatkowej hyperstack na pasek ładowania Fiji. Użyj opcji Obraz, a następnie Kolor, a następnie Utwórz kompozyt, aby połączyć różne kanały hyperstack.

Użyj opcji Obraz, Kolor, a następnie Rozmieść kanały, jeśli kanały nie odpowiadają żądanemu kolorowi. Otwórz wtyczkę MicrobeJ i wykryj komórki bakteryjne za pomocą interfejsu edycji ręcznej. Usuń automatycznie wykryte komórki i ręcznie obrysuj interesujące komórki trwałe klatka po klatce.

Po wykryciu użyj ikony Wynik w interfejsie ręcznej edycji MicrobeJ, aby wygenerować tabelę ResultJ. Użyj tabeli ResultJ, aby uzyskać wgląd w różne parametry interesujące analizę jednokomórkową i zapisać plik ResultJ. Wartość MIC ofloksacyny dla obu szczepów określono na 0,06 mikrograma na mililitr, co wskazuje, że fuzja hupA-mCherry nie wpłynęła na czułość ofloksacyny w porównaniu z izogenicznym szczepem typu dzikiego.

Test punktowy wykazał izolowane klony w odpowiednich rozcieńczeniach w czasie, na przykład od 10 do ujemnego piątego rozcieńczenia w czasie zero. W teście zabijania w czasie zaobserwowano typową krzywą dwufazową, w której pierwsze nachylenie odzwierciedla szybkie zabijanie populacji nietrwałej. Druga faza wykazała wolniejsze tempo zabijania, ujawniając obecność komórek trwałych tolerujących leki.

Warto zauważyć, że krzywa zabijania czasu pokazuje, że białko fuzyjne hupA-mCherry nie wpłynęło na kinetykę zabijania czasu. W eksperymencie mikroprzepływowym pierwsza faza wzrostu wskazuje, że komórki były żywotne i dzieliły się przed leczeniem ofloksacyną. Po tej pierwszej fazie wzrostu podział komórek został zablokowany, gdy tylko antybiotyk dotarł do komórek.

Po leczeniu ofloksacyną, po perfuzji ze świeżą pożywką, zdecydowana większość komórek nie była w stanie wznowić wzrostu. W przeciwieństwie do tego, mała subpopulacja może wydłużać się i generować komórki nitkowate, które definiuje się jako komórki trwałe. Dzielące się trwałe włókno wygenerowało wiele komórek potomnych, z których większość zaczęła rosnąć i dzielić się podobnie jak komórki nieleczone.

Wzrost długości komórki korelował ze wzrostem całkowitej intensywności fluorescencji mCherry, co odzwierciedla wznowienie replikacji i wzrost liczebności nukleoidów. W przypadku stosowania szczepu zawierającego wewnątrzkomórkowy reporter do badania trwałości, ważne jest, aby obecność reportera nie zakłócała wzrostu, MIC i zabijania w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Opisana tutaj procedura może być zastosowana do innych schorzeń i gatunków bakterii w celu monitorowania odpowiedzi komórkowych na zmieniające się środowisko lub stres.

Używając innych reporterów fluorescencyjnych w identycznej konfiguracji, można uzyskać nowe informacje na temat fizjologii komórek przetrwałych.