Name: Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę karmienia kleszczy sztuczną membraną dla Ixodes scapularis. Technika umożliwia kontrolowane badanie interakcji patogen-kleszcz bez użycia zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie komory membranowej dla kleszczy
<ol>
	<li>Przygotuj płaską, nieporowatą powierzchnię, taką jak płaszczyzna szkła lub metalowa podstawa pokryta ceramiką stojaka na ramię, przecierając ją 70% etanolem, a następnie przykryj pojedynczą warstwą folii, upewniając się, że folia jest płaska i bez pęcherzyków lub zmarszczek (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przyklej 100% papier do czyszczenia soczewek ze sztucznego jedwabiu do przygotowanej powierzchni. Upewnij się, że jest płaski i lekko napięty taśmą ze wszystkich czterech stron papieru. Dwa kawałki papieru do soczewek o wymiarach 4 cale x 6 cali można przekształcić w membrany, korzystając z objętości opisanych w kroku 1.3. 
	UWAGA: Jest to wystarczające do stworzenia do 12 komór żywieniowych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Jeśli błona jest przeznaczona dla larw kleszczy, użyj papieru unryu zamiast papieru do czyszczenia soczewek.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę silikonu o twardości 00-10, odmierzając 5 ml każdej części zestawu silikonowego do jednorazowego pojemnika, lekko mieszając oba płyny przed dodaniem 1,5 ml heksanu. Kontynuuj mieszanie, aż mieszanina będzie jednorodna i dokładnie wymieszana. 
	UWAGA: Jeśli wykonujesz membrany dla dorosłych kleszczy, użyj silikonu o twardości 00-50.</li>
	<li>Użyj małej ściągaczki, aby rozprowadzić mieszankę silikonową na papierze do soczewek. Odstawić na 1 minutę, aby upewnić się, że silikon wsiąkł w papier do soczewek. Równomiernie zeskrob nadmiar silikonu na bok za pomocą ściągaczki, używając niewielkiego nacisku w dół. Wykonaj drugie przejście ściągaczką, nie wywierając nacisku w dół, aby usunąć wszelkie linie silikonu i uzyskać gładką warstwę. 
	UWAGA: Ten etap procedury może wymagać pewnej praktyki, aby wytworzyć błony o optymalnej grubości dla każdego etapu życia (dorosłe: 150-200 μm; nimfy: 90-120 μm; larwy: 80-100 μm). Grubsza membrana (w granicach tolerancji karmienia na danym etapie życia) zwykle daje lepsze wyniki poprzez zmniejszenie kondensacji w komorze i poprawę charakterystyki samonaprawy membrany.</li>
	<li>Tylko w przypadku larw zanurz górną część komory karmienia w żywicy fluoropolimerowej Fluon (PTFE-30) kilka razy, pozwalając jej wyschnąć między aplikacjami w celu wytworzenia jednolitej warstwy. 
	UWAGA: Nałożenie Fluonu utworzy nieprzywierającą warstwę żywicy fluoropolimerowej, podobną do nieprzywierającej patelni do gotowania. Zmniejszy to liczbę larw, które wspinają się na szczyt komory21.</li>
	<li>Pozostaw membranę do utwardzenia przez co najmniej 24 godziny w środowisku wolnym od kurzu, takim jak zamknięta komora bezpieczeństwa chemicznego lub biologicznego, przed przejściem do następnego kroku. Zobacz Rysunek 1C, aby zobaczyć, jak wygląda papier do soczewek ze sztucznego jedwabiu po pozostawieniu silikonu do wyschnięcia.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę silikonu o twardości 30, aby przymocować komory do membrany, mieszając równe części mieszanki silikonowej A i B.</li>
	<li>Zanurz komory poliwęglanowe na około ćwierć cala (6 mm) w mieszance silikonowej, a następnie umieść na arkuszu membrany, uważając, aby nie zachodzić na żadną część taśmy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Pozwól mocującemu silikonowi utwardzić się przez co najmniej 24 godziny przed przejściem do kolejnych kroków.</li>
	<li>Za pomocą skalpela ostrożnie przetnij membranę wokół każdej z dołączonych komór, przycinając krawędzie tak, aby mogła gładko zmieścić się w studzience płytki 6-dołkowej bez większego skrobania po bokach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Pozostawić wystarczającą ilość materiału na zewnątrz komory, aby zmaksymalizować przyczepność membrany. 
	UWAGA: Jeśli pozostanie zbyt dużo materiału zewnętrznego, wielokrotne wyjmowanie komory z płytki 6-dołkowej może spowodować częściowe oderwanie się membrany od komory. Naprawa oderwanych membran jest opisana w punkcie 5.</li>
	<li>Wytnij mały kawałek pozostałej membrany z każdego z rogów i środka arkusza membrany. Usuń folię z każdego kawałka. Zmierz kawałki za pomocą mikrometru, aby określić średnią grubość membrany. 
	UWAGA: Jeśli grubość membrany nie mieści się w zakresie tolerancji dla etapu życia (patrz krok 1.4), membrany należy wyrzucić i ponownie wykonać. Grubość papieru Unryu jest bardzo zmienna ze względu na grube pasma włókien i cienkie obszary. Chociaż ta cecha pozwala larwom znaleźć obszary o optymalnej grubości, utrudnia określenie rzeczywistej grubości błony.</li>
	<li>Umieścić komory karmienia wraz z jednym pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym na komorę w szklanej zlewce, która ma być sterylizowana w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 20 minut w celu sterylizacji. Poczekaj, aż komory ostygną przed ich użyciem.</li>
</ol>
2. Ustawianie kanału tick
<ol>
	<li>Przygotuj lampę lub pomieszczenie tak, aby światła były włączone przez 16 godzin, a następnie wyłączone przez 8 godzin. Jeśli używasz lampy, upewnij się, że kąpiel wodna w następnym kroku jest w ciemności przez te 8 godzin.</li>
	<li>Ustawić łaźnię wodną o temperaturze 34 °C i z podporami, tak aby 6-dołkowa płytka mogła w niej siedzieć i lekko unosić się na wodzie. Użyj małych szklanych zlewek zatopionych w łaźni wodnej jako podpór. Użyj przezroczystej pokrywy do kąpieli wodnej, aby utrzymać cykl jasno-ciemny dla kleszczy; w razie potrzeby użyj stojaka pod literę T i folii, aby zrobić pokrowiec. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, dodać 0,02% chlorku benzalkoniowego do łaźni wodnej i ustawić kolejną łaźnię wodną na 36 °C w celu ogrzania schłodzonej krwi.</li>
	<li>Wyjmij wstępnie przygotowane, autoklawowane komory membranowe, umieszczając O-ring wokół komory (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F), a następnie napełnij każdą komorę wystarczającą ilością 70% etanolu, aby pokryć membranę. Pozostaw w 6-dołkowej płytce na 5 minut, a następnie poszukaj wszelkich nieszczelności między komorą a membraną oraz w samej membranie. 
	UWAGA: Jeśli membrana przecieka, etanol będzie gromadził się w podstawie studni. Nieszczelne membrany należy wyrzucić.</li>
	<li>Opróżnij etanol z komór, a następnie pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym. 
	UWAGA: Może to potrwać kilka minut w zależności od wilgotności otoczenia.</li>
	<li>Podczas oczekiwania należy dokonać inaktywacji termicznej dopełniacza we krwi, ogrzewając go w temperaturze 56 °C przez 40 min. Uzupełnić mechanicznie defibrynowaną krew bydlęcą w dawce 2 g/l glukozy.</li>
	<li>Po wyschnięciu membrany nanieść ~20 μL fagostymulantu do wnętrza komory, a następnie rozprowadzić go po powierzchni poprzez przechylenie komory. Patrz punkt 6 w celu uzyskania instrukcji dotyczących przygotowania fagostymulantu z kleszcza frass.</li>
	<li>Poczekaj, aż fagostymulant wyschnie, zanim dodasz kleszcze do komory za pomocą szczoteczki lub kleszczy. Pracuj tak szybko, jak to możliwe, przenosząc kleszcze do komory, aby zapobiec ucieczce. Umieść kleszcze w tubie na lodzie na 1-2 minuty przed ich przeniesieniem, aby spowolnić ich zdolność do ucieczki. Po przeniesieniu kleszczy uszczelnij górę parafilmem; Nie należy nadmiernie rozciągać parafilmu, ponieważ ciepło z łaźni wodnej może spowodować jego rozerwanie. 
	UWAGA: Kleszcze najlepiej sprawdzają się w przypadku nimfalnych i dorosłych etapów życia, a szczotki najlepiej sprawdzają się w stadiach życia larw.</li>
	<li>Dodać 5 ml krwi inaktywowanej termicznie na studzienkę/komorę do stożkowej probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C. Doprowadzić schłodzoną krew do temperatury co najmniej pokojowej przed wystawieniem kleszczy na jej działanie. Odłóż cztery komory na płytkę 6-dołkową, aby ułatwić obsługę komór. Należy unikać większej liczby komór na płytkę, jednak w zależności od wielkości łaźni wodnej można użyć większej liczby płytek.</li>
	<li>Dodać do probówki 5 μl 3 mM ATP i 50 μl 100x zapasu penicyliny/streptomycyny/fungizonu na 5 ml krwi.</li>
	<li>Przenieś 4,5 ml krwi do studzienki z 6-dołkową płytką, a następnie delikatnie umieść komorę w studzience, regulując wysokość O-ringu na komorze tak, aby membrana znajdowała się we krwi, ale poziom krwi po stronie nie wychodził poza studzienkę. Umieść studzienkę we krwi pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza między krwią a błoną. 
	UWAGA: Ukończona tabliczka jest pokazana w Rysunek 2.</li>
	<li>Umieścić pokrywkę płytki 6-dołkowej na górze komór do karmienia, a następnie włożyć płytkę 6-dołkową z komorami do przygotowanej łaźni wodnej o temperaturze 34 °C i zamknąć pokrywę. 
	UWAGA: Pokrywka na górze pomoże zapobiec kontaktowi skondensowanej wody z parafilmem i rozcieńczeniu krwi w studzienkach.</li>
</ol>
3. Utrzymanie żerujących kleszczy poprzez zmianę krwi co 12 godzin
<ol>
	<li>Porcję 5 ml krwi inaktywowanej termicznie na studzienkę do probówki i podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C. W tym samym czasie rozmrozić ATP i penicylinę/streptomycynę/grzyb w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać 5 μl 3 mM ATP i 50 μL 100x zapasu penicyliny/streptomycyny/fungizonu na studzienkę do probówki z krwią. Przenieś 4,5 ml krwi do studzienki świeżej płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Wyjąć 6-dołkową płytkę z komorą na kleszcze z łaźni wodnej. Wyjmij komorę ze studzienki i przepłucz zewnętrzną część komory i membrany 10 ml sterylnego 1x PBS w celu usunięcia krwi.</li>
	<li>Używając autoklawowanej bibuły filtracyjnej, delikatnie osusz membranę i komorę, aby usunąć nadmiar PBS. Wymień parafilm na górze komory. Jeśli w komorze jest dużo kondensacji, osusz mokre miejsca autoklawowaną bibułą filtracyjną przed uszczelnieniem świeżym parafilmem.</li>
	<li>Umieść komorę na kleszcze w nowej 6-dołkowej płytce ze świeżą krwią, w razie potrzeby regulując wysokość O-ringu. Powtórz kroki 3.3-3.5 dla każdej komory na płytce. Umieść pokrywkę płytki 6-dołkowej na wierzchu komór. Przenieść nową płytkę 6-dołkową z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 34 °C.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.1-3.5 co 12 godzin, aż do zakończenia karmienia kleszczy. Poczekaj, aż kleszcze same oderwą się od błony, gdy są nabrzmiałe, lub delikatnie usuń je z błony za pomocą miękkiej w dotyku pęsety, gdy są nadal przyczepione, aby uzyskać częściowo nabrzmiałe kleszcze.</li>
</ol>
4. Leczenie przeciwgrzybicze
UWAGA: Wykonuj tylko wtedy, gdy na membranie widoczny jest wzrost grzyba. Grzyb prawdopodobnie utworzy się po krwi stronie błony, jeśli karmienie trwa wystarczająco długo. Pierwszą oznaką zanieczyszczenia grzybiczego są małe (1-3 mm) płatki skrzepłej krwi widoczne na błonie. W przypadku zauważenia zanieczyszczenia grzybiczego leczenie przeciwgrzybicze może przedłużyć czas trwania eksperymentu i poprawić powodzenie obrzęku.
<ol>
	<li>Rozpuść 10 000 U nystatyny na ml w wodzie destylowanej, 5 ml na komorę karmienia. Sterylizacja filtra za pomocą filtra strzykawkowego 0,1 μm.</li>
	<li>Dodać 5 ml roztworu nystatyny na dołek nowej płytki 6-dołkowej, po jednym dołku na każdą komorę karmienia.</li>
	<li>Umieść komory przepłukane PBS w roztworze. Odstaw na 10 minut.</li>
	<li>Przepłukać poddane działaniu środka błony PBS przed ponownym włożeniem do świeżej krwi.</li>
	<li>Kurację przeciwgrzybiczą należy powtarzać co 2-3 dni (w zależności od stopnia zanieczyszczenia grzybiczego) aż do zakończenia eksperymentu.</li>
</ol>
5. Ponowne przyleganie oderwanych membran za pomocą kleju cyjanoakrylowego
UWAGA: Wykonuj tylko wtedy, gdy zauważy się odłączenie membrany.
<ol>
	<li>Membrany mogą częściowo odczepić się od komór podających, zwłaszcza podczas wyjmowania z płytki 6-dołkowej. Jeśli tak się stanie, przepłucz błonę krwi PBS.</li>
	<li>Delikatnie osusz dotknięty obszar. Nie musi być idealnie suchy, ale obecność wilgoci powoduje, że klej szybciej twardnie. 
	UWAGA: Ponowne przyklejenie membrany ogranicza czas pracy, jednak w zależności od wielkości odklejenia pożądany może być szybszy czas wiązania.</li>
	<li>Wyciśnij niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego w szczelinę, w której membrana odsunęła się od komory. Przytrzymaj w miejscu przez ~2 minuty, aby klej stwardniał.</li>
	<li>Umieść komorę z powrotem we krwi na płytce 6-dołkowej.</li>
</ol>
6. Wytwarzanie fagostymulantu
UWAGA: Wykonaj na końcu kanału lub przed rozpoczęciem podawania membranowego.
<ol>
	<li>Zbierz odchody kleszczy z wcześniejszego pokarmu membranowego lub innego źródła żerowania kleszczy. Przechowywać kał w temperaturze -20 °C przed przygotowaniem fagostymulantu. Zmiażdż granulki kału kleszczy i wymieszaj 0,1 g na 1 ml wody. Dodaj 1 mM glutationu o zredukowanej liczbie tripeptydów, rozpuść i dokładnie wymieszaj przez wirowanie.</li>
	<li>Sterylizacja filtra za pomocą filtra strzykawkowego 0,1 μm.</li>
	<li>Zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.</li>
</ol>

<ol><li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs%3A+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories%2C+2004-2016%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li>
<li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+%28Rhipicephalus+microplus%29+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites & Vectors. 7, 188(2014).</li>
<li>Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+makes+ticks+tick%3F+Climate+change%2C+ticks%2C+and+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li>
<li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Perspectives+on+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232(2009).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+Ticks%22">Biology of Ticks</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li>
<li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li>
<li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910(2018).</li>
<li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li>
<li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+and+Tick-Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li>
<li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li>
<li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li>
<li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+%28Canestrini%2C+1887%29+%28Ixodidae%3A+Acarina%29+on+the+embyonated+hen+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li>
<li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature%2C+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+%28Canestrini%29+larvae+to+skin+slices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li>
<li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li>
<li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+%28Ixodida%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li>
<li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29+by+membrane+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li>
<li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li>
<li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li>
<li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li>
<li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States%2C+2013-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+and+Tick-Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li>
<li>González, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li>
<li>Król, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901(2021).</li>
<li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li>
</ol>

Sztuczne karmienie kleszczy błoną zapewnia użyteczne narzędzie w różnych procedurach eksperymentalnych, ale prawdopodobnie nie zastąpi karmienia zwierząt we wszystkich zastosowaniach. Utrzymywanie dużych kolonii kleszczy na wszystkich etapach życia bez karmienia zwierząt jest generalnie nie do utrzymania. Zamiast tego system sztucznego żywienia jest cenny do innych celów, takich jak zakażanie kleszczy patogenami, które nie są wspierane przez modelowych gospodarzy, ocena wpływu kontrolowanych dawek związków lub mikroorgan...

Choroby przenoszone przez kleszcze silnie wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt na całym świecie, odpowiadając za ponad dwie trzecie wszystkich chorób związanych z wektorami w USA w latach 2004-20161. Ponadto w ostatnich latach rośnie liczba przypadków, a coraz więcej osób i zwierząt gospodarskich jest dotkniętych kleszczami i związanymi z nimi chorobami2,3. Chociaż prawdopodobnie istnieje wiele przyczyn tendencji wzrostowej liczby przypadków, ważnym czynnikiem jest zmieniający się klimat3,4. Przewidywany ciągły wzrost liczby zachorowań na choroby przenoszone przez kleszcze podkreśla potrzebę opracowania nowych narzędzi do badania związków między kleszczami a przenoszonymi przez nie patogenami.
Wiadomo, że u kleszczy zachodzą zmiany w fizjologii i ekspresji genów podczas żerowania i że te zmiany odgrywają rolę w przenoszeniu patogenów5,6. Przeprowadzenie badań, które badają wpływ pełnego i częściowego żywienia na przenoszenie i nabywanie patogenów przy użyciu modeli zwierzęcych, może być trudne, szczególnie w sytuacjach, gdy modele gryzoni nie są podatne na zakażenie określonym patogenem. Na przykład szczep Anaplasma phagocytophilum Variant-1 jest naturalnie przenoszony między Ixodes scapularis a jeleniem, ale nie jest w stanie zainfekować myszy, co komplikuje infekcję kleszczami w lab7. Systemy sztucznego żywienia mogą być również stosowane do badania patogenów, takich jak Borrelia burgdorferi, poprzez wykorzystanie transgenicznych mutantów, które mają delecje genów hamujące transmisję lub infekcję8. Korzystanie ze sztucznego systemu żywienia pomaga naukowcom wyizolować rolę genów, pozwalając na infekcję lub transmisję tylko po stronie kleszcza, izolując w ten sposób wszelką reakcję gospodarza, która może zakłócić takie badania.
Podobnie, niektóre etapy życia kleszczy biorących udział w chorobach i przenoszeniu zwierząt mogą nie być nakłonione do żywienia się popularnymi gatunkami laboratoryjnymi. Samice Ixodes scapularis, na przykład, muszą być karmione większymi zwierzętami, zazwyczaj królikami9. Chociaż często są one dostępne do eksperymentów laboratoryjnych, wymagania administracyjne i hodowlane związane z wykorzystaniem królików przewyższają wymagania dotyczące małych gryzoni i mogą być zaporowe dla niektórych laboratoriów. Inne gatunki kleszczy, szczególnie te o znaczeniu weterynaryjnym, muszą być karmione bydłem lub innymi dużymi zwierzętami, które nie są praktyczne do wykorzystania w większości laboratoriów. Metody żywienia in vitro i infekcji, takie jak karmienie sztuczną błoną, stanowią alternatywę dla wykorzystywania dużych lub egzotycznych zwierząt żywicielskich.
Dodatkowo, użycie systemu sztucznego żywienia pozwala na pewne analizy, które mogą nie być możliwe przy użyciu tradycyjnych metod żywienia zwierząt. Jednym z takich przykładów jest to, że poprzez oddzielenie źródła krwi od mechanizmu karmienia, możliwe staje się zbadanie roli, jaką krew różnych gospodarzy może odgrywać w transmisji B. burgdorferi<sup class="xref">10. To badanie krwi gospodarza i roli, jaką sama krew odgrywa przy braku odpowiedzi immunologicznej gospodarza, jest ważnym czynnikiem w zrozumieniu cykli przenoszenia patogenów i jednym z tych, w których sztuczne systemy żywienia są w stanie pomóc odpowiedzieć11. Możliwe staje się również ilościowe określenie dokładnych liczb transmisji patogenu podczas karmienia, a nie tylko badanie sukcesu transmisji i zadomowienia się w host8,12.
Niektóre z pierwszych sztucznych membran do karmienia dla twardych kleszczy zostały wykonane ze skór zwierzęcych lub membran pochodzenia zwierzęcego w latach 1950. i 196013,14. Ze względu na biologiczny charakter tych membran wystąpiły problemy zarówno z produkcją nowych membran, jak i okresem przydatności do spożycia. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku opracowano w pełni sztuczne membrany, które wykorzystywały podłoże z siatki, papieru lub tkaniny z impregnacją silikonową15,16. Silikon był idealny, ponieważ jego właściwości fizyczne naśladują rozciągliwość skóry i lekką lepkość, a także jego biologiczną naturę. Opierając się na tym, Krober i Guerin, na których pracy opierała się ta technika, opisali technikę karmienia membraną ze sztucznego jedwabiu impregnowaną silikonem do sztucznego karmienia I. ricinus17.
Udoskonalenie metod dla I. scapularis, blisko spokrewnionego gatunku, doprowadziło do zauważalnych różnic w twardości silikonu używanego do impregnacji membran, przepisie produkcji membrany, wymiarach komory i stymulatorze mocowania. Chociaż udoskonalenia zgłoszone w tym badaniu zaowocowały podobnymi cechami membrany, jak te zgłoszone przez Andrade i wsp., którzy również opracowali membranę na bazie silikonu na bazie Krobera i Guerina do stosowania w I. scapularis, istnieje różnica w etapach impregnacji silikonu, co pozwala na elastyczność wykorzystania tego protokołu dla niedojrzałych etapów życia I. scapularis15, 18. W tym badaniu opisano również dodatki i zmiany techniczne oparte na wielokrotnym stosowaniu tej metody, najlepsze praktyki, które skutkują udanym kanałem, oraz rozwiązywanie problemów, które mogą się pojawić. Ta metoda została wykorzystana do karmienia wszystkich aktywnych etapów życia, zakażania kleszczy bakteriami chorobotwórczymi i wystawiania kleszczy na wielokrotne dawki antybiotyków19,20. Podczas gdy przedstawiona metoda karmienia sztuczną błoną dotyczy I. scapularis, metodę tę można łatwo dostosować do innych gatunków kleszczy z niewielkimi modyfikacjami grubości błony.

<table><tbody><tr><td>00-10 Twardość Silikon</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-10</td><td>Rozmiar próbny z Smooth-On Store</td></tr><tr><td>00-50 Twardość Silikon</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-50</td><td>Rozmiar próbny z Smooth-On Store</td></tr><tr><td>30 Twardość Silikonowa</td> forma <td>Smooth-On</td><td>Star 30</td><td>Rozmiar próbny z Smooth-On Store</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Milipore Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td>Służy do sporządzania wodnego roztworu 3 mM ATP, który został wysterylizowany filtrem za pomocą filtra 0,2 mikometru</td></tr><tr><td>HemoStat</td><td>krwi bydlęcej</td><td>DBB500</td><td>Defibrynowany mechanicznie; 500 ml zwykle wystarcza na jeden eksperyment</td></tr><tr><td>Clingwrap</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Fisherbrand</td><td>09-790-2C</td><td>Autoklaw i pozostaw do ostygnięcia przed użyciem. Można użyć dobrej jakości zamiast medium Fluon</td></tr><tr><td>(wodny politetrafluoroetylen)</td><td>Bioquip</td><td>2871</td><td>Dostępne z innych źródeł, takich jak https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td></tr><tr><td>Gliniak glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Millipore Sigma</td><td>139386-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td>100% sztuczny jedwab</td></tr><tr><td>Nystatyna &nbsp;</td><td>Gold Biotechnology</td><td>N-750-10</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisherbrand</td><td>S37440&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna/fungizon</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Lub równoważny generyczny o stężeniu w następujący sposób (10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny oraz 25 &mikro; g/ml amfoterycyny B)</td></tr> <tr><td>Fagostymulant</td><td>wyprodukowany we własnym zakresie</td><td></td><td>Zebrany z poprzednich karm dla kleszczy</td></tr><tr><td>Rura poliwęglanowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K204&nbsp;</td><td>Przyciąć do długości 45 mm, średnicy zewnętrznej 1,25 cala, średnicy wewnętrznej 1 cala. Cięcie wymaga tarczy szlifierskiej z piłą do cięcia.</td></tr><tr><td>O-ringi gumowe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K38&nbsp;</td><td>Grubość 5 mm, średnica wewnętrzna 1,25 cala</td></tr><tr><td>Miękkie kleszczyki</td><td>VWR</td><td>470315-238&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td></td><td></td><td>klej cyjanoakrylowy</td></tr><tr><td>papier Unryu&nbsp;</td><td>Artykuły artystyczne przechowuje</td><td></td><td>włókno morwy 10 g/m2. Zakupiony w sklepie z artykułami artystycznymi Wet Paint, St. Paul, MN, USA</td></tr></tbody></table>

karmienie sztuczną membraną kleszcza dla ixodes scapularis

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Kleszcze i związane z nimi choroby są ważnym tematem badań ze względu na ich obciążenie dla zdrowia publicznego i weterynaryjnego. Jednak wymagania żywieniowe kleszczy zarówno podczas badania, jak i hodowli mogą ograniczać pytania eksperymentalne lub zdolność laboratoriów do badania kleszczy i związanych z nimi patogenów. System żywienia opartego na sztucznej membranie może zmniejszyć te problemy i otworzyć nowe ścieżki badań, które mogły nie być możliwe w przypadku tradycyjnych systemów żywienia zwierząt. Badanie to opisuje system żywienia oparty na sztucznej błonie, który został udoskonalony pod kątem powodzenia karmienia i obrzęku na wszystkich etapach życia Ixodes scapularis. Co więcej, opisany w tym badaniu system karmienia sztuczną błoną może być zmodyfikowany do stosowania z innymi gatunkami kleszczy poprzez proste udoskonalenie pożądanej grubości błony. Korzyści płynące z systemu żywienia opartego na sztucznej membranie są równoważone przez pracochłonność systemu, dodatkowe czynniki środowiskowe, które mogą wpływać na sukces karmienia, oraz potrzebę udoskonalenia techniki dla każdego nowego gatunku i etapu życia kleszczy.

Powodzenie karmienia zależy od tego, czy pożądane jest częściowe, czy pełne znapięcie. Prawidłowo nakarmione osobniki I. scapularis w stadium dorosłym przyjmują kolor stalowoszary i samodzielnie odczepiają się od membrany. Jeżeli jednak osiągną one rozmiar co najmniej ziarna grochu, można je odczepić od membrany pod koniec procesu karmienia. W przypadku stadiów niedorosłych I. scapularis rozmiar w pełni znapiętych kleszczy jest zmienny, a ponieważ – w przeciwieństwie do osobników dorosłych – nie wykazuj...

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Chociaż sztuczne karmienie błonowe było już wcześniej stosowane, nasz protokół jest prostszy do skonfigurowania i można go dostosować do innych gatunków kleszczy z pewnymi modyfikacjami. Główną zaletą karmienia sztuczną membraną jest to, że pozwala na narażenie na patogeny i zabiegi, które mogą nie być możliwe w przypadku karmienia zwierząt. Ten sztuczny system karmienia błoną może być stosowany do innych gatunków stawonogów z pewnymi testami pod kątem idealnych fagostymulantów i modyfikacji idealnej grubości błony.Uzyskanie odpowiedniej grubości membrany wymaga pewnej wprawy. Pamiętaj, aby użyć mikrometru do zmierzenia grubości w kilku miejscach na membranie. Benjamin Cull, doktor habilitowany w naszym laboratorium, pomoże mi zademonstrować tę procedurę.Na początek przetrzyj płaską, nieporowatą powierzchnię, taką jak tafla szkła lub metalowa podstawa stojaka z powłoką ceramiczną 70% etanolu, a następnie przykryj ją pojedynczą warstwą folii. Upewnij się, że folia jest płaska i bez pęcherzyków lub zmarszczek. Przyklej 100% papier do czyszczenia soczewek ze sztucznego jedwabiu do przygotowanej powierzchni.Upewnij się, że jest płaski i lekko napięty taśmą ze wszystkich czterech stron papieru. Przygotuj mieszaninę silikonu o twardości 0010, odmierzając pięć mililitrów każdej części zestawu silikonowego do jednorazowego pojemnika. Lekko wymieszaj dwa płyny i dodaj 1,5 mililitra heksanu.Kontynuuj mieszanie, aż mieszanina będzie jednorodna i dokładnie wymieszana. Użyj małej ściągaczki, aby rozprowadzić mieszankę silikonową na papierze do soczewek i odstawić na minutę, aby upewnić się, że silikon wsiąkł w papier do soczewek. Równomiernie zeskrob nadmiar silikonu na bok za pomocą ściągaczki, używając niewielkiego nacisku w dół.Wykonaj drugie przejście za pomocą ściągaczki bez wywierania nacisku w dół, aby usunąć wszelkie linie silikonu i uzyskać gładką warstwę. Tylko w przypadku larw zanurz górną część komory karmienia w żywicy fluoropolimerowej Fluon kilka razy, pozwalając jej wyschnąć między aplikacjami w celu wytworzenia jednolitej warstwy. Pozostaw membranę do utwardzenia na co najmniej 24 godziny w środowisku wolnym od kurzu, takim jak zamknięta komora bezpieczeństwa chemicznego lub biologicznego.Następnie wymieszaj równe części mieszanki silikonowej A i B, aby przygotować mieszankę silikonu o twardości 30 w celu przymocowania komór do membrany. Zanurz komory poliwęglanowe na około ćwierć cala w mieszance silikonowej, a następnie umieść je na arkuszu membrany, uważając, aby nie zachodzić na żadną z taśm. Pozwól mocującemu silikonowi utwardzić się przez co najmniej 24 godziny.Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć membranę wokół każdej z dołączonych komór, przycinając krawędzie tak, aby mogła gładko zmieścić się w studzience sześciodołkowej płytki bez większego skrobania po bokach. Pozostawić wystarczającą ilość materiału na zewnątrz komory, aby zmaksymalizować dodanie membrany. Wytnij mały kawałek pozostałej membrany z każdego rogu i środka arkusza membrany.Usuń plastikową folię z każdego kawałka i zmierz kawałki za pomocą mikrometru, aby określić średnią grubość membrany. Umieść komory karmienia wraz z jednym O-ringiem na komorę w szklanej zlewce, która ma być autoklawowana w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut w celu sterylizacji. Poczekaj, aż komory ostygną przed ich użyciem.Po wyjęciu wstępnie przygotowanych, autoklawowanych komór membranowych i umieszczeniu wokół nich O-ringu, napełnij każdą komorę wystarczającą ilością 70% etanolu, aby pokryć membranę. Pozostaw go na płytce z sześcioma dołkami na pięć minut, a następnie poszukaj wszelkich nieszczelności między komorą a membraną oraz w samej membranie. Opróżnij etanol z komór, a następnie pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym.Aby podgrzać i aktywować dopełniacz we krwi, podgrzej go w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 40 minut i uzupełnij mechanicznie defibrylowaną krew bydlęcą dwoma gramami na litr glukozy. Po wyschnięciu membrany nałóż około 20 mikrolitrów fagostymulantu do wnętrza komory i przechyl komorę, aby rozprowadzić go po powierzchni. Gdy fagostymulant wyschnie, szybko dodaj kleszcze do komory za pomocą szczoteczki lub kleszczy.Uszczelnij górę parafilmem, ponieważ ciepło z łaźni wodnej może spowodować jej rozerwanie. Następnie dodaj pięć mililitrów ciepła i aktywowaną krew na studzienkę lub komorę do stożkowej rurki i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza. Dodaj pięć mikrolitrów trzymilimolowego ATP i 50 mikrolitrów 100-krotnego zapasu fungizonu penicyliny streptomycyny na pięć mililitrów krwi do probówki i przenieś 4,5 mililitra krwi do studzienki z sześciodołkową płytką.Delikatnie umieść komorę w studzience, regulując wysokość O-ringu na komorze tak, aby membrana znajdowała się we krwi, ale poziom krwi z boku nie wychodził poza studzienkę. Następnie umieść studzienkę we krwi pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza między krwią a błoną. Umieść pokrywę płytki z sześcioma dołkami na górze komór karmienia.Umieść płytkę z sześcioma dołkami z komorami w przygotowanej łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza i pokrywkę. Dodaj pięć mikrolitrów trzech milimolowych ATP i 50 mikrolitrów 100-krotnego zapasu fungizonu penicyliny streptomycyny na studzienkę do probówki z krwią i przenieś 4,5 mililitra krwi do studzienki świeżej sześciodołkowej płytki, jak pokazano wcześniej. Wyjmij sześciodołkową płytkę z komorą na kleszcze z łaźni wodnej i wyjmij komorę ze studzienki.Wypłucz zewnętrzną część komory i membrany 10 mililitrami wysterylizowanego 1X PBS, aby usunąć krew. Używając autoklawowanej bibuły filtracyjnej, delikatnie osusz membranę i komorę, aby usunąć nadmiar PBS. Jeśli w komorze jest dużo kondensacji, osusz mokre miejsca autoklawowaną bibułą filtracyjną przed uszczelnieniem jej świeżym parafilmem.Następnie wymień parafilm na górze komory. Umieść komorę na kleszcze w nowej sześciodołkowej płytce ze świeżą krwią, w razie potrzeby regulując wysokość O-ringu. Powtórz te kroki dla każdej komory na talerzu.Na koniec umieść pokrywę płytki sześciodołkowej na górze komór i przenieś nową płytkę sześciodołkową z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj trwające karmienie z częściowo nabrzmiałymi nimfami ixodes scapularis. Czarne lub brązowe kropki wokół miejsc przyczepienia to szron, który można zebrać podczas i po karmieniu, aby wytworzyć fagostymulant.Częściowo nabrzmiałe nimfy ixodes scapularis są przyczepione do błony. Można tu również zobaczyć łuskę nabrzmiałej pleśni larwowej. Liczby obrzęków kleszczy i masy jaj przedstawiono w tej tabeli.W warunkach eksperymentalnych obrzęku larw i nimfal oprócz suplementów stosowanych w tej technice dodawano homogenat narządów jelenia do krwi. W tym przypadku udany obrzęk zdefiniowano jako albo nabrzmiałe kleszcze, które z powodzeniem linieją do następnego etapu życia, albo nabrzmiałe samice, które z powodzeniem złożyły jaja. Uzyskanie akceptowalnej grubości podczas nakładania silikonu na papier do soczewek wymaga praktyki, dlatego zawsze ważne jest, aby zmierzyć grubość membrany przed użyciem.Karmienie błonowe może narazić kleszcze na działanie patogenów lub antybiotyków. Ich wpływ na aspekty biologii kleszczy, takie jak sukces linienia, składanie jaj i przeżywalność, można ocenić po karmieniu.

tick-artificial-membrane-feeding-for-ixodes-scapularis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

W tym badaniu, system żywienia dla nimfalnych i larwalnych stadiów kleszcza twardego został opracowany za pomocą kapsułki dołączonej do myszy laboratoryjnej. Kapsuła do karmienia jest wykonana z elastycznych materiałów i pozostaje mocno przymocowana do myszy przez co najmniej tydzień i umożliwia wygodne monitorowanie żerowania kleszczy.

Oparty na kapsułkach model do infestacji niedojrzałych stadiów kleszczy twardych na myszach laboratoryjnych

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

W niniejszym filmie zaprezentowano test sprawdzający tolerancję na nikotynę u dwóch rodzajów mszyc: jednej, która żeruje na roślinach tytoniu w polu, oraz drugiej, która tego nie robi.

Badanie tolerancji nikotyny u mszyc z wykorzystaniem eksperymentu z dietą sztuczną

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Poznaj uproszczoną metodę karmienia kleszczy sztuczną membraną dla Ixodes scapularis. Technika umożliwia kontrolowane badanie interakcji patogen-kleszcz bez użycia zwierząt.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Przeglądaj więcej filmów