Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Chociaż sztuczne karmienie błonowe było już wcześniej stosowane, nasz protokół jest prostszy do skonfigurowania i można go dostosować do innych gatunków kleszczy z pewnymi modyfikacjami. Główną zaletą karmienia sztuczną membraną jest to, że pozwala na narażenie na patogeny i zabiegi, które mogą nie być możliwe w przypadku karmienia zwierząt. Ten sztuczny system karmienia błoną może być stosowany do innych gatunków stawonogów z pewnymi testami pod kątem idealnych fagostymulantów i modyfikacji idealnej grubości błony.

Uzyskanie odpowiedniej grubości membrany wymaga pewnej wprawy. Pamiętaj, aby użyć mikrometru do zmierzenia grubości w kilku miejscach na membranie. Benjamin Cull, doktor habilitowany w naszym laboratorium, pomoże mi zademonstrować tę procedurę.

Na początek przetrzyj płaską, nieporowatą powierzchnię, taką jak tafla szkła lub metalowa podstawa stojaka z powłoką ceramiczną 70% etanolu, a następnie przykryj ją pojedynczą warstwą folii. Upewnij się, że folia jest płaska i bez pęcherzyków lub zmarszczek. Przyklej 100% papier do czyszczenia soczewek ze sztucznego jedwabiu do przygotowanej powierzchni.

Upewnij się, że jest płaski i lekko napięty taśmą ze wszystkich czterech stron papieru. Przygotuj mieszaninę silikonu o twardości 0010, odmierzając pięć mililitrów każdej części zestawu silikonowego do jednorazowego pojemnika. Lekko wymieszaj dwa płyny i dodaj 1,5 mililitra heksanu.

Kontynuuj mieszanie, aż mieszanina będzie jednorodna i dokładnie wymieszana. Użyj małej ściągaczki, aby rozprowadzić mieszankę silikonową na papierze do soczewek i odstawić na minutę, aby upewnić się, że silikon wsiąkł w papier do soczewek. Równomiernie zeskrob nadmiar silikonu na bok za pomocą ściągaczki, używając niewielkiego nacisku w dół.

Wykonaj drugie przejście za pomocą ściągaczki bez wywierania nacisku w dół, aby usunąć wszelkie linie silikonu i uzyskać gładką warstwę. Tylko w przypadku larw zanurz górną część komory karmienia w żywicy fluoropolimerowej Fluon kilka razy, pozwalając jej wyschnąć między aplikacjami w celu wytworzenia jednolitej warstwy. Pozostaw membranę do utwardzenia na co najmniej 24 godziny w środowisku wolnym od kurzu, takim jak zamknięta komora bezpieczeństwa chemicznego lub biologicznego.

Następnie wymieszaj równe części mieszanki silikonowej A i B, aby przygotować mieszankę silikonu o twardości 30 w celu przymocowania komór do membrany. Zanurz komory poliwęglanowe na około ćwierć cala w mieszance silikonowej, a następnie umieść je na arkuszu membrany, uważając, aby nie zachodzić na żadną z taśm. Pozwól mocującemu silikonowi utwardzić się przez co najmniej 24 godziny.

Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć membranę wokół każdej z dołączonych komór, przycinając krawędzie tak, aby mogła gładko zmieścić się w studzience sześciodołkowej płytki bez większego skrobania po bokach. Pozostawić wystarczającą ilość materiału na zewnątrz komory, aby zmaksymalizować dodanie membrany. Wytnij mały kawałek pozostałej membrany z każdego rogu i środka arkusza membrany.

Usuń plastikową folię z każdego kawałka i zmierz kawałki za pomocą mikrometru, aby określić średnią grubość membrany. Umieść komory karmienia wraz z jednym O-ringiem na komorę w szklanej zlewce, która ma być autoklawowana w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut w celu sterylizacji. Poczekaj, aż komory ostygną przed ich użyciem.

Po wyjęciu wstępnie przygotowanych, autoklawowanych komór membranowych i umieszczeniu wokół nich O-ringu, napełnij każdą komorę wystarczającą ilością 70% etanolu, aby pokryć membranę. Pozostaw go na płytce z sześcioma dołkami na pięć minut, a następnie poszukaj wszelkich nieszczelności między komorą a membraną oraz w samej membranie. Opróżnij etanol z komór, a następnie pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym.

Aby podgrzać i aktywować dopełniacz we krwi, podgrzej go w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 40 minut i uzupełnij mechanicznie defibrylowaną krew bydlęcą dwoma gramami na litr glukozy. Po wyschnięciu membrany nałóż około 20 mikrolitrów fagostymulantu do wnętrza komory i przechyl komorę, aby rozprowadzić go po powierzchni. Gdy fagostymulant wyschnie, szybko dodaj kleszcze do komory za pomocą szczoteczki lub kleszczy.

Uszczelnij górę parafilmem, ponieważ ciepło z łaźni wodnej może spowodować jej rozerwanie. Następnie dodaj pięć mililitrów ciepła i aktywowaną krew na studzienkę lub komorę do stożkowej rurki i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza. Dodaj pięć mikrolitrów trzymilimolowego ATP i 50 mikrolitrów 100-krotnego zapasu fungizonu penicyliny streptomycyny na pięć mililitrów krwi do probówki i przenieś 4,5 mililitra krwi do studzienki z sześciodołkową płytką.

Delikatnie umieść komorę w studzience, regulując wysokość O-ringu na komorze tak, aby membrana znajdowała się we krwi, ale poziom krwi z boku nie wychodził poza studzienkę. Następnie umieść studzienkę we krwi pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza między krwią a błoną. Umieść pokrywę płytki z sześcioma dołkami na górze komór karmienia.

Umieść płytkę z sześcioma dołkami z komorami w przygotowanej łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza i pokrywkę. Dodaj pięć mikrolitrów trzech milimolowych ATP i 50 mikrolitrów 100-krotnego zapasu fungizonu penicyliny streptomycyny na studzienkę do probówki z krwią i przenieś 4,5 mililitra krwi do studzienki świeżej sześciodołkowej płytki, jak pokazano wcześniej. Wyjmij sześciodołkową płytkę z komorą na kleszcze z łaźni wodnej i wyjmij komorę ze studzienki.

Wypłucz zewnętrzną część komory i membrany 10 mililitrami wysterylizowanego 1X PBS, aby usunąć krew. Używając autoklawowanej bibuły filtracyjnej, delikatnie osusz membranę i komorę, aby usunąć nadmiar PBS. Jeśli w komorze jest dużo kondensacji, osusz mokre miejsca autoklawowaną bibułą filtracyjną przed uszczelnieniem jej świeżym parafilmem.

Następnie wymień parafilm na górze komory. Umieść komorę na kleszcze w nowej sześciodołkowej płytce ze świeżą krwią, w razie potrzeby regulując wysokość O-ringu. Powtórz te kroki dla każdej komory na talerzu.

Na koniec umieść pokrywę płytki sześciodołkowej na górze komór i przenieś nową płytkę sześciodołkową z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj trwające karmienie z częściowo nabrzmiałymi nimfami ixodes scapularis. Czarne lub brązowe kropki wokół miejsc przyczepienia to szron, który można zebrać podczas i po karmieniu, aby wytworzyć fagostymulant.

Częściowo nabrzmiałe nimfy ixodes scapularis są przyczepione do błony. Można tu również zobaczyć łuskę nabrzmiałej pleśni larwowej. Liczby obrzęków kleszczy i masy jaj przedstawiono w tej tabeli.

W warunkach eksperymentalnych obrzęku larw i nimfal oprócz suplementów stosowanych w tej technice dodawano homogenat narządów jelenia do krwi. W tym przypadku udany obrzęk zdefiniowano jako albo nabrzmiałe kleszcze, które z powodzeniem linieją do następnego etapu życia, albo nabrzmiałe samice, które z powodzeniem złożyły jaja. Uzyskanie akceptowalnej grubości podczas nakładania silikonu na papier do soczewek wymaga praktyki, dlatego zawsze ważne jest, aby zmierzyć grubość membrany przed użyciem.

Karmienie błonowe może narazić kleszcze na działanie patogenów lub antybiotyków. Ich wpływ na aspekty biologii kleszczy, takie jak sukces linienia, składanie jaj i przeżywalność, można ocenić po karmieniu.