Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia badanie funkcji komórek macierzystych w różnych mięśniach szkieletowych, pogłębiając nasze zrozumienie tego, w jaki sposób przyczyniają się one do homeostazy, regeneracji i postępu choroby. Za pomocą tego protokołu możemy wyizolować dwie populacje żywych komórek macierzystych z określonych mięśni i zbadać, jak działają. Aby rozpocząć izolację mięśni, spryskaj uśpioną mysz etanolem i umieść ją brzuchem skierowanym do góry.

Za pomocą nożyczek wykonaj poziome nacięcie o długości 0,5 centymetra w skórze brzucha. Obiema rękami pociągnij skórę, aby odsłonić tułów, a także kończyny dolne aż do kończyn tylnych. Zlokalizuj gracilis lub mięsień wewnętrznej strony uda i za pomocą pary zakrzywionych kleszczy chwyć go i lekko unieś mięsień.

Za pomocą nożyczek wykonaj 0,5 centymetra nacięcie, aby wyciąć mięsień gracilis. Powtórz procedurę na drugiej nodze. Za pomocą skalpela przetnij powięź, wykonując 0,5-centymetrowe nacięcie wzdłuż bocznej strony kości piszczelowej.

Następnie chwyć powięź za pomocą zakrzywionych kleszczy i usuń ją, ciągnąc, odsłaniając ścięgna na dystalnym końcu kończyny tylnej. Następnie włóż parę prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami między dystalne ścięgno TA a mięsień EDL. Oddziel mięśnie, przesuwając kleszcze w kierunku bliższego końca mięśni.

Przyłóż kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno. Delikatnie chwyć dystalne ścięgno TA zakrzywionymi kleszczami i unieś mięsień w górę i nad jego bliższym przyczepem. Aby ostrożnie przeciąć ścięgno proksymalne, odetnij drugi koniec najbliżej jego przyczepu i przenieś TA na szalkę Petriego.

Następnie użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby przejść pod dystalnym ścięgnem EDL i przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięśnie od siebie. Przynieś kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno bez uszkadzania mięśnia. Delikatnie chwytając dystalne ścięgno EDL zakrzywionymi kleszczami, podnieś mięsień do góry i nad jego bliższym przyczepem, aby ostrożnie przeciąć ścięgno proksymalne jak najbliżej jego przyczepu.

Odetnij drugi koniec i przenieś mięsień EDL na szalkę Petriego. Powtórz procedurę dla drugiej kończyny tylnej. Użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby dotrzeć między ścięgno Achillesa a dolne kości kończyn tylnych.

Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień od kości. Przyłóż kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno. Pociągnij mięsień brzuchaty łydki lub GA w górę i nad kość strzałkową.

Aby zlokalizować ścięgno proksymalne mięśnia płaszczkowatego. Włóż proste kleszcze między mięśnie płaszczkowate i GA i przesuń kleszcze w kierunku dystalnego końca mięśni, aby oddzielić mięśniowaty od GA. Teraz przetnij ścięgno bliższego mięśnia płaszczkowatego. Chwyć go zakrzywionymi kleszczami i ostrożnie podnieś sous, aby uzyskać dostęp do jego dystalnego ścięgna.

Przeciąć dystalne ścięgno, aby odizolować płaszczkowaty od GA i umieścić płaszczkowaty na szalce Petriego zawierającej pożywkę do mycia. Następnie pokrój GA i umieść go na szalce Petriego. Aby wyizolować mięsień trójgłowy mięśnia dwugłowego, użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby sięgnąć między triceps a kość ramienną i przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień od kości.

Następnie przetnij dystalny koniec mięśnia trójgłowego i za pomocą zakrzywionych kleszczy pociągnij go w górę i nad łokieć, aby uzyskać dostęp do ścięgna proksymalnego. Przetnij ścięgno bliższe tricepsa i przenieś mięsień na szalkę Petriego. Powtórz procedurę dla pozostałych czterech kończyn.

Aby usunąć sierść i skórę ze szczęki, użyj nożyczek, aby wykonać 0,5-centymetrowe nacięcie poniżej oka, tnąc w kierunku ogonowym. Następnie za pomocą kciuków i palców wskazujących obu dłoni uszczypnij po obu stronach nacięcia i usuń skórę, ciągnąc ją w górę i w dół. Zlokalizuj główne ścięgno żwacza po stronie ogonowej poniżej oka i włóż płaskie ostrze skalpela między kość a mięsień, aby przeciąć ścięgno.

Chwyć główne ścięgno żwacza zakrzywionymi kleszczami i przetnij je ostrzem skalpela lub nożyczkami w kierunku rostralnym, aby oddzielić mięsień żwaczy od kości szczęki. Umieść izolowany mięsień żwacza na szalce Petriego i powtórz procedurę dla drugiego mięśnia żwacza. Użyj nożyczek, aby wykonać torakotomię na środku mostka i przeciąć mostek.

Odsłoń membranę, przecinając klatkę piersiową o 360 stopni. Następnie, aby oddzielić górną część ciała od brzucha, użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę, przełyk, żyłę główną i aortę brzuszną. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię jeden centymetr poniżej mostka i wykonaj cięcie o około 360 stopni.

Umieść zamknięte nożyczki między klatką piersiową a narządami jamy brzusznej i dociśnij. Delikatnie pociągnij za klatkę piersiową, aby oddzielić ją od narządów jamy brzusznej. Aby oddzielić membranę od klatki piersiowej, luźno przytrzymaj membranę między dwoma palcami i przetnij klatkę piersiową nożyczkami.

Przyciąć membranę jak najbliżej żeber o około 360 stopni i umieścić odizolowaną membranę na szalce Petriego. Zmiel izolowane mięśnie jeden po drugim, krojąc je na kawałki o wielkości około jednego milimetra. Przenieś zmielone mięśnie do 15-litrowej stożkowej probówki zawierającej pięć litrów buforu dysocjacyjnego i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 35 minut w wytrząsającej łaźni wodnej z prędkością 60 obrotów na minutę.

Po enzymatycznym strawieniu rozdrobnionych mięśni przenieś zawiesinę z tubki o pojemności 15 mililitrów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Używając 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20, ponownie zawiesić próbkę, przeciągając ją pięć razy w górę iw dół przez igłę. Wciągnąć zawiesinę komórek do strzykawki i przecedzić próbkę do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, wyposażonej w sitko do komórek na górze.

Aby odzyskać wszystkie komórki jednojądrzaste, umyj pustą stożkową probówkę 20 mililitrami pożywki płuczącej i przelej ją przez sitko w celu połączenia z odcedzoną próbką. Odzyskaj pozostałą objętość pod sitkiem za pomocą pipety P1000. Po dysocjacji tkanek i barwieniu przeciwciałami, komórki macierzyste mięśni szkieletowych lub MuSC i progenitory fibroadipogenne lub FAP z poszczególnych mięśni oczyszczono przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.

Po wstępnym bramkowaniu w celu zidentyfikowania komórek i oddzielenia podkoszulków od dubletów, kolejne bramki ustawiono za pomocą kontroli FMO w celu zidentyfikowania progów barwienia. Próbka barwienia została bramkowana, a populacja SCA1 dodatnia CD31 ujemna i CD45 ujemna odpowiadająca FAP została posortowana do oddzielnej probówki zbiorczej. Populacja podwójnie ujemna została następnie bramkowana w celu posortowania populacji dodatniej VCA odpowiadającej MuSC.

Zawiesiny pojedynczych komórek przepony i mięśnia trójgłowego, w przeciwieństwie do pozostałych, miały wyższą względną obfitość MuSC niż FAP. Barwienie EDU, choć solidne, wykazało różnicę we frakcjach komórek EDU dodatnich dla dwóch typów komórek macierzystych i w różnych mięśniach. Jednak dla wszystkich tkanek średnia frakcja dodatnich dla EDU MuSC była wyższa niż dla EDU dodatnich FAP.

MuSC wyizolowane z EDL i GA wykazywały znacznie niższą inkorporację EDU w porównaniu z tymi z TA, przepony, gracilis lub triceps. Podobnie, znaczne różnice w włączaniu EDU zaobserwowano również w FAP izolowanych z różnych mięśni. Ostatecznie czystość komórek potwierdzono barwieniem immunofluorescencyjnym, co wskazuje na specyfikę protokołu izolacji komórek macierzystych.

Najważniejszym etapem jest mechaniczne trawienie tkanki. Kiedy tkanka jest zbyt mocno przecięta, żywotność spada. Gdy tkanka jest cięta zbyt mało, EEL zmniejsza się.

Protokół można połączyć z testami, które mierzą zachowanie komórek, takimi jak wszczepienie po przeszczepie, aby lepiej zrozumieć funkcje komórek macierzystych in vivo. Technika ta może odpowiedzieć na pytanie, czy różnice w zachowaniu komórek macierzystych w obrębie poszczególnych mięśni mogą przyczyniać się do fenotypów chorobowych i chorób charakteryzujących się unikalnymi wzorcami dotkniętych mięśni.