Name: Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych mięśni i progenitorów fibro-adipogenicznych z poszczególnych mięśni szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia badanie homeostazy, regeneracji i progresji chorób mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sortowanie komórek zostało przeprowadzone w FACS Core Facility, Aarhus University, Dania. Figury zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Dziękujemy dr J. Farupowi za podzielenie się króliczym przeciwciałem anty-PDGFRa. Prace te zostały wsparte grantem AUFF Starting Grant dla E.P. oraz grantami Start Package od NovoNordiskFonden dla E.P. (0071113) i A.D.M. (0071116).

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>Fukada, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124(2007).</li>
<li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476(2011).</li>
<li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem%2Fprecursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li>
<li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li>
<li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li>
<li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases%3A+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832(2019).</li>
<li>Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036(2015).</li>
<li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li>
<li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li>
<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani nie pozostają w konflikcie interesów.

W realizacji tego protokołu kluczowe jest kilka kroków, aby osiągnąć dobre plony. Poszczególne mięśnie mają małą objętość w porównaniu z ilością mięśni używanych w protokołach izolacji masowej. Powoduje to ryzyko wysuszenia mięśnia podczas rozwarstwienia, co zmniejsza wydajność. Aby temu zapobiec, ważne jest, aby dodać pożywkę do mięśni natychmiast po rozbiorze. Ponadto, jeśli sekcja trwa dłużej, skórę można usuwać z jednej kończyny na raz, aby skrócić czas ekspozycji mięśni na powietrze. Mniejsza objętość powoduje równi...

Mięśnie szkieletowe mają wysoką zdolność do regeneracji dzięki obecności komórek macierzystych mięśni (MuSCs). MuSC znajdują się na włóknach mięśniowych, pod blaszką podstawną i znajdują się w stanie spoczynku przedłużonego, odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego1,2,3,4. Po uszkodzeniu, MuSC aktywują się i wchodzą w cykl komórkowy, dając początek amplifikującym się progenitorom, które mogą różnicować się i łączyć, tworząc nowe włókna mięśniowe2,5. Wcześniejsze prace wykazały, że MuSC są absolutnie niezbędne do regeneracji mięśni6,7,8. Co więcej, pojedynczy MuSC może wszczepiać i generować zarówno nowe komórki macierzyste, jak i nowe włókna mięśniowe9. Mięśnie szkieletowe zawierają również populację mezenchymalnych komórek zrębowych zwanych włóknisto-adipogennymi komórkami progenitorowymi (FAPs), które odgrywają kluczową rolę we wspieraniu funkcji MuSC podczas regeneracji mięśni6,10,11,12.
Ze względu na ich potencjał do koordynowania regeneracji mięśni, pojawiło się ogromne zainteresowanie zrozumieniem, jak działają MuSC i FAP. Spoczynkowe MuSC są oznaczone ekspresją czynników transkrypcyjnych Pax7 i Sprouty1 oraz receptora kalcytoniny białka powierzchniowego komórki, podczas gdy spoczynkowe FAP są oznaczone przez receptor alfa płytkowego czynnika wzrostu białka powierzchniowego na powierzchni komórki (PDGFRa)10,12,13,14,15. Wcześniejsze badania wykazały, że MuSC i FAP można oczyścić z mięśni szkieletowych za pomocą markerów powierzchni komórek i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Chociaż protokoły te znacznie rozwinęły możliwości badania MuSC i FAP, jedną z wad jest to, że większość z tych protokołów wymaga izolacji MuSC z puli różnych tkanek mięśniowych. Ostatnie prace przeprowadzone przez nas i innych naukowców ujawniły różnice w fenotypie komórki i poziomach ekspresji genów między MuSC wyizolowanymi z różnych tkanek22,23. MuSC z przepony, tricepsa i gracilis wykazują szybszą aktywację niż MuSC z mięśni dolnych kończyn tylnych22, podczas gdy MuSC z mięśnia zewnątrzgałkowego wykazują szybsze różnicowanie niż MuSC z przepony i dolnych mięśni kończyn tylnych23.
Ten protokół opisuje izolację MuSC i FAP od poszczególnych mięśni szkieletowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Obejmuje to rozwarstwienie przepony, tricepsa, gracilis, piszczela przedniego (TA), płaszczkowatego, prostownika długiego palca (EDL), mięśnia brzuchatego łydki (GA) i mięśni żwaczy. Wypreparowane mięśnie są następnie dysocjowane przez trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy II (proteazy, która specyficznie celuje w sekwencję aminową Pro-X-Gly-Pro w kolagenie, umożliwiając degradację tkanki łącznej i dysocjację tkanek24) i dispazę (proteazę, która rozszczepia fibronektynę i kolagen IV, umożliwiając dalszą dysocjację komórek25). MuSC i FAP są izolowane z zawiesin jednokomórkowych za pomocą FACS. Jako przykłady dalszych testów do analizy komórek, aktywację komórek macierzystych określa się przez oznaczenie inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), podczas gdy czystość komórek określa się przez barwienie immunofluorescencyjne dla markerów specyficznych dla typu komórki Pax7 i PDGFRa.

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml (testowana pod kątem wydajności PCR, PP, 30 000 xg, bez DNA/DNazy/RNazy, niskie wiązanie DNA, sterylna)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>Probówka 1,5 ml</td></tr><tr><td>Probówka 15 ml (PP/HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczne, wolne od pirogenów, sterylne)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>Probówka</td></tr> <tr><td>15 mlProbówka okrągłodenna z polistyrenu o pojemności 5 ml</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>Probówka FACS bez nasadki sitka</td></tr><tr><td>5 ml polistyrenu Probówka okrągłodenna z nakrętką sitka Falcon</td><td>, Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>352235</td><td>Probówka FACS z nasadką sitka</td></tr><tr><td>Probówka 5 ml (PP, niesterylna autoklawowalna)</td> <td>Kolekcja VWR</td><td>525.0946</td><td>Probówka 5 ml</td></tr><tr><td>50 ml (PP / HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNazy/RNazy, niecytotoksyczna, wolna od pirogenów, sterylna)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>Probówka 50 ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 IgG przeciw królikowi osłowi (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 osioł-anty mysz IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, Główny zakład Wirówka uniwersytecka w Aarhus</td></tr><tr><td>5810</td><td>eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Zestaw do proliferacji komórek do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>Zestaw do proliferacji komórek</td></tr><tr><td>Kolagen ze skóry cielęcej&nbsp;</td><td>Bioodczynnik, Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Źródło: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Numer działki: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>Collagenase</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td><td>Dispase</td></tr><tr><td>Donkey surowica (niesterylna)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>Kleszcze proste z cienkimi końcówkami</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>Kleszcze</td></tr> <tr><td>zakrzywioneF-10 Mieszanka odżywcza (Szynka) (1x), +L-glutamina</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2453614 (kat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysz CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp; &nbsp;</td><td>K44104563 9Kot # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>Głowica nad głową rotator mini-tube&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>15534080 (Model nr 88861052)</td><td>Rotator z minirurką nad głową</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td> Mini-shaker do <td>kąpieli wodnej</td></tr><tr><td>MS2&nbsp;</td><td>IKA&nbsp;</td><td></td><td>Jednostka wirowa</td></tr><tr><td>Igła 20 G (0,9 mm x 25 mm)</td><td>BD mikrolance, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Igła 304827</td><td>20G&nbsp;</td></tr><tr><td>Neutralny bufor formalinowy 10%</td><td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>Partia: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>Niepirogenne sitko do komórek (40 &mikro; M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>Sitko do komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Pacific Blue anty-myszy Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 pierwotne przeciwciało</td><td>DSHB</td><td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x koncentrat w proszku</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-mysie CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM. A) (Kat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet p10</td><td>Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>Końcówki do pipet o niskiej retencji, wstępnie sterylizowane, Końcówki do</td></tr><tr><td>pipet p1000</td><td>Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet p20</td><td>Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet p200</td><td>Końcówki artystyczne, bariera samouszczelniająca, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>Niska retencja, wstępnie sterylizowane, końcówki filtrujące</td></tr><tr><td>Podkład ochronny</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp; 60 x 40 cm, 8 warstw</td></tr><tr><td>Rainin, pipet-lite XLS</td><td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>Pipety (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>Rekombinowany anty-PDGFR-alfa</td><td>RabMAb, abcam</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel (trzonek nr 3)</td><td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.502</td><td>Skalpel</td></tr><tr><td>Ostrze do skalpela nr 11</td><td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.0911</td><td>Skalpel</td></tr><tr><td>Scanlaf mars</td><td>Labogene</td><td>Szafka klasy 2: Skaner laboratoryjny Mars</td><td>Flow</td></tr><tr><td>ScanR</td><td>Olympus</td><td></td><td>, Główny obiekt Uniwersytet w Aarhus</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Seria 8000 Inkubator DH</td><td>Thermo Scientific</td><td>3540-MAR</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Sterylna, niepirogenna</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 5 ml</td><td>VWR, Avantor dostarczone przez VWR</td><td>612-3702</td><td>Sterylna, niepirogenna</td></tr><tr><td>strzykawka 5 mL, końcówka Luer (6%), sterylna&nbsp;</td><td>BD Emerald, Fisher Scientific</td><td>307731</td><td>Strzykawka</td></tr><tr><td>TC Dish 100, standard</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3902</td><td>Szalka Petriego&nbsp;</td></tr><tr><td>Powierzchnia poddana kulturze tkankowej (TC), polistyren, płaskie dno, sterylna, pokrywka, opakowanie 20 sztuk</td><td>Corning, Sigma Aldrich</td><td>3764</td><td>96-dołkowa półdolna płyta</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Źródło: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Mięśnie szkieletowe zawierają odrębne populacje dorosłych komórek macierzystych, które przyczyniają się do homeostazy i naprawy tkanki. Komórki macierzyste mięśni szkieletowych (MuSC) mają zdolność do tworzenia nowych mięśni, podczas gdy komórki progenitorowe fibro-adipogenne (FAP) przyczyniają się do rozwoju tkanek podporowych zrębu i mają zdolność do tworzenia fibroblastów i adipocytów. Zarówno MuSC, jak i FAP znajdują się w stanie przedłużonego odwracalnego wyjścia z cyklu komórkowego, zwanego spoczynkiem. Stan spoczynku jest kluczem do ich funkcjonowania. Spokojne komórki macierzyste są zwykle oczyszczane z wielu tkanek mięśniowych połączonych razem w jednej próbce. Jednak ostatnie badania wykazały wyraźne różnice w profilach molekularnych i głębokości spoczynku MuSC wyizolowanych z różnych mięśni. Niniejszy protokół opisuje izolację i badanie MuSC i FAP z poszczególnych mięśni szkieletowych oraz przedstawia strategie przeprowadzania analizy molekularnej aktywacji komórek macierzystych. Szczegółowo opisuje, jak izolować i trawić mięśnie o różnym pochodzeniu rozwojowym, grubości i funkcji, takie jak przepona, triceps, gracilis, piszczel przednia (TA), brzuchaty łydki (GA), płaszczkowaty, prostownik palca długiego (EDL) i mięśnie żwaczy. MuSC i FAP są oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analizowane przez barwienie immunofluorescencyjne i test inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU).

Zgodnie z protokołem izolacji poszczególnych mięśni szkieletowych (Rysunek 2), mięśnie smukły, piszczelowy przedni (TA), prostownik długi palców (EDL), brzuchaty (GA), płaszczkowaty, trójgłowy, żwacz oraz przepona zostały wyizolowane od trzech samców myszy szwajcarskich z linii outbred, które zostały wycofane z lokalnego programu hodowlanego (Rysunek 2). Po dysocjacji tkanek i barwieniu przeciwciałami, komórki satelitarne mięśni (MuSCs) oraz komórki progenitorow...

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia badanie funkcji komórek macierzystych w różnych mięśniach szkieletowych, pogłębiając nasze zrozumienie tego, w jaki sposób przyczyniają się one do homeostazy, regeneracji i postępu choroby. Za pomocą tego protokołu możemy wyizolować dwie populacje żywych komórek macierzystych z określonych mięśni i zbadać, jak działają. Aby rozpocząć izolację mięśni, spryskaj uśpioną mysz etanolem i umieść ją brzuchem skierowanym do góry.Za pomocą nożyczek wykonaj poziome nacięcie o długości 0,5 centymetra w skórze brzucha. Obiema rękami pociągnij skórę, aby odsłonić tułów, a także kończyny dolne aż do kończyn tylnych. Zlokalizuj gracilis lub mięsień wewnętrznej strony uda i za pomocą pary zakrzywionych kleszczy chwyć go i lekko unieś mięsień.Za pomocą nożyczek wykonaj 0,5 centymetra nacięcie, aby wyciąć mięsień gracilis. Powtórz procedurę na drugiej nodze. Za pomocą skalpela przetnij powięź, wykonując 0,5-centymetrowe nacięcie wzdłuż bocznej strony kości piszczelowej.Następnie chwyć powięź za pomocą zakrzywionych kleszczy i usuń ją, ciągnąc, odsłaniając ścięgna na dystalnym końcu kończyny tylnej. Następnie włóż parę prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami między dystalne ścięgno TA a mięsień EDL. Oddziel mięśnie, przesuwając kleszcze w kierunku bliższego końca mięśni.Przyłóż kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno. Delikatnie chwyć dystalne ścięgno TA zakrzywionymi kleszczami i unieś mięsień w górę i nad jego bliższym przyczepem. Aby ostrożnie przeciąć ścięgno proksymalne, odetnij drugi koniec najbliżej jego przyczepu i przenieś TA na szalkę Petriego.Następnie użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby przejść pod dystalnym ścięgnem EDL i przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięśnie od siebie. Przynieś kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno bez uszkadzania mięśnia. Delikatnie chwytając dystalne ścięgno EDL zakrzywionymi kleszczami, podnieś mięsień do góry i nad jego bliższym przyczepem, aby ostrożnie przeciąć ścięgno proksymalne jak najbliżej jego przyczepu.Odetnij drugi koniec i przenieś mięsień EDL na szalkę Petriego. Powtórz procedurę dla drugiej kończyny tylnej. Użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby dotrzeć między ścięgno Achillesa a dolne kości kończyn tylnych.Przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień od kości. Przyłóż kleszcze z powrotem do dystalnego końca i przetnij dystalne ścięgno. Pociągnij mięsień brzuchaty łydki lub GA w górę i nad kość strzałkową.Aby zlokalizować ścięgno proksymalne mięśnia płaszczkowatego. Włóż proste kleszcze między mięśnie płaszczkowate i GA i przesuń kleszcze w kierunku dystalnego końca mięśni, aby oddzielić mięśniowaty od GA. Teraz przetnij ścięgno bliższego mięśnia płaszczkowatego. Chwyć go zakrzywionymi kleszczami i ostrożnie podnieś sous, aby uzyskać dostęp do jego dystalnego ścięgna.Przeciąć dystalne ścięgno, aby odizolować płaszczkowaty od GA i umieścić płaszczkowaty na szalce Petriego zawierającej pożywkę do mycia. Następnie pokrój GA i umieść go na szalce Petriego. Aby wyizolować mięsień trójgłowy mięśnia dwugłowego, użyj prostych kleszczy z bardzo cienkimi końcówkami, aby sięgnąć między triceps a kość ramienną i przesuń kleszcze w kierunku bliższego końca mięśnia, aby oddzielić mięsień od kości.Następnie przetnij dystalny koniec mięśnia trójgłowego i za pomocą zakrzywionych kleszczy pociągnij go w górę i nad łokieć, aby uzyskać dostęp do ścięgna proksymalnego. Przetnij ścięgno bliższe tricepsa i przenieś mięsień na szalkę Petriego. Powtórz procedurę dla pozostałych czterech kończyn.Aby usunąć sierść i skórę ze szczęki, użyj nożyczek, aby wykonać 0,5-centymetrowe nacięcie poniżej oka, tnąc w kierunku ogonowym. Następnie za pomocą kciuków i palców wskazujących obu dłoni uszczypnij po obu stronach nacięcia i usuń skórę, ciągnąc ją w górę i w dół. Zlokalizuj główne ścięgno żwacza po stronie ogonowej poniżej oka i włóż płaskie ostrze skalpela między kość a mięsień, aby przeciąć ścięgno.Chwyć główne ścięgno żwacza zakrzywionymi kleszczami i przetnij je ostrzem skalpela lub nożyczkami w kierunku rostralnym, aby oddzielić mięsień żwaczy od kości szczęki. Umieść izolowany mięsień żwacza na szalce Petriego i powtórz procedurę dla drugiego mięśnia żwacza. Użyj nożyczek, aby wykonać torakotomię na środku mostka i przeciąć mostek.Odsłoń membranę, przecinając klatkę piersiową o 360 stopni. Następnie, aby oddzielić górną część ciała od brzucha, użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę, przełyk, żyłę główną i aortę brzuszną. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię jeden centymetr poniżej mostka i wykonaj cięcie o około 360 stopni.Umieść zamknięte nożyczki między klatką piersiową a narządami jamy brzusznej i dociśnij. Delikatnie pociągnij za klatkę piersiową, aby oddzielić ją od narządów jamy brzusznej. Aby oddzielić membranę od klatki piersiowej, luźno przytrzymaj membranę między dwoma palcami i przetnij klatkę piersiową nożyczkami.Przyciąć membranę jak najbliżej żeber o około 360 stopni i umieścić odizolowaną membranę na szalce Petriego. Zmiel izolowane mięśnie jeden po drugim, krojąc je na kawałki o wielkości około jednego milimetra. Przenieś zmielone mięśnie do 15-litrowej stożkowej probówki zawierającej pięć litrów buforu dysocjacyjnego i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 35 minut w wytrząsającej łaźni wodnej z prędkością 60 obrotów na minutę.Po enzymatycznym strawieniu rozdrobnionych mięśni przenieś zawiesinę z tubki o pojemności 15 mililitrów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Używając 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20, ponownie zawiesić próbkę, przeciągając ją pięć razy w górę iw dół przez igłę. Wciągnąć zawiesinę komórek do strzykawki i przecedzić próbkę do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, wyposażonej w sitko do komórek na górze.Aby odzyskać wszystkie komórki jednojądrzaste, umyj pustą stożkową probówkę 20 mililitrami pożywki płuczącej i przelej ją przez sitko w celu połączenia z odcedzoną próbką. Odzyskaj pozostałą objętość pod sitkiem za pomocą pipety P1000. Po dysocjacji tkanek i barwieniu przeciwciałami, komórki macierzyste mięśni szkieletowych lub MuSC i progenitory fibroadipogenne lub FAP z poszczególnych mięśni oczyszczono przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.Po wstępnym bramkowaniu w celu zidentyfikowania komórek i oddzielenia podkoszulków od dubletów, kolejne bramki ustawiono za pomocą kontroli FMO w celu zidentyfikowania progów barwienia. Próbka barwienia została bramkowana, a populacja SCA1 dodatnia CD31 ujemna i CD45 ujemna odpowiadająca FAP została posortowana do oddzielnej probówki zbiorczej. Populacja podwójnie ujemna została następnie bramkowana w celu posortowania populacji dodatniej VCA odpowiadającej MuSC.Zawiesiny pojedynczych komórek przepony i mięśnia trójgłowego, w przeciwieństwie do pozostałych, miały wyższą względną obfitość MuSC niż FAP. Barwienie EDU, choć solidne, wykazało różnicę we frakcjach komórek EDU dodatnich dla dwóch typów komórek macierzystych i w różnych mięśniach. Jednak dla wszystkich tkanek średnia frakcja dodatnich dla EDU MuSC była wyższa niż dla EDU dodatnich FAP.MuSC wyizolowane z EDL i GA wykazywały znacznie niższą inkorporację EDU w porównaniu z tymi z TA, przepony, gracilis lub triceps. Podobnie, znaczne różnice w włączaniu EDU zaobserwowano również w FAP izolowanych z różnych mięśni. Ostatecznie czystość komórek potwierdzono barwieniem immunofluorescencyjnym, co wskazuje na specyfikę protokołu izolacji komórek macierzystych.Najważniejszym etapem jest mechaniczne trawienie tkanki. Kiedy tkanka jest zbyt mocno przecięta, żywotność spada. Gdy tkanka jest cięta zbyt mało, EEL zmniejsza się.Protokół można połączyć z testami, które mierzą zachowanie komórek, takimi jak wszczepienie po przeszczepie, aby lepiej zrozumieć funkcje komórek macierzystych in vivo. Technika ta może odpowiedzieć na pytanie, czy różnice w zachowaniu komórek macierzystych w obrębie poszczególnych mięśni mogą przyczyniać się do fenotypów chorobowych i chorób charakteryzujących się unikalnymi wzorcami dotkniętych mięśni.

isolation-quiescent-stem-cell-populations-from-individual-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych mięśni i progenitorów fibro-adipogenicznych z poszczególnych mięśni szkieletowych myszy. Technika ta umożliwia badanie homeostazy, regeneracji i progresji chorób mięśniowych.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów