Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

Badania funkcjonalne genów riketsji mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w patogenezie, dlatego potrzebujemy niezawodnych metod zmiany genów w kontrolowany sposób. Nasz protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzenia egzogennego DNA do obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych z rodzaju Rickettsia, co pozwala nam badać efekty wprowadzonego DNA. Procedurę zademonstruje dziś wraz ze mną Lisa Price, badaczka z laboratorium dr Munderloh i dr Kurtti.

Na początek przygotuj hodowlę komórkową ISE6 zakażoną w 90 do 100% Rickettsia parkeri, jak opisano w tekście. Następnie, w celu określenia szybkości infekcji przez barwienie Giemsa, należy rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 z kompletną pożywką i umieścić 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na szklanym szkiełku mikroskopowym przez odwirowanie przy 113 G przez pięć minut. Po pozostawieniu szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, utrwal je w absolutnym metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj szkiełko i barwienie Giemsa przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie opłucz szkiełko w wodzie, a po wyschnięciu obejrzyj je pod mikroskopem świetlnym z obiektywami olejowymi. Określ procent zainfekowanych komórek, licząc zainfekowane i niezainfekowane komórki.

Aby przygotować bezkomórkową Rickettsia parkeri, wlej około 0,2 mililitra sterylnego ziarna z węglika krzemu od 60 do 90 do 90 do dwóch dwumililitrowych sterylnych probówek do mikrowirówek i odłóż probówki na bok. Z uprzednio zaszczepionej kolby zakażonej Rickettsia parkeri zawierającej pięć mililitrów pożywki należy usunąć dwa mililitry pożywki, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. Następnie ponownie zawieś komórki z pozostałymi trzema mililitrami pożywki.

Podziel tę zawiesinę równo między dwie przygotowane rurki z węglika krzemu i wiruj rurkę z dużą prędkością przez 30 sekund. Następnie umieść je na lodzie. Następnie przygotuj sterylną pięciomililitrową strzykawkę typu luer lock, wysuwając tłok i wkładając końcówkę tłoka do polistyrenowej podstawy służącej do trzymania 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Używając barierowej dwumililitrowej pipety Pasteura obsługiwanej za pomocą gumowej gruszki, ostrożnie usuń supernatant z komórek wirowych bez zasysania piasku. Następnie włożyć końcówkę pipety do otworu piasty strzykawki i delikatnie wyrzucić zawartość do strzykawki. Następnie przefiltruj kulturę Rickettsia parkeri do sterylnych 1,5-mililitrowych probówek przez sterylny filtr o wielkości porów o wielkości dwóch mikrometrów zamontowany na piaście strzykawki i odwiruj probówki przy 13 600 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Po usunięciu supernatantu przemyć osad komórkowy dwa razy 1,2 mililitra 300-milimolowego lodowatego roztworu sacharozy. Odwirować próbkę i usunąć supernatant między płukaniami. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić zebrany osad komórkowy z 100 do 150 mikrolitrami lodowatego roztworu sacharozy, aby uzyskać odpowiednio dwie do trzech próbek transformacyjnych.

Następnie podzielić próbkę na podwielokrotności o pojemności 50 mikrolitrów we wstępnie schłodzonych, sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 mikrolitra. Do przemiany w trzech mikrogramach wolnego od endotoksyn plazmidowego DNA pRAM18sSFA do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów Rickettsia parkeri na lodzie i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety do elektroporacji z odstępem 0,1 centymetra.

Delikatnie postukaj w kuwetę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubować na lodzie przez 10 do 30 minut. W międzyczasie usuń pożywkę z w pełni zlewającej się wcześniej hodowanej kolby do hodowli komórkowej ISE6 i ponownie zawieś warstwę komórkową, delikatnie przepłukując komórki 1,5 mililitra świeżej pożywki zawierającej wodorowęglan sodu i bufor HEPES. Po wytworzeniu jednorodnej zawiesiny komórek przenieś całą objętość do jednej sterylnej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Następnie należy elektroporować mieszaninę Rickettsia parkeri i plazmidowego DNA za pomocą elektroporatora. Po elektroporacji użyj sterylnej, przedłużonej pipety z cienką końcówką, aby przenieść niewielką ilość zawiesiny ogniw ISE6 do kuwety i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby odzyskać elektroporowaną Rickettsia parkeri. Następnie przenieść zawartość kuwety do dwumililitrowej probówki zawierającej pozostałą część zawiesiny komórek ISE6.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze pokojowej, najpierw w temperaturze 700 G przez dwie minuty, aby ściągnąć komórki ISE6, a następnie w temperaturze 13, 600 G przez jedną minutę, aby ściągnąć riketsję. Inkubować probówkę w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 15 minut do jednej godziny. Po inkubacji przenieść zawieszoną zawartość jednej przemiany do jednej kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej 3,5 mililitra świeżej pożywki z wodorowęglanem sodu i buforem HEPES.

Kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Po upływie 16 do 24 godzin dodać po 10 mikrolitrów spektynomycyny i streptomycyny do inkubowanej kolby. Rozbujaj kolbę, aby równomiernie wymieszać antybiotyki z pożywką przed powrotem kolby do inkubatora.

Pomyślne rozmnażanie komórek Rickettsia parkeri i ISE6 typu dzikiego było widoczne dzięki barwieniu Giemsa. Widoczne są jądra komórek ISE6 zabarwione na ciemnofioletowo Giemsa zarówno w wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych Rickettsi. Transformację Rickettsia parkeri wykazującą ekspresję białka czerwonej fluorescencji w komórkach ISE6 potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej po siedmiu dniach inkubacji.

Znaczny wzrost liczby zakażeń zaobserwowano po 10 dniach. Utrzymuj wszystko w sterylności podczas całej procedury. Zwracaj uwagę na szczegóły i bądź cierpliwy, ponieważ niektóre gatunki riketsji potrzebują dużo czasu, aby się przekształcić, zwłaszcza wolno rosnące endosymbionty.

Protokół ten umożliwił badanie wielu aspektów biologii riketsji i ich interakcji z wektorami stawonogów i żywicielami ssaków. Na przykład fluorescencyjne Rickettsi wyrażające białka zostały wykorzystane do śledzenia ruchliwości i interakcji symbiontycznych komórek kleszczowych.