Name: Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji do transformacji Rickettsia parkeri z wykorzystaniem fluorescencyjnego wektora plazmidowego w liniach komórkowych kleszczy. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów i patogenezy tych bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Timothy'emu J. Kurttiemu i Benjaminowi Cullowi za ich wnikliwe dyskusje i sugestie. Badanie to było wspierane finansowo przez grant dla U.G.M. z NIH (2R01AI049424) oraz grant dla U.G.M. z Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Rozmnażanie i oczyszczanie R. parkeri z hodowli komórek kleszczowych
UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej mają być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek kleszczowych zakażonych R. parkeri
	<ol>
		Hoduj komórki ISE6 w 25 cm 2 kolbach hodowlanych w temperaturze 34 °C w 5 ml L15C300 pożywce17, uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5% bulionem fosforanu tryptozy (TPB) i 0,1% koncentratem lipoprotein (LPC). <li>
		UWAGA: ISE6 (linia komórkowa pochodząca z zarodka Ixodes scapularis) to linia komórek kleszcza szeroko stosowana w wielu laboratoriach i dlatego jest niezbędnym modelem do badania interakcji kleszcz-patogen17,18,19. Tempo wzrostu komórek ISE6 jest wolniejsze niż komórek ssaków, a czas podwojenia populacji wynosi ≥72 godziny. Na przykład komórki ISE6 podkultywowane ze 100% zlewającej się kultury w stosunku 1:5 potrzebują 3-4 tygodni, aby odzyskać 100% zbieżności. Zdrowe komórki ISE6 będą na ogół zaokrąglone z licznymi przylegającymi włóknami17.</li>
		<li>Policz komórki ISE6 za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym. Stosować w stężeniu ~106 komórek/ml (100% zlewa).
		<ol>
			<li>Delikatnie przepłukać komórki z kolby pożywką i rozproszyć komórki przez pipetowanie w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Dodać 20 μl zawiesiny komórek między hemocytometrem a szkłem nakrywkowym, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać R. parkeri20 (średnia liczba: 5 × 10 7-10 × 107) do kultur komórkowych ISE6 w kolbach do hodowlikomórkowych o średnicy 2 cm. Inkubować zakażone hodowle komórek R. parkeri w temperaturze 34 °C w 5 ml kompletnej pożywki składającej się z L15C300 pożywki, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 25 mM HEPES, aż 90%-100% komórek zostanie zakażonych. 
		UWAGA: Szybkość infekcji R. parkeri w komórkach ISE6 jest określana przez barwienie Giemsa, a czas inkubacji do osiągnięcia 90%-100% infekcji waha się średnio od 5 dni do 7 dni.</li>
		<li>Określ wskaźnik infekcji za pomocą barwienia Giemsa.
		<ol>
			<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego ponownie zawiesić zakażone kultury komórkowe i przenieść 50 μl zawiesiny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Rozcieńczyć zawiesinę pełną pożywką (rozcieńczenie 1:5) i odwirować 100 μl na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą wirówki o stężeniu 113 × g przez 5 minut. Aby utrzymać przy życiu R. parkeri w środku, należy użyć wirówki z szczelnym wirnikiem, który jest przeznaczony do wyjęcia z wirówki. Umożliwia to transport uszczelnionego wirnika do i z maski. 
			UWAGA: Ponieważ R. parkeri są nadal żywe przed odwirowaniem, próbka musi być przechowywana do momentu zabicia riketsji. W związku z tym wirówka używana do obracania kultury R. parkeri na szkiełku musi mieć szczelny wirnik, który jest przeznaczony do wyjmowania z wirówki. Z wirnikiem w pokrywie z przepływem laminarnym, załaduj próbki do zespołu szkiełka lejkowo-mikroskopowego, ponownie uszczelnij wirnik i umieść uszczelniony wirnik z powrotem w wirówce. Następnie włącz wirówkę, a próbki są umieszczane na szkiełkach mikroskopowych. Po zakończeniu cyklu wyjmij uszczelniony wirnik z wirówki i umieść go w pokrywie z przepływem laminarnym. Tam otwórz pokrywę wirnika i rozładuj zespół szkiełka lejkowo-mikroskopowego wewnątrz maski. Po wyschnięciu zanurz szklane szkiełka mikroskopowe w absolutnym metanolu, który zabija wszystkie patogeny. Lejki i metalowe nośniki są zanurzone w rozcieńczonym DMQ, który zabija R. parkeri.</li>
			<li>Wysuszyć szkiełka na powietrzu i utrwalić w metanolu absolutnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
			<li>Zabarwić szkiełka barwnikiem Giemsa (4% w buforze Sørensona, pH 6,6) przez 30 min w temperaturze 37 °C i spłukiwać wodą przez 5 s.</li>
			<li>Określ procent infekcji (liczbę komórek zakażonych riketsjami/100 komórek) za pomocą mikroskopii świetlnej. 
			UWAGA: Rysunek 1 pokazuje typowe wyniki barwienia Giemsy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bezkomórkowego R. parkeri 
	UWAGA: Gdy 90%-100% komórek w hodowli jest zainfekowanych, riketsje należy wyizolować z komórek ISE6 i przeprowadzić elektroporację.
	<ol>
		<li>Dodać sterylny ziarnisty węglik krzemu 60-90 do sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml do objętości około 0,2 ml.</li>
		<li>Usunąć 2 ml pożywki ze 100% kultur zakażonych R. parkeri (krok 1.1.3) i ponownie zawiesić komórki w pozostałych 3 ml pożywki.</li>
		<li>Przenieść równe porcje tej zawiesiny do probówek przygotowanych w kroku 1.2.1.</li>
		<li>Wiruj każdą rurkę z dużą prędkością przez 30 sekund, a następnie umieść rurki na lodzie. Niech piasek osiądzie w ciągu kilku sekund pod wpływem grawitacji.</li>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przygotuj sterylną strzykawkę Luer-lock o pojemności 5 ml z wysuniętym tłokiem i końcem tłoka zabezpieczonym w polistyrenowej podstawie dla stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Używając sterylnej zaporowej końcówki pipety o pojemności 1 ml zamontowanej na odpowiednim pipetorze, usunąć sklarowany przez nią sklarowany wir lizatu komórkowego z probówki, uważając, aby nie zassać ziarna. Włożyć końcówkę pipety do otworu piasty strzykawki i delikatnie wysunąć zawartość do strzykawki. Alternatywnie można użyć sterylnej, barierowej pipety Pasteura o pojemności 2 ml obsługiwanej za pomocą gumowej gruszki.</li>
		<li>Podłącz wysterylizowany filtr o wielkości porów 2 μm do piasty strzykawki i przefiltruj kulturę R. parkeri z kroku 1.2.6 do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Zebrać R. parkeri przez odwirowanie w temperaturze 13 600 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1,2 ml lodowatej sacharozy o objętości 300 mM i ponownie odwirować w temperaturze 13 600 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórzyć ponowne zawieszenie i odwirowanie, w sumie dwa razy przemycia sacharozy.</li>
		<li>Połącz granulki R. parkeri w jedną schłodzoną, sterylną probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w 50 μl lodowatej sacharozy o sacharozie 300 mM na transformację. Ponieważ jedna kolba o średnicy 25cm2 R. parkeri zapewnia wystarczającą ilość riketsji na dwie do trzech przemian, dodaj 100-150 μl 300 mM zimnej sacharozy. 
		UWAGA: W razie potrzeby liczbę riketsji można obliczyć za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera. Przy użyciu początkowej inokulacji 5 × 107 -10 × 107 bezkomórkowego R. parkeri, osiągnięcie 90%-100% infekcji zajmie średnio 5-7 dni, dając około 5 × 107-10 ×10 10 bezkomórkowego R. parkeri.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić granulkę przez pipetowanie, aż do całkowitego rozproszenia. Podzielić próbkę na porcje o objętości 50 μl w schłodzonych, sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: W razie potrzeby żywotność riketsjową można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu barwnikiem fluorescencyjnym 21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transformacja R. parkeri za pomocą plazmidu pRAM18dSFA
<ol>
	<li>Na lodzie dodaj 3 μg wolnego od endotoksyn plazmidu pRAM18dSFA DNA13,15,20 do każdej probówki zawierającej 50 μl zawiesiny R. parkeri i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj mieszaninę końcówką pipety. 
	UWAGA: Przygotowując DNA plazmidowe, użyj zestawu do oczyszczania, który zawiera etap usuwania endotoksyny, aby uzyskać DNA plazmidu wolne od endotoksyn23. Stwierdziliśmy, że zakres stężeń plazmidu od 1 μg do 3 μg na 50 μl zawiesiny R. parkeri skutkował udanymi transformacjami, podczas gdy zwiększenie ilości plazmidu do 10 μg hamowało transformację.</li>
	<li>Przenieś powyższą mieszaninę DNA i R. parkeri do schłodzonej, sterylnej kuwety do elektroporacji o szczelinie 0,1 cm (delikatnie postukaj w kuwetę, aż mieszanina zostanie równomiernie rozprowadzona) i pozostaw na lodzie na 10-30 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę ze 100% zlewającej się hodowli komórek ISE6 i ponownie zawiesić warstwy komórek w 1,5 ml świeżej pożywki zNaHCO3 i buforem HEPES (opisanym powyżej w kroku 1.1.3). Użyj jednej kolby z konfluentnymi komórkami na transformację.</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml (jedna probówka na 25 cm2 kolby komórek ISE6).</li>
	<li>Elektroporować mieszaninę R. parkeri/pRAM18dSFA przy napięciu 1,8 KV, 200 omów, 25 μF za pomocą elektroporatora.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej, przedłużonej pipety z cienką końcówką przenieś niewielką ilość zawiesiny komórek ISE6 (krok 2.4) do kuwety i delikatnie pociągnij płyn w górę iw dół, aby wypłukać kuwetę. Przenieść mieszaninę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej pozostałą zawiesinę komórek ISE6 i delikatnie wymieszać mieszaninę transformacyjną z komórkami.</li>
	<li>Odwirować przekształcone próbki o masie 700 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zwiększyć prędkość wirowania do 13 600 × g przez 1 minutę więcej przy RT. 
	UWAGA: Dwie prędkości wirowania sprzyjają wiązaniu riketsjowemu i wnikaniu do komórek: 700 × g służy do ściągania komórek ISE6, podczas gdy 13 600 × g służy do ściągania riketsji.</li>
	<li>Próbki należy pozostawić w temperaturze pokojowej lub temperaturze 34 °C na 15 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Ponownie zawiesić transformanty (dwa lub trzy) w komórkach ISE6 za pomocą sterylnej 2 ml zaporowej końcówki pipety umieszczonej na pipetorze i przenieść do dwóch lub trzech 25 cm 2-komórkowych kolb hodowlanych zawierających 3,5 ml świeżej pożywki z NaHCO3 i buforem HEPES. Alternatywnie można użyć sterylnej, barierowej pipety Pasteura o pojemności 2 ml obsługiwanej za pomocą gumowej gruszki.</li>
	<li>Rozprowadzić mieszaninę w celu równomiernego rozprowadzenia kolb, a następnie inkubować w temperaturze 34 °C.</li>
	<li>Po 16-24 godzinach dodać 10 μl spektynomycyny (50 mg/ml) i 10 μl streptomycyny (50 mg/ml) do każdej kolby w kroku 2.10.</li>
</ol>
3. Obserwacja przekształconego R. parkeri
UWAGA: Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrami rodaminy/TRITC, aby obserwować kolby przygotowane w kroku 2.11 po 3-7 dniach. Po pojawieniu się blaszek miażdżycowych w kulturach (5-14 dni) można zaobserwować przekształcony R. parkeri, który wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego mKATE, kodowanego na plazmidzie pRAM18dSFA.
<ol>
	<li>Mikroskopia konfokalna
	<ol>
		<li>Zawiesić hodowle komórkowe z kolb kroku 2.11 i wymieszać 100 μl tych kultur komórkowych z 5 μl roztworu Hoechst 33342 przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
		UWAGA: Hoechst 33342 jest przepuszczalnym dla komórek barwnikiem jądrowym, który wiąże się z żywym DNA komórek kleszczowych i emituje niebieską fluorescencję.</li>
		<li>Odwirować 50 μl mieszaniny na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą wirówki o stężeniu 5 × g przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 3 μl 1x PBS do miejsca komórek osadzonych na szkiełku, nałożyć szkiełko nakrywkowe i obejrzeć za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw 60x). Do obrazowania fluorescencyjnego należy stosować następujące parametry wzbudzenia i emisji: dla 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI), wzbudzenie przy 350 nm, emisja przy 470 nm; dla tetrametylorodaminy (TRITC), wzbudzenie przy 557 nm, emisja przy 576 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+rickettsial+evolution%3A+Insight+from+Rickettsia+felis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266(2007).</li>
<li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures%3A+How+tree-like+is+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Biology%22%5BJournal%5D)">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li>
<li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+rickettsioses+around+the+world%3A+Emerging+diseases+challenging+old+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li>
<li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li>
<li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).</li>
<li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+species+%28as+organisms%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li>
<li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+rickettsiae%3A+A+preview%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li>
<li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+diversity+of+Rickettsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria%3A+Progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li>
<li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li>
<li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li>
<li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511(2011).</li>
<li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310(2012).</li>
<li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li>
<li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).</li>
<li>Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li>
<li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+%28black-legged+tick%29+ISE6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li>
<li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).</li>
<li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li>
<li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE%2FDEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li>
<li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li>
<li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+buchneri+sp.+nov.%2C+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).</li>
<li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li>
<li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li>
<li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+%28Acari%3A+Argasidae%3A+Ornithodorinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li>
<li>Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Tutaj demonstrujemy metodę wprowadzania egzogennego DNA kodowanego na plazmidzie wahadłowym pRAM18dSFA do riketsji za pomocą elektroporacji. W tej procedurze riketsje bezkomórkowe zostały oczyszczone z komórek gospodarza, przekształcone za pomocą riketsjalnego wektora wahadłowego i uwolnione do komórek kleszczowych w celu infekcji. Opisano również procedurę immunofluorescencji konfokalnej w celu wykrycia R . parkeri wykazującego ekspresję białka czerwonej fluorescencji w komórkach kleszcza. Podobne metody mają z...

Riketsjozy są wywoływane przez szeroki zakres obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych, które należą do rodzaju Rickettsia (rodzina Rickettsiaceae, rząd Rickettsiales). Rodzaj Rickettsia jest podzielony na cztery główne grupy w oparciu o cechy filogenetyczne1,2: grupa gorączki plamistej (SFG), która zawiera te riketsje, które powodują najcięższe i najbardziej śmiertelne riketsjozy przenoszone przez kleszcze (np. Rickettsia rickettsii, czynnik wywołujący gorączkę plamistą Gór Skalistych), grupę tyfusu plamistego (TG, np. Rickettsia prowazekii, czynnik wywołujący tyfus epidemiczny), grupę przejściową (TRG, np. Rickettsia felis, czynnik wywołujący gorączkę plamistą przenoszoną przez pchły) i grupę przodków (AG, np. Rickettsia bellii).
Wśród najstarszych znanych chorób przenoszonych przez wektory, riketsjozy są głównie nabywane w wyniku przeniesienia patogenów przez ukąszenia zakażonych wektorów stawonogów, w tym kleszczy, pcheł, i roztoczy3,4. Chociaż odkrycie skutecznych antybiotyków poprawiło wyniki leczenia, pojawiające się i powracające riketsjozy epidemiczne nadal stanowią wyzwanie dla tradycyjnych strategii zapobiegania i kontroli. W związku z tym kompleksowe zrozumienie interakcji riketsja/gospodarz/wektor ostatecznie stworzyłoby solidne podstawy do opracowania nowych podejść do zapobiegania i leczenia tych starożytnych chorób.
W naturze horyzontalny transfer genów (HGT) u bakterii zachodzi poprzez koniugację, transdukcję i transformację5. Transformacja bakteryjna in vitro wykorzystuje te koncepcje HGT, chociaż wewnątrzkomórkowy charakter riketsji stanowi pewne wyzwanie. Ograniczone warunki wzrostu oraz słabo poznane systemy koniugacji i transdukcji u różnych gatunków riketsji uniemożliwiły zastosowanie metod koniugacji i transdukcji w rickettsiae6,7,8. W porównaniu z innymi obligatoryjnymi wewnątrzkomórkowymi rodzajami bakterii (np. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma i Ehrlichia), rodzaj Rickettsia różni się pod względem strategii wzrostu i replikacji w cytoplazmie komórki, co nakłada szczególne wyzwania na modyfikację genetyczną riketsji ze względu na ich unikalne cechy stylu życia9.
Pierwszą przeszkodą do pokonania podczas próby genetycznej modyfikacji riketsji jest osiągnięcie udanej transformacji. W związku z tym zaprojektowanie wykonalnego podejścia o wysokiej wydajności transformacji byłoby niezwykle cenne dla opracowania narzędzi genetycznych dla riketsji. Tutaj skupiamy się na elektroporacji, szeroko uznanej metodzie transformacji, która została wykorzystana do pomyślnego wprowadzenia egzogennego DNA do kilku gatunków riketsji, w tym Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii i Rickettsia buchneri10,11,12,13,14,15,16.
Ten artykuł opisuje procedurę elektroporacji szczepu R. parkeri Tate's Hell (dostęp: GCA_000965145.1) za pomocą wektora wahadłowego pRAM18dSFA pochodzącego z plazmidu pRAM18 szczepu Rickettsia amblyommatis AaR/SC zaprojektowanego do kodowania mKATE, białka fluorescencyjnego dalekiej czerwieni, oraz aadA, nadając odporność na spektynomycynę i streptomycynę 13,15,20. Przekształcone R. parkeri są żywotne i stabilnie utrzymywane pod wpływem selekcji antybiotyków w liniach komórkowych kleszczy. Ponadto pokazujemy, że lokalizacja przekształconego R. parkeri w żywych komórkach kleszcza za pomocą mikroskopii konfokalnej może być wykorzystana do oceny jakości szybkości przemian w wektorowych liniach komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Kuweta elektroporacyjna z impulsem genowym 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m Filtr wielkości porów&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>6783-2520</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Luer-lock 5 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>60-90 ziarnistość węglika krzemu&nbsp;</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>Metanol absolutny&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td></td></tr><tr><td>Bulion z fosforanu tryptozy baktoowej&nbsp;</td><td>BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Cytospin Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Wirnik jest odłączany, dzięki czemu cały wirnik można włożyć do maski w celu załadowania próbek zakaźnych</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>służy do otrzymywania pRAM18dSFA</td></tr><tr><td>plazmid przedłużony pipeta transferowa z cienką końcówką&nbsp;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>Partia FBS musi zostać przetestowana, aby upewnić się, że komórki ISE6 będą w niej dobrze rosły.</td></tr><tr><td>Elektroporator Gene Pulser II z kontrolerem impulsów PLUS</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105 i 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fidżi</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia</td><td></td> edycja <td>surowych obrazów</td></tr><tr><td>KaryoMAX Plama Giemsa&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td></tr><tr><td>koncentrat lipoprotein&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>191476</td><td></td></tr><tr><td>Diafot Nikon Mikroskop</td><td>epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser Komora Licząca</td><td>Hausser Scientific</td><td>&nbsp; Komora 3900</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda elektroporacji do transformacji rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Riketsjozy są wywoływane przez szeroki zakres obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych należących do rodzaju Rickettsia, które mogą być przenoszone na kręgowców poprzez ugryzienie zakażonych wektorów stawonogów. Do tej pory pojawiające się lub powracające riketsjozy epidemiczne pozostają zagrożeniem dla zdrowia publicznego ze względu na trudności w diagnozie, ponieważ metody diagnostyczne są ograniczone i nie są ustandaryzowane ani powszechnie dostępne. Błędna diagnoza wynikająca z braku rozpoznania oznak i objawów może skutkować opóźnionym antybiotykoleczeniem i złymi wynikami zdrowotnymi. Kompleksowe zrozumienie charakterystyki riketsji ostatecznie poprawiłoby diagnostykę kliniczną, ocenę i leczenie dzięki lepszej kontroli i zapobieganiu chorobie. 
Badania funkcjonalne genów riketsjowych są kluczowe dla zrozumienia ich roli w patogenezie. W pracy opisano procedurę elektroporacji szczepu Rickettsia parkeri Tate's Hell za pomocą wektora wahadłowego pRAM18dSFA oraz selekcji transformowanego R. parkeri w hodowli komórek kleszczowych za pomocą antybiotyków (spektynomycyny i streptomycyny). Opisano również metodę lokalizacji przekształconego R. parkeri w komórkach kleszcza za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej, przydatnej techniki sprawdzania transformacji w wektorowych liniach komórkowych. Podobne podejścia są również odpowiednie do transformacji innych riketsji.

Morfologia R. parkeri w komórkach ISE6 pod mikroskopem świetlnym po barwieniu metodą Giemsy przedstawiona jest na Ryc. 1. Na Ryc. 2, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, pokazano przekształcone R. parkeri wykazujące ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego w komórkach ISE6. Widoczny jest znaczny wzrost stopnia infekcji przekształconych R. parkeri (kolor czerwony) w komórkach ISE6 (kolor niebieski, odpowiada jądrom komórkowym) od (...

Elektroporacja to szybka, szeroko stosowana metoda wprowadzania egzogennego DNA do rodzaju Rickettsia. Protokół ten zapewnia użyteczną metodę elektroporacji do transformacji obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych w rodzaju Rickettsia.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Badania funkcjonalne genów riketsji mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w patogenezie, dlatego potrzebujemy niezawodnych metod zmiany genów w kontrolowany sposób. Nasz protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzenia egzogennego DNA do obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych z rodzaju Rickettsia, co pozwala nam badać efekty wprowadzonego DNA. Procedurę zademonstruje dziś wraz ze mną Lisa Price, badaczka z laboratorium dr Munderloh i dr Kurtti.Na początek przygotuj hodowlę komórkową ISE6 zakażoną w 90 do 100% Rickettsia parkeri, jak opisano w tekście. Następnie, w celu określenia szybkości infekcji przez barwienie Giemsa, należy rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 z kompletną pożywką i umieścić 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na szklanym szkiełku mikroskopowym przez odwirowanie przy 113 G przez pięć minut. Po pozostawieniu szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, utrwal je w absolutnym metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj szkiełko i barwienie Giemsa przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie opłucz szkiełko w wodzie, a po wyschnięciu obejrzyj je pod mikroskopem świetlnym z obiektywami olejowymi. Określ procent zainfekowanych komórek, licząc zainfekowane i niezainfekowane komórki.Aby przygotować bezkomórkową Rickettsia parkeri, wlej około 0,2 mililitra sterylnego ziarna z węglika krzemu od 60 do 90 do 90 do dwóch dwumililitrowych sterylnych probówek do mikrowirówek i odłóż probówki na bok. Z uprzednio zaszczepionej kolby zakażonej Rickettsia parkeri zawierającej pięć mililitrów pożywki należy usunąć dwa mililitry pożywki, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. Następnie ponownie zawieś komórki z pozostałymi trzema mililitrami pożywki.Podziel tę zawiesinę równo między dwie przygotowane rurki z węglika krzemu i wiruj rurkę z dużą prędkością przez 30 sekund. Następnie umieść je na lodzie. Następnie przygotuj sterylną pięciomililitrową strzykawkę typu luer lock, wysuwając tłok i wkładając końcówkę tłoka do polistyrenowej podstawy służącej do trzymania 15-mililitrowych stożkowych probówek.Używając barierowej dwumililitrowej pipety Pasteura obsługiwanej za pomocą gumowej gruszki, ostrożnie usuń supernatant z komórek wirowych bez zasysania piasku. Następnie włożyć końcówkę pipety do otworu piasty strzykawki i delikatnie wyrzucić zawartość do strzykawki. Następnie przefiltruj kulturę Rickettsia parkeri do sterylnych 1,5-mililitrowych probówek przez sterylny filtr o wielkości porów o wielkości dwóch mikrometrów zamontowany na piaście strzykawki i odwiruj probówki przy 13 600 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Po usunięciu supernatantu przemyć osad komórkowy dwa razy 1,2 mililitra 300-milimolowego lodowatego roztworu sacharozy. Odwirować próbkę i usunąć supernatant między płukaniami. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić zebrany osad komórkowy z 100 do 150 mikrolitrami lodowatego roztworu sacharozy, aby uzyskać odpowiednio dwie do trzech próbek transformacyjnych.Następnie podzielić próbkę na podwielokrotności o pojemności 50 mikrolitrów we wstępnie schłodzonych, sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 mikrolitra. Do przemiany w trzech mikrogramach wolnego od endotoksyn plazmidowego DNA pRAM18sSFA do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów Rickettsia parkeri na lodzie i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety do elektroporacji z odstępem 0,1 centymetra.Delikatnie postukaj w kuwetę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubować na lodzie przez 10 do 30 minut. W międzyczasie usuń pożywkę z w pełni zlewającej się wcześniej hodowanej kolby do hodowli komórkowej ISE6 i ponownie zawieś warstwę komórkową, delikatnie przepłukując komórki 1,5 mililitra świeżej pożywki zawierającej wodorowęglan sodu i bufor HEPES. Po wytworzeniu jednorodnej zawiesiny komórek przenieś całą objętość do jednej sterylnej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Następnie należy elektroporować mieszaninę Rickettsia parkeri i plazmidowego DNA za pomocą elektroporatora. Po elektroporacji użyj sterylnej, przedłużonej pipety z cienką końcówką, aby przenieść niewielką ilość zawiesiny ogniw ISE6 do kuwety i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby odzyskać elektroporowaną Rickettsia parkeri. Następnie przenieść zawartość kuwety do dwumililitrowej probówki zawierającej pozostałą część zawiesiny komórek ISE6.Następnie odwirować próbkę w temperaturze pokojowej, najpierw w temperaturze 700 G przez dwie minuty, aby ściągnąć komórki ISE6, a następnie w temperaturze 13, 600 G przez jedną minutę, aby ściągnąć riketsję. Inkubować probówkę w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 15 minut do jednej godziny. Po inkubacji przenieść zawieszoną zawartość jednej przemiany do jednej kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej 3,5 mililitra świeżej pożywki z wodorowęglanem sodu i buforem HEPES.Kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Po upływie 16 do 24 godzin dodać po 10 mikrolitrów spektynomycyny i streptomycyny do inkubowanej kolby. Rozbujaj kolbę, aby równomiernie wymieszać antybiotyki z pożywką przed powrotem kolby do inkubatora.Pomyślne rozmnażanie komórek Rickettsia parkeri i ISE6 typu dzikiego było widoczne dzięki barwieniu Giemsa. Widoczne są jądra komórek ISE6 zabarwione na ciemnofioletowo Giemsa zarówno w wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych Rickettsi. Transformację Rickettsia parkeri wykazującą ekspresję białka czerwonej fluorescencji w komórkach ISE6 potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej po siedmiu dniach inkubacji.Znaczny wzrost liczby zakażeń zaobserwowano po 10 dniach. Utrzymuj wszystko w sterylności podczas całej procedury. Zwracaj uwagę na szczegóły i bądź cierpliwy, ponieważ niektóre gatunki riketsji potrzebują dużo czasu, aby się przekształcić, zwłaszcza wolno rosnące endosymbionty.Protokół ten umożliwił badanie wielu aspektów biologii riketsji i ich interakcji z wektorami stawonogów i żywicielami ssaków. Na przykład fluorescencyjne Rickettsi wyrażające białka zostały wykorzystane do śledzenia ruchliwości i interakcji symbiontycznych komórek kleszczowych.

an-electroporation-method-to-transform-rickettsia-spp-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Źródło: Aigrain, L. i in. Internalizacja i obserwacja fluorescencyjnych biomolekuł w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji.  J. Vis. Exp. (2015)Film pokazuje dostarczanie fluorescencyjnych biomolekuł do elektrokompetentnych komórek mikrobiologicznych za pomocą elektroporacji. Proces rozpoczyna się od wprowadzenia DNA lub białek oznaczonych fluoroforem do schłodzonej zawiesiny komórkowej. Następnie stosuje się impuls wysokiego napięcia, aby utworzyć tymczasowe pory błonowe,...

Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Ten film demonstruje technikę elektroporacji, która wprowadza plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne do prekursorów pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku myszy.

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

W tym filmie opisujemy nukleofekcję, procedurę transfekcji opartą na elektroporacji, polegającą na dostarczeniu fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do sporozoitowej formy pasożyta Eimeria kurczaka.

Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

W tym filmie pokazujemy wprowadzanie białek efektorowych bakterii do komórek ssaków za pomocą elektroporacji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja bakteryjnych białek efektorowych jest wykrywana za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do komórek ssaków za pomocą elektroporacji

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Obecny protokół opisuje metodę wstrzykiwania zarodków kleszczy. Wstrzyknięcie zarodka jest preferowaną techniką manipulacji genetycznej w celu wytworzenia linii transgenicznych.

Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Poznaj metodę elektroporacji do transformacji Rickettsia parkeri z wykorzystaniem fluorescencyjnego wektora plazmidowego w liniach komórkowych kleszczy. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów i patogenezy tych bakterii.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy (Wideo) | JoVE Journal

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

Przeglądaj więcej filmów