In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Okrągłe RNA odgrywają ważną rolę regulacyjną w różnych procesach biologicznych. Protokół ten jest odpowiedni dla początkujących do przeprowadzania cyrkularnej analizy RNA w obszarze interakcji gospodarza i patogenu. W tym miejscu zestawiliśmy kilka narzędzi, aby stworzyć uproszczony protokół wymagany do bezpiecznego przewidywania i kwantyfikacji RNA, bezpiecznego wzbogacania funkcjonalnego RNA, bezpiecznego RNA, przewidywania interakcji mikro-RNA i konstrukcji sieci RNA CCE.

Ten usprawniający protokół można zastosować do próbek klinicznych w celu identyfikacji określonych kandydatów, wartości diagnostycznych i prognostycznych, w warunkach interakcji gospodarza i patogenu. Spodziewam się, że ci, którzy nie mają wcześniejszej wiedzy programistycznej, będą mieli trudności z wykonaniem początkowej fazy tej techniki. Dlatego radziłbym zapoznać się z podstawami języków programowania używanych w tej technice.

Uważam, że zwykle patrzenie na to, jak język programowania jest stosowany, jest bardziej pouczający i łatwiejszy do zrozumienia w porównaniu z samym czytaniem. Aby rozpocząć, otwórz terminal Linux i w katalogu genomu referencyjnego hosta wykonaj polecenia bwa index i hisat2-build, aby zindeksować genom. Przygotuj plik konfiguracyjny yml zawierający nazwę pliku, ścieżkę do narzędzi, ścieżkę do pobranych plików referencyjnych oraz ścieżkę do plików indeksu.

Określ typ biblioteki danych sekwencji RNA i uruchom narzędzie Ciriquant przy użyciu parametrów domyślnych lub ręcznych. Przygotuj plik tekstowy z listą danych zawierających identyfikatory danych sekwencji RNA, ścieżkę do plików GTF wyprowadzanych przez Ciriquant oraz grupowanie danych sekwencji RNA, niezależnie od tego, czy jest to grupa kontrolna, czy poddana działaniu substancji. Na terminalu Linux uruchom prep_Ciriquant z przygotowanym plikiem tekstowym jako danymi wejściowymi.

Ten przebieg spowoduje wygenerowanie listy plików. Przygotuj drugi plik tekstowy z listą danych zawierających identyfikatory sekwencji RNA i ścieżkę do odpowiedniego wyjścia wiązania ciągu. Układ pliku musi być podobny do wcześniej przygotowanego pliku tekstowego bez uruchomienia kolumny grupowania.

Uruchom prepde. py z tym plikiem tekstowym jako danymi wejściowymi, aby wygenerować pliki macierzy liczby genów. Wykonaj Ciri_DE_Replicate za pomocą library_info.

Pliki csv, circRNA_BSJ. csv i gene_count_matrix. csv jako dane wejściowe do wyprowadzania końcowej circRNA_DE.

Plik TSV. Aby przefiltrować i określić liczbę circRNA o zróżnicowanej ekspresji lub DE, otwórz circRNA_DE. tsv za pomocą R lub innego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.

Rozpakuj i rozpakuj zawartość pliku CircR po pobraniu go ze strony CircR GitHub za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak WinRar lub 7-Zip. Do nowego katalogu, w którym zostanie przeprowadzona analiza. Następnie zainstaluj wstępnie wymagane aplikacje, takie jak SAMTools, miRanda, RNAhybrid i Pybedtools przed przeprowadzeniem analizy miRNA circRNA.

Zindeksuj plik genomu referencyjnego interesującego organizmu za pomocą polecenia SAMtools FAIDX i przygotuj plik wejściowy składający się ze współrzędnych interesujących DE circRNA w pliku łóżkowym rozdzielanym tabulatorami. Następnie wykonaj polecenie Circr. py przy użyciu Python3.

A jako argumenty określają plik wejściowy circRNA, szybszy genom interesującego nas organizmu, wersję genomu wybranego organizmu, liczbę wątków i nazwę pliku wyjściowego w wierszu poleceń. Po zakończeniu analizy Circr program generuje plik interakcji circRNA-miRNA w formacie CSV. Przygotuj plik rozdzielany tabulatorami zawierający interesujące Cię circRNA i ich docelowe miRNA.

Pierwsza kolumna składa się z nazwy circRNA. Druga kolumna określa typ RNA z pierwszej kolumny. Trzecia kolumna to docelowe miRNA.

Czwarta kolumna określa typ RNA z trzeciej kolumny. Aby skonstruować mapę sieci ceRNA, otwórz oprogramowanie Cytoscape, przejdź do pliku, importuj, sieci z pliku, wybierz przygotowany plik i prześlij go. Naciśnij przycisk stylu, aby zmienić styl wizualny sieci.

Następnie naciśnij strzałkę po prawej stronie koloru wypełnienia, wybierz typ kolumny, dyskretne mapowanie dla typu mapowania i wybierz żądany kolor dla każdego typu RNA. Następnie przejdź do kształtu, aby zmienić kształt węzłów i wykonaj czynności pokazane wcześniej. W przypadku ontologii genów i analizy KEGG genu rodzicielskiego circRNA, upewnij się, że profiler klastrów i organizacja. Hs.eg.

Pakiety DB zostały zainstalowane w naszym studiu. Zaimportuj informacje circRNA DE do obszaru roboczego programu R Studio. Jeśli użytkownik chce przekonwertować nazwy genów rodzicielskich na inne formaty, takie jak entrezid, użyj funkcji, takiej jak bidder.

Użyj identyfikatora genu jako danych wejściowych i uruchom analizę ontologii genów i wzbogacenia przy użyciu funkcji enrichGO w profilu klastra lub pakiecie przy użyciu parametrów domyślnych. Na koniec uruchom analizę wzbogacania KEGG, używając identyfikatora genu jako danych wejściowych i funkcji enrichKEGG w pakiecie profilera klastrów. Wykres bąbelkowy analizy wzbogacenia ontologii genów genów rodzicielskich circRNA DE pokazano na tym rysunku.

Stosunek genów na osi x to liczba genów na tej liście wejściowej związanej z danym terminem ontologii genów podzielona przez całkowitą liczbę genów w tym terminie. Rozmiar kropki na wykresie jest reprezentowany przez wartość liczby, która jest liczbą genów na liście wejściowej powiązanych z danym terminem ontologii genu. Im większy rozmiar kropek, tym większa liczba genów wejściowych związanych z tym terminem.

Kropki na wykresie są oznaczone kolorami na podstawie wartości p, która jest obliczana przez porównanie obserwowanej częstości terminu adnotacji z częstotliwością oczekiwaną przez przypadek. Wzbogacenie jest statystycznie istotne i jest wykreślane na wykresie bąbelkowym tylko wtedy, gdy wartość p-value jest mniejsza niż 0,01. W tym przypadku trzy najważniejsze wzbogacenia procesów biologicznych obejmują biogenezę kompleksu rybonukleoproteinowego, odpowiedź na wirusa i regulację odpowiedzi na bodziec biotyczny.

Natomiast w przypadku funkcji molekularnych statystycznie wzbogacona jest tylko aktywność katalityczna działająca na RNA i wiązanie jednoniciowego RNA. W przypadku składników komórkowych tylko kompleks retromerów jest statystycznie wzbogacony. Ten reprezentatywny obraz przedstawia analizę wzbogacenia KEGG genów rodzicielskich circRNA DE na wykresie bąbelkowym.

W tym przypadku wzbogacono tylko dwa terminy KEGG: wirusa grypy A i szlaki cyklu życiowego wirusa. Jedną z najważniejszych rzeczy podczas wykonywania tej procedury jest zapewnienie prawidłowego typu cechy zestawu danych krążków RNA, którego używasz podczas prowadzenia pierwszej kontuzji. Dostarczony tutaj potok bioformatyczny pomaga w przewidywaniu potencjalnych sekularnych RNA i adnotacji funkcjonalnych.

Jednak dobrze przeprowadzona weryfikacja będzie nadal potrzebna, aby dostarczyć solidnych dowodów. Protokół ten pozwoli naukowcom odkryć bezpieczne RNA i jego potencjalne role funkcjonalne w różnych kodach i interakcjach patogenów, które będą mogli dalej badać.