Name: In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj kompleksowy potok in silico do identyfikacji i charakteryzacji circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen. Ta metoda umożliwia przewidywanie, kwantyfikację i analizę funkcjonalną RNA kolistych z danych sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Tan Ke En i Dr. Cameronowi Brackenowi za ich krytyczną recenzję tego rękopisu. Prace te były wspierane przez granty z Programu Grantów na Badania Podstawowe (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) oraz University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

W tym protokole, zestawy danych biblioteki sekwencyjnej RNA (rRNA) pozbawione elementów identyfikacji rybosomalnego RNA (rRNA), przygotowane z ludzkich komórek makrofagów zakażonych wirusem grypy A, zostały pobrane i wykorzystane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO). Cały proces bioinformatyki od przewidywania do charakterystyki funkcjonalnej circRNA jest podsumowany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Każda część rurociągu jest bardziej szczegółowo wyjaśniona w poniższych sekcjach.
1. Przygotowanie, pobieranie i konfiguracja przed analizą danych
UWAGA: Wszystkie pakiety oprogramowania użyte w tym badaniu są darmowe i open-source.
<ol>
	<li>Pobieranie wymaganych narzędzi na platformę Linux
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj wymagane oprogramowanie i narzędzia wymienione w Tabeli materiałów na wysokowydajnym komputerze z systemem Linux, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez programistę. 
		UWAGA: Większość narzędzi i oprogramowania ma własne strony internetowe GitHub lub dokumentację zawierającą instrukcje dotyczące instalacji i korzystania z ich narzędzi (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Pobierz żądane zestawy danych sekwencyjnych RNA do wykrywania i analizy circRNA ze stron internetowych archiwów sekwencji (np. European Nucleotides Archive i Gene Expression Omnibus).</li>
		<li>Pobierz genom referencyjny (genomy referencyjne) (format FASA) i pliki adnotacji (format GTF/GFF3), kompatybilne z hostem, z którego przygotowano zestaw danych sekwencyjnych RNA. Genomy referencyjne hosta i pliki adnotacji można zwykle znaleźć w internetowych przeglądarkach genomu, takich jak National Center for Biotechnology Information (NCBI), University of California Santa Cruz (UCSC) i witryny internetowe Ensembl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości sekwencjonowania RNA
	<ol>
		<li>Wprowadź pliki FASTQ do programu FASTQC, aby określić jakość sekwencji RNA. Jeśli jakość plików FASTQ jest niska (np. <Q20) lub występuje sekwencja adapterów, może być konieczne dalsze przycinanie za pomocą narzędzi takich jak Trimmomatic29,30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przewidywanie i analiza różnicowa ekspresji circRNA za pomocą CIRIquant
UWAGA: Bardziej szczegółowy podręcznik instalacji i przeprowadzania analizy wyrażeń różnicowych można znaleźć w sekcji dostępności kodu w CIRIquant paper31. Dane uzupełniające obejmują również niektóre z podstawowych poleceń używanych w tym protokole.
<ol>
	<li>Prognozy CircRNA
	<ol>
		<li>Najpierw zindeksuj genom referencyjny gospodarza za pomocą nakładek BWA i HISAT2. Następnie na terminalu Linux wykonaj polecenia bwa index32 i hisat2-build33 w katalogu genomu referencyjnego hosta, aby go zindeksować.</li>
		<li>Następnie przygotuj plik konfiguracyjny YML zawierający nazwę pliku, ścieżkę narzędzi (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), ścieżkę do pobranych plików referencyjnych (pliki FASTA genomu referencyjnego hosta, pliki adnotacji) oraz ścieżkę do plików indeksu z kroku 2.1.1.</li>
		<li>Uruchom narzędzie CIRIquant z terminala, używając parametrów domyślnych lub ręcznych. Użytkownik może określić typ biblioteki (stronicowany lub nieniciowy) danych sekwencyjnych RNA podczas wykonywania narzędzia CIRIquant. 
		UWAGA: Typ biblioteki danych sekwencyjnych RNA można określić, znając typ używanego zestawu do przygotowania biblioteki. Jeśli tożsamość zestawu do przygotowania biblioteki jest nieznana, do określenia nici danych sekwencyjnych RNA można użyć pakietu bioinformatycznego o nazwie RSeQC36</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wyrażeń różnicowych 
	UWAGA: Pakiet CIRIquant zawiera prep_CIRIquant, prepDE.py i CIRI_DE_replicate; Dlatego nie są potrzebne żadne dodatkowe pliki do pobrania dla tych trzech narzędzi.
	<ol>
		<li>Przygotuj plik tekstowy (.lst) z listą danych zawierającą następujące elementy: 
		1. kolumna: Identyfikatory danych sekwencyjnych RNA użytych w kroku 2.1.3 
		2. kolumna: ścieżka do plików GTF wyprowadzanych przez CIRIquant 
		3. kolumna: grupowanie danych sekwencyjnych RNA, niezależnie od tego, czy jest to grupa kontrolna, czy leczona.</li>
		<li>Przykład można znaleźć w tabeli 1 poniżej. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby umieszczania nagłówków, ponieważ służą one tylko jako odniesienie.</li>
		<li>W terminalu systemu Linux uruchom polecenie prep_CIRIquant z plikiem tekstowym (.lst) przygotowanym w kroku 2.2.1 jako danymi wejściowymi. Przebieg spowoduje wygenerowanie listy plików: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv i circRNA_ratio.csv.</li>
		<li>Przygotuj drugi plik tekstowy z listą danych zawierającą identyfikatory sekwencji RNA i ścieżkę do ich odpowiednich danych wyjściowych StringTie. Układ pliku musi być podobny do pliku tekstowego w kroku 2.2.1 bez kolumny grupowania.</li>
		<li>Uruchom prepDE.py z plikiem tekstowym przygotowanym w kroku 2.2.4 jako danymi wejściowymi do wygenerowania plików macierzy liczby genów.</li>
		<li>Wykonaj CIRI_DE_replicate z plikami library_info.csv i circRNA_bsj.csv z kroku 2.2.3 oraz plikiem gene_count_matrix.csv z kroku 2.2.5 jako danymi wejściowymi, aby wyprowadzić końcowy plik circRNA_de.tsv.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Filtrowanie circRNA DE
	<ol>
		<li>Użyj R (w terminalu komputerowym lub RStudio) lub dowolnego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych (np. Microsoft Excel), aby otworzyć plik circRNA_de.tsv wygenerowany w kroku 2.2.6 w celu przefiltrowania i określenia liczby circRNA o ekspresji różnicowej (DE).</li>
		<li>Przefiltruj circRNA DE zgodnie z kryteriami LogFC > |2| i FDR < 0,05.</li>
		<li>Utwórz plik o nazwie DE_circRNAs.txt do przechowywania informacji o circRNA DE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka i adnotacja przewidywanych circRNA DE
<ol>
	<li>Status adnotacji krążków DE
	<ol>
		<li>Załaduj plik o nazwie DE_circRNAs.txt w programie RStudio , który składa się z listy circRNA DE przefiltrowanych z kroku 2.3.3. Uwzględnij inne informacje, takie jak pozycje genomowe (Chr, Początek, Koniec), orientacje nici (+ lub -), nazwa genu i typ circRNA. Zanim przejdziesz dalej, przekonwertuj współrzędne początkowe genomu circRNA z CIRIquant na oparte na 0, odejmując 1 parę zasad. 
		UWAGA: Pozostałe informacje podane powyżej można uzyskać z plików GTF wyprowadzanych przez CIRIquant (Plik uzupełniający 1).</li>
		<li>Określ status adnotacji przewidywanych circRNA DE, pobierając bibliotekę zawierającą pozycje genomowe bazy danych circRNA (np. circBase) zdeponowanych circRNAs. 
		UWAGA: Przed dokonaniem porównania upewnij się, że wersja genomu używana do przewidywania circRNA jest identyczna z biblioteką bazy danych circRNA. Używany tutaj plik danych circBase jest swobodnie dostępny w folderze dysku udostępnionym w Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.</li>
		<li>Po przygotowaniu obu plików z kroku 3.1.1 i kroku 3.1.2 uruchom skrypt R podany w pliku uzupełniającym 1. Lokalizacje chromosomów circRNA DE są odpytywane do biblioteki przed przypisaniem statusu Adnotacja lub Nieadnotowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka krążków DE
	<ol>
		<li>Użyj R i innego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby podsumować liczbę circRNA zgodnie z typami circRNA (tj. ekson, intron, międzygenowy i antysensowny) oraz liczbą genów, które circRNA obejmują (1 lub >1) (Plik uzupełniający 1).UWAGA: CIRIquant może wykryć tylko cztery typy circRNA (ekson, intron, międzygenowy i antysensowny). Egzon-intronowe circRNA, znane również jako ElciRNA, nie mogą być wykryte przez CIRIquant.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przewidywanie interakcji circRNA-miRNA za pomocą Circr
UWAGA: Bardziej szczegółowy podręcznik na temat instalacji i używania Circr do analizy interakcji circRNA-miRNA można znaleźć pod adresem: https://github.com/bicciatolab/Circr37.
<ol>
	<li>Przygotowanie plików
	<ol>
		<li>Rozpakuj i rozpakuj zawartość pliku Circr.zip po pobraniu go ze strony Circr GitHub za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak "WinRar" lub "7-zip", do nowego katalogu, w którym zostanie przeprowadzona analiza.</li>
		<li>Zainstaluj wstępnie wymagane aplikacje (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools i samtools) przed przeprowadzeniem analizy circRNA-miRNA.</li>
		<li>Genomy referencyjne i pliki adnotacji dla kilku interesujących organizmów, plik współrzędnych rRNA, zweryfikowany plik interakcji miRNA i pliki circRNA circBase są dostarczane przez autora Circr na stronie Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. Po kliknięciu na pliki pomocnicze w folderze dysku, wybierz folder dla interesującego nas organizmu, folder miRNA oraz plik tekstowy circBase i pobierz go.</li>
		<li>Po pobraniu niezbędnych plików w kroku 4.1.3 utwórz nowy katalog o nazwie support_files w katalogu wymienionym w kroku 4.1.1. Następnie rozpakuj i rozpakuj zawartość do katalogu support_files.</li>
		<li>Zindeksuj plik genomu referencyjnego interesującego nas organizmu za pomocą polecenia samtools faidx (Plik uzupełniający 1).</li>
		<li>Przygotuj plik wejściowy składający się ze współrzędnych interesujących DE circRNA w pliku BED rozdzielanym tabulatorami, jak pokazano w tabeli 2. 
		UWAGA: Ponieważ circRNA przewidywane przez CIRIquant nie są oparte na wartości 0, konieczne jest zmniejszenie 1 pz we współrzędnej początkowej (jak wspomniano w kroku 3.1.1) przed konwersją ich do formatu BED. Nagłówki pokazane w Tabeli 2 służą jedynie jako odniesienie i nie są potrzebne w plikach BED.</li>
		<li>W tym momencie upewnij się, że oczekiwana struktura drzewa folderów dla analizy Circr jest następująca: Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bieganie Circr.py
	<ol>
		<li>Wykonaj Circr.py za pomocą Pythona 3 i jako argumenty określ plik wejściowy circRNA, genom FASTA interesującego organizmu, wersję genomu wybranego organizmu, liczbę wątków i nazwę pliku wyjściowego w wierszu poleceń.</li>
		<li>Jeśli interesujący go organizm nie znajduje się w folderze dysku wymienionym w kroku 4.1.3 lub jeśli użytkownik woli mieć niestandardowy zestaw plików do uruchomienia analizy, podczas wykonywania Circr.py należy dołączyć dodatkowe polecenia określające lokalizację tych plików.</li>
		<li>Po zakończeniu analizy Circr program wyprowadza plik interakcji circRNA-miRNA w formacie csv.</li>
		<li>Przefiltruj wyniki interakcji circRNA-miRNA zgodnie z preferencjami użytkownika. W tym badaniu przewidywania są filtrowane za pomocą Rstudio zgodnie z poniższymi kryteriami: 
		-Wykrywane przez wszystkie trzy narzędzia programowe 
		-Dwa lub więcej miejsc wiązania zgłaszanych zarówno przez Targetscan, jak i miRanda 
		-Zidentyfikowane w kolumnach "AGO" lub "validated" 
		-Odfiltruj brak interakcji z regionami nasion</li>
		<li>Zapisz circRNA, które przekazują przefiltrowane warunki z kroku 4.2.3, do nowego pliku tekstowego o nazwie circRNA_miRNA.txt. Takie filtrowanie może zwiększyć pewność przewidywanych interakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Budowa sieci ceRNA
UWAGA: Szczegółowy podręcznik jak korzystać z Cytoscape można znaleźć pod adresem: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ i https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction 
<ol>
	<li>Pobieranie i przygotowanie
	<ol>
		<li>Pobierz najnowszą wersję Cytoscape38 z: https://cytoscape.org/download.html.</li>
		<li>Uruchom kreatora instalatora pobranego w kroku 5.1.1 i wybierz lokalizację pliku dla oprogramowania Cytoscape.</li>
		<li>Przygotuj plik rozdzielany tabulatorami zawierający interesujące Cię circRNA i ich docelowe miRNA. Pierwsza kolumna składa się z nazwy circRNA; druga kolumna określa typ RNA z pierwszej kolumny; trzecia kolumna to docelowe miRNA; a czwarta kolumna określa typ RNA z trzeciej kolumny. Przykładowy plik przedstawiono w tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa mapy sieci ceRNA
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Cytoscape zainstalowane w kroku 5.1.2.</li>
		<li>W Cytoscape przejdź do Plik > Importuj > sieć z pliku. Wybierz plik, który został przygotowany w kroku 5.1.3.</li>
		<li>W nowej zakładce wybierz pierwszą i drugą kolumnę jako "Węzeł źródłowy" i "Atrybut węzła źródłowego", a trzecią i czwartą kolumnę odpowiednio jako "Węzeł docelowy" i "Atrybut węzła docelowego". Kliknij OK, a sieć pojawi się w prawym górnym rogu Cytoscape.</li>
		<li>Aby zmienić styl wizualny sieci, naciśnij przycisk Styl po lewej stronie Cytoscape.</li>
		<li>Naciśnij strzałkę po prawej stronie opcji Kolor wypełnienia. Wybierz Typ dla kolumny i Mapowanie dyskretne dla typu mapowania. Następnie wybierz żądany kolor dla każdego z typów RNA.</li>
		<li>Po zmianie koloru zmień kształt węzłów, przechodząc do opcji Kształt i wykonując krok 5.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego
<ol>
	<li>Analiza ontologii genów (GO) i Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG) dla genu rodzicielskiego circRNA
	<ol>
		<li>Upewnij się, że clusterProfiler39,40 i org. Hs.eg.db41 pakiety zostały zainstalowane w Rstudio. Organizacja organizacyjna. Hs.eg.db41 package to pakiet adnotacji dla całego genomu tylko dla ludzi. Jeśli organizm będący przedmiotem zainteresowania jest innym gatunkiem, należy zapoznać się z: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb</li>
		<li>Zaimportuj informacje o DE_circRNA z kroku 2.3.1 do obszaru roboczego Rstudio.</li>
		<li>Użyj genu rodzicielskiego circRNA podanego w tym pliku do analizy wzbogacenia w nadchodzących krokach. Jeśli jednak użytkownik chce przekonwertować symbol genu na inne formaty, takie jak identyfikator Entrez, powinien użyć funkcji, takiej jak "bitr".</li>
		<li>Używając identyfikatora genu jako danych wejściowych, uruchom analizę wzbogacania GO przy użyciu funkcji enrichGO w pakiecie clusterProfiler39,40 przy użyciu parametrów domyślnych.</li>
		<li>Używając identyfikatora genu jako danych wejściowych, uruchom analizę wzbogacania KEGG przy użyciu funkcji enrichKEGG w pakiecie clusterProfiler39,40 przy użyciu parametrów domyślnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zilustrować użyteczność tego protokołu, jako przykład użyto sekwencji RNA z ludzkich komórek makrofagów zakażonych wirusem grypy A. Zbadano funkcjonowanie circRNA jako potencjalne gąbki miRNA w interakcjach gospodarz-patogen oraz ich funkcjonalne wzbogacenie GO i KEGG w organizmie gospodarza. Chociaż w Internecie dostępnych jest wiele narzędzi circRNA, każde z nich jest samodzielnym pakietem, który nie wchodzi ze sobą w interakcje. Tutaj zebraliśmy kilka narzędzi, które są wymagane do przewidywania i kwantyfikacji ci...

Interakcje gospodarz-patogen reprezentują złożoną interakcję między patogenami a organizmami gospodarza, która wyzwala wrodzone reakcje immunologiczne gospodarzy, które ostatecznie prowadzą do usunięcia atakujących patogenów1,2. Podczas infekcji patogennych wiele genów odpornościowych gospodarza jest regulowanych w celu zahamowania replikacji i uwalniania patogenów. Na przykład powszechne geny stymulowane interferonem (ISG) regulowane w przypadku infekcji patogennych obejmują ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I i OASL3,4. Oprócz genów kodujących białka, badania wykazały również, że niekodujące RNA, takie jak długie niekodujące RNA (lncRNA), mikroRNA (miRNA) i koliste RNA (circRNA) również odgrywają rolę i są regulowane jednocześnie podczas infekcji patogennych5,6,7. W przeciwieństwie do genów kodujących białka, które kodują głównie białka jako cząsteczki funkcjonalne, wiadomo, że niekodujące RNA (ncRNA) działają jako regulatory genów na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym. Jednak badania obejmujące udział niekodujących RNA, w szczególności circRNA, w regulacji genów odpornościowych gospodarzy nie są dobrze opisane w porównaniu z genami kodującymi białka.
CircRNA są powszechnie charakteryzowane przez kowalencyjnie zamkniętą strukturę pętli ciągłej, która jest generowana przez niekanoniczny proces splicingu zwany splataniem wstecznym8. Proces splicingu wstecznego, w przeciwieństwie do procesu splicingu pokrewnych liniowych RNA, polega na ligacji miejsca dawczego poniżej miejsca donorowego do miejsca akceptora powyżej, tworząc strukturę w kształcie koła. Obecnie zaproponowano trzy różne mechanizmy splicingu wstecznego dla biogenezy circRNA. Są to cyrkularyzacja za pośrednictwem białka wiążącego RNA (RBP)9,10, cyrkularyzacja sterowana parowaniem intronów11, oraz cyrkularyzacja sterowana przez lariat12,13,14. Biorąc pod uwagę, że circRNA są połączone od końca do końca w kolistą strukturę, wydają się być naturalnie odporne na normalne trawienie egzonukleazą, a zatem są uważane za bardziej stabilne niż ich liniowe odpowiedniki15. Inną wspólną cechą wykazywaną przez circRNA jest ekspresja specyficzna dla typu komórki lub tkanki w hosts16.
Jak wynika z ich unikalnej struktury i ekspresji specyficznej dla komórki lub tkanki, odkryto, że circRNA odgrywają ważne funkcje biologiczne w komórkach. Do tej pory jedną z głównych funkcji circRNA jest ich rola jako gąbek mikroRNA (miRNA)17,18. Ta regulacyjna rola circRNA występuje poprzez komplementarne wiązanie nukleotydów circRNA z regionem nasiennym miRNA. Taka interakcja circRNA-miRNA hamuje normalne funkcje regulacyjne miRNA na docelowych mRNA, regulując w ten sposób ekspresję genów19,20. Ponadto circRNA są również znane z regulowania ekspresji genów poprzez interakcję z białkami wiążącymi RNA (RBP) i tworzenie kompleksów RNA-białko21. Chociaż circRNA są klasyfikowane jako niekodujące RNA, istnieją również dowody na to, że circRNA mogą działać jako matryce do translacji białek22,23,24.
Ostatnio wykazano, że circRNA odgrywają kluczową rolę w regulacji interakcji gospodarz-patogen, szczególnie między gospodarzami a wirusami. Ogólnie rzecz biorąc, zakłada się, że circRNA gospodarza pomagają w regulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza w celu wyeliminowania atakujących patogenów. Przykładem circRNA, które promuje odpowiedź immunologiczną gospodarza, jest circRNA_0082633, opisany przez Guo et al.25. Ten circRNA wzmacnia sygnalizację interferonu typu I (IFN) w komórkach A549, co pomaga hamować replikację wirusa grypy25. Co więcej, Qu i in. opisali również ludzki intronowy circRNA, zwany circRNA AIVR, który promuje odporność poprzez regulację ekspresji białka wiążącego CREB (CREBBP), przetwornika sygnału IFN-β26,27. Istnieją jednak również circRNA, o których wiadomo, że promują patogenezę choroby po zakażeniu. Na przykład Yu i in. niedawno opisali rolę, jaką odgrywa circRNA splicowany z domeny palca cynkowego GATA zawierającej gen 2A (circGATAD2A) w promowaniu replikacji wirusa H1N1 poprzez hamowanie autofagii komórek gospodarza28.
Aby skutecznie badać circRNA, zazwyczaj implementuje się algorytm przewidywania circRNA całego genomu, po którym następuje charakterystyka in silico przewidywanych kandydatów na circRNA, zanim można przeprowadzić jakiekolwiek badania funkcjonalne. Takie bioinformatyczne podejście do przewidywania i charakteryzowania circRNA jest mniej kosztowne i bardziej efektywne czasowo. Pomaga to w doprecyzowaniu liczby kandydatów, którzy mają być badani funkcjonalnie, i może potencjalnie prowadzić do nowych odkryć. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół oparty na bioinformatyce do identyfikacji, charakterystyki i adnotacji funkcjonalnej circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen. Protokół obejmuje identyfikację i kwantyfikację circRNA ze zbiorów danych sekwencjonowania RNA, adnotację za pomocą circBase oraz charakterystykę kandydatów circRNA pod względem typów circRNA, liczby nakładających się genów i przewidywanych interakcji circRNA-miRNA. Badanie to zapewnia również funkcjonalną adnotację genów rodzicielskich circRNA za pomocą Gene Ontology (GO) i analizy wzbogacenia Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG).

<table><tbody><tr><td>Bedtools</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/arq5x/bedtools2/</td> <td>Odnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr.</td></tr><tr><td></td><td>Wyrównywacz BWA Burrows-Wheeler</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td> <td>odnosi się do sekcji 2.1.1 i 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant i indeksowania genomu</td></tr><tr><td>Circr</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bicciatolab/Circr</td><td>Odnosząc się do sekcji 4. Służy do przewidywania miejsc wiązania miRNA</td></tr><tr><td>CIRIquant</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant</td><td>Odnosząc się do sekcji 2.1.3. Aby przewidzieć circRNA,</td></tr><tr><td>Clusterprofiler</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler</td><td>Odnosząc się do sekcji 7. Do wzbogacania funkcjonalnego procesora GO i KEGG</td></tr><tr><td></td><td>Intel</td><td>&nbsp; Procesor Intel(R) Xeon(R) E5-2620 V2 @ 2,10 GHz&nbsp; &nbsp; Rdzenie: 6-rdzeniowy CPU Pamięć: 65 GB Karta graficzna: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)&nbsp;</td><td>Specyfikacje używane do uruchomienia całego tego protokołu.</td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape</td><td>https://cytoscape.org/download.html</td><td>Odnosi się do sekcji 5.2. Potrzebne do wykreślenia sieci ceRNA</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td> <td>Odnosząc się do sekcji 1.2.1. Kontrola jakości plików Fastq</td></tr><tr><td>HISAT2</td><td></td><td>http://daehwankimlab.github.io/hisat2/</td> <td>Odnosi się do sekcji 2.1.1 i 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant i indeksowania genomu</td></tr><tr><td>Linux</td><td>Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) https://releases.ubuntu.com/focal/</td><td></td> <td>Potrzebne do uruchomienia całego protokołu. Inne wersje Ubuntu mogą być nadal ważne do realizacji protokołu.</td></tr><tr><td>miRanda</td><td></td><td>http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do</td><td>Odnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr</td></tr><tr><td>Pybedtools</td><td>pybedtools 0.8.2</td><td>https://pypi.org/project/pybedtools/</td> <td>Potrzebne do manipulacji genomem pliku BED</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 2.7 i 3.6 lub abover</td><td>https://www.python.org/downloads/</td> <td>Aby uruchomić niezbędne moduły biblioteczne</td></tr><tr><td>R</td><td>Kompleksowa sieć archiwów R</td><td>https://cran.r-project.org/</td> <td>Do manipulowania ramkami danych</td></tr><tr><td>RNAhybrid</td><td>BiBiServ</td><td>https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid</td><td>Odnosi się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td>https://www.rstudio.com/</td> <td>A workspace do uruchamiania R</td></tr><tr><td>samtools&nbsp;</td><td>SAMtools</td><td>http://www.htslib.org/</td> <td>Odnosząc się do sekcji 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant</td></tr><tr><td>StringTie</td><td>Johns Hopkins University: Center for Computational Biology</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml</td><td>Odnosząc się do sekcji 2.1.2. Potrzebne do uruchomienia CIRIquant</td></tr><tr><td>TargetScan</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/nsoranzo/targetscan</td><td>Odnosząc się do sekcji 4.1.2. Potrzebne do Circr</td></tr></tbody></table>

in silico identyfikacja i charakterystyka circrna podczas interakcji gospodarz-patogen

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Okrągłe RNA (circRNA) to klasa niekodujących RNA, które powstają w wyniku splicingu wstecznego. Te circRNA są głównie badane pod kątem ich roli jako regulatorów różnych procesów biologicznych. Warto zauważyć, że pojawiające się dowody wskazują, że circRNA gospodarza mogą ulegać zróżnicowanej ekspresji (DE) po zakażeniu patogenami (np. grypą i koronawirusami), co sugeruje rolę circRNA w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednak badania nad rolą circRNA podczas infekcji patogennych są ograniczone ze względu na wiedzę i umiejętności wymagane do przeprowadzenia niezbędnej analizy bioinformatycznej w celu identyfikacji krążków DE na podstawie danych sekwencjonowania RNA (sekwencjonowania RNA). Bioinformatyczne przewidywanie i identyfikacja circRNA ma kluczowe znaczenie przed jakąkolwiek weryfikacją, a badania funkcjonalne z wykorzystaniem kosztownych i czasochłonnych technik mokrych laboratoriów. Aby rozwiązać ten problem, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono krok po kroku protokół przewidywania i charakterystyki circRNA in silico przy użyciu danych sekwencyjnych RNA. Protokół można podzielić na cztery etapy: 1) Przewidywanie i kwantyfikacja circRNA DE za pośrednictwem potoku CIRIquant; 2) Adnotacja za pomocą circBase i charakterystyka circRNA DE; 3) Przewidywanie interakcji CircRNA-miRNA za pomocą rurociągu Circr; 4) analiza wzbogacenia funkcjonalnego genów rodzicielskich circRNA przy użyciu Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Linia ta będzie przydatna w przyszłych badaniach in vitro i in vivo w celu dalszego zbadania roli circRNA w interakcjach gospodarz-patogen.

Protokół opisany w poprzedniej sekcji został zmodyfikowany i skonfigurowany tak, aby był dostosowany do systemu operacyjnego Linux. Głównym powodem jest fakt, że większość bibliotek modułowych i pakietów wykorzystywanych w analizie circRNA może działać wyłącznie na platformie Linux. W niniejszej analizie, w celu uzyskania reprezentatywnych wyników, z bazy danych GEO42 pobrano zanonimizowane zestawy danych bibliotek RNA-seq z usuniętym rybosomalnym RNA (rRNA), przygotowane z ludzkich makrofagów zai...

Przesłany tutaj protokół wyjaśnia kompletny proces in silico potrzebny do przewidywania i funkcjonalnego charakteryzowania circRNA na podstawie danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, badających interakcje gospodarz-patogen.

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...

Okrągłe RNA odgrywają ważną rolę regulacyjną w różnych procesach biologicznych. Protokół ten jest odpowiedni dla początkujących do przeprowadzania cyrkularnej analizy RNA w obszarze interakcji gospodarza i patogenu. W tym miejscu zestawiliśmy kilka narzędzi, aby stworzyć uproszczony protokół wymagany do bezpiecznego przewidywania i kwantyfikacji RNA, bezpiecznego wzbogacania funkcjonalnego RNA, bezpiecznego RNA, przewidywania interakcji mikro-RNA i konstrukcji sieci RNA CCE.Ten usprawniający protokół można zastosować do próbek klinicznych w celu identyfikacji określonych kandydatów, wartości diagnostycznych i prognostycznych, w warunkach interakcji gospodarza i patogenu. Spodziewam się, że ci, którzy nie mają wcześniejszej wiedzy programistycznej, będą mieli trudności z wykonaniem początkowej fazy tej techniki. Dlatego radziłbym zapoznać się z podstawami języków programowania używanych w tej technice.Uważam, że zwykle patrzenie na to, jak język programowania jest stosowany, jest bardziej pouczający i łatwiejszy do zrozumienia w porównaniu z samym czytaniem. Aby rozpocząć, otwórz terminal Linux i w katalogu genomu referencyjnego hosta wykonaj polecenia bwa index i hisat2-build, aby zindeksować genom. Przygotuj plik konfiguracyjny yml zawierający nazwę pliku, ścieżkę do narzędzi, ścieżkę do pobranych plików referencyjnych oraz ścieżkę do plików indeksu.Określ typ biblioteki danych sekwencji RNA i uruchom narzędzie Ciriquant przy użyciu parametrów domyślnych lub ręcznych. Przygotuj plik tekstowy z listą danych zawierających identyfikatory danych sekwencji RNA, ścieżkę do plików GTF wyprowadzanych przez Ciriquant oraz grupowanie danych sekwencji RNA, niezależnie od tego, czy jest to grupa kontrolna, czy poddana działaniu substancji. Na terminalu Linux uruchom prep_Ciriquant z przygotowanym plikiem tekstowym jako danymi wejściowymi.Ten przebieg spowoduje wygenerowanie listy plików. Przygotuj drugi plik tekstowy z listą danych zawierających identyfikatory sekwencji RNA i ścieżkę do odpowiedniego wyjścia wiązania ciągu. Układ pliku musi być podobny do wcześniej przygotowanego pliku tekstowego bez uruchomienia kolumny grupowania.Uruchom prepde. py z tym plikiem tekstowym jako danymi wejściowymi, aby wygenerować pliki macierzy liczby genów. Wykonaj Ciri_DE_Replicate za pomocą library_info.Pliki csv, circRNA_BSJ. csv i gene_count_matrix. csv jako dane wejściowe do wyprowadzania końcowej circRNA_DE.Plik TSV. Aby przefiltrować i określić liczbę circRNA o zróżnicowanej ekspresji lub DE, otwórz circRNA_DE. tsv za pomocą R lub innego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.Rozpakuj i rozpakuj zawartość pliku CircR po pobraniu go ze strony CircR GitHub za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak WinRar lub 7-Zip. Do nowego katalogu, w którym zostanie przeprowadzona analiza. Następnie zainstaluj wstępnie wymagane aplikacje, takie jak SAMTools, miRanda, RNAhybrid i Pybedtools przed przeprowadzeniem analizy miRNA circRNA.Zindeksuj plik genomu referencyjnego interesującego organizmu za pomocą polecenia SAMtools FAIDX i przygotuj plik wejściowy składający się ze współrzędnych interesujących DE circRNA w pliku łóżkowym rozdzielanym tabulatorami. Następnie wykonaj polecenie Circr. py przy użyciu Python3.A jako argumenty określają plik wejściowy circRNA, szybszy genom interesującego nas organizmu, wersję genomu wybranego organizmu, liczbę wątków i nazwę pliku wyjściowego w wierszu poleceń. Po zakończeniu analizy Circr program generuje plik interakcji circRNA-miRNA w formacie CSV. Przygotuj plik rozdzielany tabulatorami zawierający interesujące Cię circRNA i ich docelowe miRNA.Pierwsza kolumna składa się z nazwy circRNA. Druga kolumna określa typ RNA z pierwszej kolumny. Trzecia kolumna to docelowe miRNA.Czwarta kolumna określa typ RNA z trzeciej kolumny. Aby skonstruować mapę sieci ceRNA, otwórz oprogramowanie Cytoscape, przejdź do pliku, importuj, sieci z pliku, wybierz przygotowany plik i prześlij go. Naciśnij przycisk stylu, aby zmienić styl wizualny sieci.Następnie naciśnij strzałkę po prawej stronie koloru wypełnienia, wybierz typ kolumny, dyskretne mapowanie dla typu mapowania i wybierz żądany kolor dla każdego typu RNA. Następnie przejdź do kształtu, aby zmienić kształt węzłów i wykonaj czynności pokazane wcześniej. W przypadku ontologii genów i analizy KEGG genu rodzicielskiego circRNA, upewnij się, że profiler klastrów i organizacja. Hs.eg.Pakiety DB zostały zainstalowane w naszym studiu. Zaimportuj informacje circRNA DE do obszaru roboczego programu R Studio. Jeśli użytkownik chce przekonwertować nazwy genów rodzicielskich na inne formaty, takie jak entrezid, użyj funkcji, takiej jak bidder.Użyj identyfikatora genu jako danych wejściowych i uruchom analizę ontologii genów i wzbogacenia przy użyciu funkcji enrichGO w profilu klastra lub pakiecie przy użyciu parametrów domyślnych. Na koniec uruchom analizę wzbogacania KEGG, używając identyfikatora genu jako danych wejściowych i funkcji enrichKEGG w pakiecie profilera klastrów. Wykres bąbelkowy analizy wzbogacenia ontologii genów genów rodzicielskich circRNA DE pokazano na tym rysunku.Stosunek genów na osi x to liczba genów na tej liście wejściowej związanej z danym terminem ontologii genów podzielona przez całkowitą liczbę genów w tym terminie. Rozmiar kropki na wykresie jest reprezentowany przez wartość liczby, która jest liczbą genów na liście wejściowej powiązanych z danym terminem ontologii genu. Im większy rozmiar kropek, tym większa liczba genów wejściowych związanych z tym terminem.Kropki na wykresie są oznaczone kolorami na podstawie wartości p, która jest obliczana przez porównanie obserwowanej częstości terminu adnotacji z częstotliwością oczekiwaną przez przypadek. Wzbogacenie jest statystycznie istotne i jest wykreślane na wykresie bąbelkowym tylko wtedy, gdy wartość p-value jest mniejsza niż 0,01. W tym przypadku trzy najważniejsze wzbogacenia procesów biologicznych obejmują biogenezę kompleksu rybonukleoproteinowego, odpowiedź na wirusa i regulację odpowiedzi na bodziec biotyczny.Natomiast w przypadku funkcji molekularnych statystycznie wzbogacona jest tylko aktywność katalityczna działająca na RNA i wiązanie jednoniciowego RNA. W przypadku składników komórkowych tylko kompleks retromerów jest statystycznie wzbogacony. Ten reprezentatywny obraz przedstawia analizę wzbogacenia KEGG genów rodzicielskich circRNA DE na wykresie bąbelkowym.W tym przypadku wzbogacono tylko dwa terminy KEGG: wirusa grypy A i szlaki cyklu życiowego wirusa. Jedną z najważniejszych rzeczy podczas wykonywania tej procedury jest zapewnienie prawidłowego typu cechy zestawu danych krążków RNA, którego używasz podczas prowadzenia pierwszej kontuzji. Dostarczony tutaj potok bioformatyczny pomaga w przewidywaniu potencjalnych sekularnych RNA i adnotacji funkcjonalnych.Jednak dobrze przeprowadzona weryfikacja będzie nadal potrzebna, aby dostarczyć solidnych dowodów. Protokół ten pozwoli naukowcom odkryć bezpieczne RNA i jego potencjalne role funkcjonalne w różnych kodach i interakcjach patogenów, które będą mogli dalej badać.

in-silico-identification-characterization-circrnas-during-host

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Poznaj kompleksowy potok in silico do identyfikacji i charakteryzacji circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen. Ta metoda umożliwia przewidywanie, kwantyfikację i analizę funkcjonalną RNA kolistych z danych sekwencjonowania.

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów