Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Badanie w czasie rzeczywistym profili bioenergetycznych oksfosu i glikolizy staje się kluczowym czynnikiem w charakteryzowaniu zdrowia i funkcji RPE. Respirometria o wysokiej rozdzielczości umożliwia skuteczne porównanie stanu metabolicznego prawidłowego i chorego RPE. Technika ta ma tę zaletę, że jednoczesna eksploracja zarówno okfosu, jak i glikolizy poprzez pomiar wskaźnika zużycia tlenu, OCR i wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, ECAR.

Komórki RPE są wysoce aktywnymi metabolicznie komórkami i są jednymi z pierwszych komórek, które ulegają degeneracji podczas AMD. Zrozumienie ich funkcji metabolicznej i mitochondrialnej umożliwia opracowanie nowych leków. Na początek dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny komórek w ludzkim pożywce RPE do końcowego stężenia 20 000 komórek na 100 mikrolitrów w każdym dołku.

I upewnij się, że cztery narożne studzienki są puste. Pipetuj w górę i w dół wiele razy, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek, używając pipety wielokanałowej dla łatwości i spójności. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki tylko do czterech pustych studzienek narożnych w celu korekcji tła.

Pozostaw płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej na jedną godzinę, aby zminimalizować efekty krawędziowe. Następnie umieść go w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i nawilż. Po całonocnej inkubacji zbadaj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić ich morfologię i poziom pigmentacji przed zmianą pożywki.

W kolejnych dniach badania upewnij się, że komórki zlewają się z charakterystyczną morfologią przypominającą bruk i z czasem nabierają pigmentacji. Aby zapewnić nawodnienie wkładu czujnika na dzień przed testem, napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej 200 mikrolitrami wody dejonizowanej i umieść wkład czujnika zanurzony w wodzie na płytce użytkowej. Przechowuj około 20 mililitrów roztworu kalibru przez noc w wilgotnym piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla.

Włącz przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości i uruchom oprogramowanie, aby instrument ustabilizował się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. W dniu testu należy zastąpić wodę na tabliczce użytkowej równą objętością podgrzanego roztworu kalibru co najmniej 45 minut przed rozpoczęciem testu. Podgrzej 25 mililitrów przygotowanej pożywki do testów warunków skrajnych Mito bez czerwieni fenolowej do 37 stopni Celsjusza i przefiltruj próżniowo pożywkę o dostosowanym pH 7,4 za pomocą górnego filtra rurowego.

Usunąć ludzką pożywkę RPE z płytki do hodowli komórkowej i dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej pożywki do oznaczania. Następnie umieść płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla na godzinę przed rozpoczęciem testu. Każdy wkład z czujnikiem ma cztery porty dostarczania odczynnika na studzienkę do wstrzykiwania badanych związków do studzienek z płytkami do hodowli komórkowych podczas testu.

Przygotuj po trzy mililitry roztworów leków Tenex, rozcieńczając zapasy leków w odpowiednich podłożach testowych. Następnie należy odpipetować 20 mikrolitrów leku Tenex do portu A, 22 mikrolitry do portu B i 25 mikrolitrów do portu C, aby osiągnąć określone końcowe stężenie leku w każdym dołku. Następnie w oprogramowaniu analitycznym otwórz zakładkę szablony, wybierz test warunków skrajnych Mito i wypełnij definicje grup.

Wprowadź szczegółowe informacje na temat strategii wstrzykiwania leków w teście warunków skrajnych Mito. Następnie wprowadź szczegółowe informacje na temat różnych grup eksperymentalnych w teście do kontroli lub leczenia. Szczegółowe informacje dotyczące pożywki testowej w celu dodania różnych suplementów i ich specyficznych stężeń do podłoża do oznaczania podstawowego.

Na koniec dodaj typ komórki. Kliknij następną zakładkę, a następnie Mapę płyt, aby przypisać różne badane grupy do ich określonej lokalizacji na płytce 96-dołkowej. Po wypełnieniu mapy tabliczkowej kliknij zakładkę protokołu, aby przejrzeć protokół przyrządu dla domyślnego protokołu testu warunków skrajnych Mito.

Następnie kliknij uruchom test i włóż wkład czujnika, zanurzony w roztworze kalibru w płytce użytkowej w celu kalibracji. Proces ten trwa około 25 minut, a każdy biosensor jest kalibrowany niezależnie, na podstawie danych wyjściowych czujnika zmierzonych w roztworze kalibru o znanym pH i stężeniu tlenu. Po zakończeniu kalibracji wyjmij płytkę użytkową i włóż płytkę do hodowli komórkowej.

Po pomiarze podstawowym przyrząd automatycznie wstrzykuje roztwór leku Port A do każdej studzienki, która następuje po trzech pętlach mieszania i pomiaru, z których każda trwa trzy minuty. Ten sam wzorzec występuje po każdym kolejnym wstrzyknięciu leku do innych portów. Po zakończeniu cyklu wyjmij płytkę do hodowli komórek i wkład czujnika.

W celu kontroli jakości upewnij się, że wszystkie porty leku i wkład czujnika zostały wstrzyknięte, sprawdzając porty pod kątem pozostałości leku. Następnie zbadaj komórki na mikropłytce hodowli komórkowej pod mikroskopem, aby upewnić się, że monowarstwa komórek się zlewa. Następnie wyrzuć pożywkę do oznaczania i zastąp ją 60 mikrolitrami jednego buforu do lizy w każdym dołku.

Owiń krawędzie płytki parafilmem, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby wspomóc lizę komórek przez noc przed ilościowym określeniem zawartości białka, przy użyciu testu BCA. Na analizę danych znormalizuj wszystkie dane, dzieląc wskaźnik zużycia tlenu lub OCR i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego lub wartości ECAR przez mikrogramy białka w każdym dołku. Następnie wyeksportuj generator raportów z testów warunków skrajnych Mito, który wykorzystuje makra programu Excel do automatycznego obliczania parametrów testu warunków skrajnych Mito za pomocą oprogramowania do analizy danych.

Postępując zgodnie z tymi samymi krokami, jak pokazano w teście warunków skrajnych Mito, można przeprowadzić glikolityczną próbę warunków skrajnych, z wyjątkiem pożywek testowych, suplementów i wstrzyknięć leków, które są różne, jak pokazano w tabeli pierwszej i tabeli drugiej. Przyrząd jednocześnie mierzy zarówno OCR, jak i ECAR dla każdego biegu. W przypadku testu warunków skrajnych Mito obliczenia obwodu opierają się na odczytach OCAR, podczas gdy w przypadku testu warunków skrajnych glikolitycznych obliczenia parametrów opierają się na odczytach ECAR.

Oto krzywa OCR wygenerowana na podstawie przeprowadzonego testu warunków skrajnych Mito na pierwotnych ludzkich komórkach RPE. Obliczenia parametrów testu warunków skrajnych Mito są wyświetlane w postaci wykresów słupkowych. Podobnie jest to krzywa ECAR, wygenerowana w wyniku przeprowadzenia testu stresu glikolitycznego na pierwotnych ludzkich komórkach RPE, a obliczenia są przedstawione w postaci wykresów słupkowych.

Aby zoptymalizować wstrzykiwanie leku przez port B w teście warunków skrajnych Mito, porównano skuteczność dwóch czynników rozprzęgających w zwiększaniu OCR w pierwotnych ludzkich komórkach RPE. Stwierdzono, że BAM15 jest lepszy od FCCP w zwiększaniu mitochondrialnej wydolności oddechowej, co widać po znacznie wyższym maksymalnym oddychaniu i wolnej pojemności oddechowej z BAM15 w porównaniu z FCCP. Ważne jest, aby pamiętać o nawodnieniu wkładu czujnika na dzień przed uruchomieniem testu.

Technika ta pozwala naukowcom lepiej scharakteryzować profile bioenergetyczne komórek RPE i zrozumieć, w jaki sposób komórki RPE wykazują elastyczność metaboliczną w odpowiedzi na różne bodźce chorobotwórcze.