Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

Protokół aktywacji i ekspansji mikropęcherzyków jest istotny, ponieważ odpowiada na główną niezaspokojoną potrzebę w badaniach i produkcji terapii komórkowych, poprawiając trwałość i skuteczność terapii komórkami T. Oparta na wyporności technika pozytywnej selekcji, aktywacji i ekspansji Akadeum ogranicza nadmierną stymulację i późniejsze wyczerpanie limfocytów T podczas procesów aktywacji i ekspansji. Na początek inkubuj 3 razy od 10 do 8 komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 mililitra buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3.

Delikatnie wymieszać składniki przez pipetowanie i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj do komórek pozbawione mikropęcherzyków awidyny w stosunku 0,5 do 1, zgodnie z instrukcjami producenta. I mieszaj za pomocą komercyjnego rotatora end-over-end z prędkością 20 obr./min przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej.

Wirować przy 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z pozbawionymi mikropęcherzyków awidyny, a pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórkowej na dnie probówki. Za pomocą dziewięciocalowej szklanej pipety włóż końcówkę poniżej warstwy komórek bąbelkowych na dno probówki.

Odessać osad komórkowy i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieść je do nowej probówki. Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostawioną w oryginalnej probówce w jednym mililitrze kompletnego podłoża z komórek T. Odwirować subnatant o masie 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i użyć go do pośredniego pomiaru czystości i odzysku.

Po odwirowaniu subnatantu i niewybranych komórek, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki przed liczeniem. Korzystając z automatycznego licznika komórek, policz komórki w subnatantze za pomocą mikroskopii jasnego pola i określ liczbę komórek przechwyconych w warstwie komórek bąbelkowych, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Aby wytworzyć sprzężoną anty-CD28 pozbawioną awidyny i mikropęcherzyków, dodaj biotynylowane przeciwciało anty-CD28 do komercyjnych mikropęcherzyków i mieszaj, stosując rotację od końca do końca przez co najmniej dwie godziny.

Dodać mikropęcherzyki anty-CD28 sprzężone ze strep awidyną do przygotowanej zawiesiny komórek pęcherzykowych w stosunku 1,5 do 1. Mieszaj składniki, obracając się od końca do końca przez 15 minut. Następnie dostosuj całkowitą objętość do 2 milionów komórek na mililitr za pomocą kompletnego podłoża z komórek T lub innego pożądanego podłoża zgodnie z uzyskaną liczbą komórek.

Rozprowadź jeden mililitr aktywowanych komórek na 24-dołkowej płytce i inkubuj w nawilżonym inkubatorze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach dodaj IL-2 i rozpuszczalny anty-CD3, aby zachęcić do dalszej ekspansji, zgodnie z obliczeniami na podstawie początkowej liczby komórek posianych w dniu zero. Umieść płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Co dwa dni usuwać połowę pożywki z środka osadu. Zastąp go świeżą, kompletną pożywką z komórek T i dodaj IL-2 w stężeniu 50 jednostek na mililitr. Policz limfocyty T dwa razy w tygodniu, aby ocenić gęstość komórek.

Gdy gęstość komórek przekroczy 2 razy 10 do 6 komórek lub 2,5 razy 10 do 6 komórek na mililitr, przenieś je do większego naczynia, rozcieńczając je do 5 razy 10 do 5 komórek na mililitr. Delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki, pipetując w górę i w dół. Usuń całą zawartość studzienki, w tym mikropęcherzyki, i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Umyj każdą studzienkę 400 mikrolitrami DPBS bez wapnia i magnezu i przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówkę o wadze 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 mikrolitrach buforu separacyjnego.

Następnie podziel 50 mikrolitrów zawiesiny komórek na 25 mikrolitrów każdy w celu aktywacji i wyczerpania. Wybarwić komórki koktajlem barwiącym przeciwciała aktywujące i wyczerpujące i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj jeden mililitr buforu separacyjnego, delikatnie wymieszaj i odwiruj, aby wypłukać nadmiar przeciwciał.

Całkowicie odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu separacyjnego i przenieść go do odpowiedniego naczynia w celu analizy cytometrii przepływowej. Zaobserwowano wzrost liczby żywotnych limfocytów T i transgenowo-dodatnich limfocytów T między próbką kontrolną a komórkami, które otrzymały kostymulację mikropęcherzykami.

Zwiększone populacje komórek efektorowych zaobserwowano również w próbkach mikropęcherzyków. Żywotne aktywowane limfocyty T wyrażają zwiększony marker wczesnej aktywacji CD69 oraz marker aktywacji od średniej do późnej CD25. Całkowita liczba i odsetek markerów wyczerpania komórek PD1 dodatnich były również znacznie wyższe w próbkach komórek, które otrzymały kostymulację mikropęcherzyków.

Właściwe mieszanie i dozowanie mikropęcherzyków jest niezbędne do zapewnienia dokładnego dozowania, ponieważ mikropęcherzyki szybko unoszą się na powierzchni bez mieszania. Spodziewamy się, że stanie się to poprzez umożliwienie szybkiego wzrostu dużej populacji limfocytów T o wyższej aktywności niż te bardziej wyczerpane limfocyty T, często obserwowane w innych metodach.