Name: Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę flotacji do izolacji, aktywacji i ekspansji ludzkich limfocytów T z PBMC przy użyciu mikropęcherzyków. Technika ogranicza przeciążenie komórek i zwiększa ich trwałość w terapiach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Izolacja limfocytów T za pomocą mikropęcherzyków za pomocą selekcji pozytywnej
UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje podejście do pozytywnej selekcji CD3+ na małą skalę przy użyciu SAMB.
<ol>
	<li>Inkubować 3 x 108 komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 ml buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3 (OKT3) w stężeniu 25 ng przeciwciała na 1 milion komórek (25 ng / M). Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać mikropęcherzyki streptawidyny (SAMB) w stosunku 0,5 (ilość SAMB):1 (ilość komórek) zgodnie ze stężeniem SAMB podanym przez producenta.</li>
	<li>Mieszać za pomocą komercyjnego rotatora typu end-over-end (EOE) przy 20 obr./min przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po odwirowaniu, pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z SAMB. Pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórek na dnie probówki. Za pomocą szklanej pipety o średnicy 9 cali włóż końcówkę poniżej warstwy komórek pęcherzykowych na dno probówki, odessaj osad komórek i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieś je do nowej probówki.</li>
</ol>
2. Kostymulacja (aktywacja) pozytywnie wybranych limfocytów T
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostałą w oryginalnej probówce w 1 ml kompletnego podłoża z komórek T (lub innego pożądanego podłoża).</li>
	<li>Policz komórki w subnatance za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu automatycznego licznika komórek i odejmij tę wartość od początkowej liczby komórek, aby określić liczbę komórek przechwyconych w warstwie komórek bąbelkowych.</li>
	<li>Przed tym etapem należy mieszać biotynylowane przeciwciało anty-CD28 z dostępnymi na rynku SAMB przez co najmniej 2 godziny, aby uzyskać sprzężone przeciwciała anty-CD28 SAMB. Skontaktuj się z producentem SAMBs, aby określić ilość przeciwciała anty-CD28 potrzebną do koniugacji. Dodaj sprzężone SAMB anty-CD28 do zawiesiny komórek pęcherzykowych wynikającej z kroku 2.1 w stosunku 1,5 (SAMB anty-CD28):1 (komórki).</li>
	<li>Mieszać przy użyciu rotacji EOE przez 15 minut, a następnie dostosować całkowitą objętość do 2 milionów komórek na ml z kompletną pożywką z komórek T lub inną pożądaną pożywką zgodnie z liczbą komórek uzyskaną w kroku 2.2.</li>
</ol>
3. Ekspansja współstymulowanych komórek w pożywce do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Rozprowadzić 1 ml aktywowanych komórek z kroku 2.4 w stężeniu 2 M/ml na dołek na płytkę 24-dołkową. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać 50 U/ml IL-2 i 25 ng/m rozpuszczalnego anty-CD3 (OKT3), aby jeszcze bardziej zachęcić do ekspansji, zgodnie z obliczeniami na podstawie początkowej liczby komórek posianych w dniu 0. Umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 i pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Opcjonalnie: Transdukcja aktywowanych limfocytów T za pomocą lentiwirusa
UWAGA: Podejście użyte tutaj jest zaczerpnięte z Prommersberger et al.10.
<ol>
	<li>Rozmrozić lentiwirusa w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać pipetując.</li>
	<li>Delikatnie usunąć środkowy natant, 600 μl z każdej studzienki, nie dotykając komórek potomnych, które znajdują się teraz na dnie studzienki lub warstwy pęcherzyków, która pozostała na powierzchni roztworu.</li>
	<li>Dodać 5 μg/ml bromku heksadimetryny na studzienkę, aby zwiększyć transdukcję wirusa. Dodaj cząsteczki lentiwirusa przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3 (cząstki lentiwirusa na komórkę).</li>
	<li>Odwirować płytkę przez 45 minut przy 800 x g i temperaturze 32 °C, stosując powolne przyspieszanie i bez przerw na zwalnianie. Inkubować komórki przez 4 godziny w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 4 godzinach dodać 600 μl dostępnej, świeżej, kompletnej pożywki z limfocytów T i 50 U/ml IL-2 do każdej studzienki i umieścić płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu ekspansji limfocytów T.</li>
</ol>
5. Ekspansja limfocytów T (z lub bez wcześniejszej transdukcji)
<ol>
	<li>Co 2 dni usuwaj połowę pożywki ze środkowego natantu, zastąp ją świeżą, kompletną pożywką z limfocytów T i dodaj IL-2 w stężeniu 50 U/ml.</li>
	<li>Policz limfocyty T dwa razy w tygodniu, aby ocenić gęstość komórek. Gdy gęstość komórek przekroczy 2 x 10 6-2,5 x 106 komórek / ml, przenieś komórki do większego naczynia, rozcieńczając je do 5 x 105 komórek / ml.</li>
</ol>
6. Pobieranie limfocytów T i cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki, pipetując w górę i w dół. Usuń całą zawartość studzienki, w tym mikropęcherzyki, i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przemyć każdą studzienkę 400 μl DPBS bez wapnia i magnezu (−/−) i przenieść roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu separacyjnego.</li>
	<li>Wybarwić koktajlem przeciwciał aktywujących i wyczerpujących/barwiących i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przygotuj koktajle barwiące w następujący sposób: koktajl aktywacyjny: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; koktajl wydechowy: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu separacyjnego i delikatnie wymieszać. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wypłukać nadmiar przeciwciał. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu separacyjnego i przenieść do odpowiedniego naczynia (np. probówki FACS, płytki 96-dołkowej itp.) w celu analizy cytometrii przepływowej. Zalecany schemat bramkowania analizy cytometrii przepływowej jest szczegółowo opisany w Rysunek 1.</li>
</ol>

<ol><li>Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspective+of+CAR-T+and+CAR-NK+cell+therapy+trials+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany.</a> Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).</li>
<li>Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+CAR-T+cell+manufacturing+processes+during+pivotal+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).</li>
<li>Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+manufacturing+protocols+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+improved+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).</li>
<li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapies%3A+The+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapies: The current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Poltorak, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expamers%3A+A+new+technology+to+control+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Expamers: A new technology to control T cell activation.</a> Scientific Reports. 10, 17832(2020).</li>
<li>Kagoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+stimulation+expands+superior+antitumor+T+cells+for+adoptive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy.</a> JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).</li>
<li>Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).</li>
<li>McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).</li>
<li>Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+CAR+T+cells+produced+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction.</a> Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).</li>
<li>Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+costimulation+leads+to+dysfunction+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+Differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy, w momencie składania zgłoszenia, są pracownikami firmy Akadeum Life Sciences, która zajmuje się produkcją i sprzedażą produktów do separacji mikropęcherzyków.

Opisany protokół pozwala na izolację limfocytów T z próbek PBMC oraz aktywację zawieszonych limfocytów T w pożywkach hodowlanych z mikropęcherzykami. Metoda ta opiera się na funkcjonalizowanych mikropęcherzykach, których naturalna wyporność daje wyjątkową możliwość wprowadzenia sygnałów kostymulujących do komórek i aktywacji ich, gdy są zawieszone w pożywce hodowlanej, zmniejszając w ten sposób ekspozycję rozszerzających się komórek na długotrwałą stymulację; taka nadmierna stymulacja może skutkować zwiększoną ekspresją ...

Obecnie na całym świecie prowadzonych jest ponad 500 badań klinicznych nad terapią komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T, a na rynku dostępne są cztery produkty terapii komórkowej CAR-T1. Jednak nadal istnieje wiele potrzeb w zakresie badań i produkcji komórek CAR-T, które należy zaspokoić, aby poprawić skuteczność, skalowalność i długoterminowy sukces tych potencjalnie leczniczych terapii2,3,4,5. Adoptywne badania kliniczne i produkcja komórek CAR-T rozpoczynają się od izolacji limfocytów T z próbki krwi obwodowej, a następnie stymulacji, transdukcji i ekspansji izolowanych komórek. Parametry takie jak regeneracja limfocytów T, czystość i sygnały aktywacji/wyczerpania wymagają starannego rozważenia przy wyborze technik izolacji i stymulacji komórek do badań i produkcji komórek CAR-T3,4,6. Co ważne, poprawa trwałości terapeutycznej terapii komórkami CAR-T poprzez zminimalizowanie przeszkód biologicznych wynikających z obecnych procesów produkcyjnych, takich jak wyczerpanie limfocytów T, jest niezbędna do zwiększenia skuteczności terapeutycznej6,7.
Jako alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji komórek, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS), tutaj pokazano sortowanie komórek aktywowane wyporem (BACS) z mikropęcherzykami do izolacji komórek T. Separacja mikropęcherzyków wykorzystuje pływające, puste w środku mikrosfery (mikropęcherzyki) do wiązania celów i unoszenia ich na powierzchni próbek płynów8,9. Poprzez funkcjonalizację mikropęcherzyków przeciwciałami (tj. Anty-CD3), pożądane populacje limfocytów T mogą być pozytywnie wybrane z próbek krwi obwodowej. Następnie w pracy wykazano zastosowanie innej populacji mikropęcherzyków funkcjonalizowanych przeciwciałami (tj. anty-CD28) do kostymulacji i aktywacji pozytywnie wybranych limfocytów T w zawiesinie. Mikropęcherzyki oferują prosty i wysoce regulowany przepływ pracy izolacji i aktywacji, który generuje limfocyty T gotowe do zawieszonej hodowli komórkowej i dalszych zastosowań, takich jak modyfikacja genetyczna i ekspansja. Co najważniejsze, aktywacja komórek za pomocą mikropęcherzyków sprzyja powściągliwej stymulacji komórek, aby zapobiec nadmiernemu wyczerpaniu limfocytów T7.
Dla tego badania, cytometria przepływowa była podstawowym narzędziem używanym do analizy sukcesu izolacji, aktywacji i transdukcji funkcjonalizowanych mikropęcherzyków, a także do dostarczania szczegółowych informacji o konkretnych subpopulacjach obecnych podczas faz wzrostu i ekspansji po transdukcji. Oprócz cytometrii przepływowej wykorzystano mikroskopię jasnego pola i fluorescencji, aby potwierdzić zdrowie komórek, morfologię i sukces transdukcji. Opierając się na tych wynikach, technologia i protokół mikropęcherzyków stanowią bardziej dostrajalną i łagodniejszą alternatywę dla tradycyjnych metod izolacji i aktywacji, które są obecnie stosowane; w szczególności komórki aktywowane mikropęcherzykami wykazują znacznie niższą ekspresję markerów wyczerpania limfocytów T niż zwykle obserwowane przy użyciu standardowych narzędzi i zestawów.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>CAS: 60-24-2</td></tr><tr><td>Biologix Multi-Well Culture Plates 24-dołkowe płytki</td><td>VWR&nbsp;</td><td>76081-560</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-ludzka CD28 (28.2) Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>302904</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-ludzka CD3 (OKT3) Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>317320</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinant IL2&nbsp;</td><td>BioVision (vwr)</td><td>10006-122</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczka lentiwirusowa rLV.EF1.zsGreen1-9</td><td>Takara Bio</td><td>0038VCT</td><td></td></tr><tr><td>Leukopak</td><td>BioIVT</td><td>HUMANLMX100-0001129</td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie PBMC</td><td>BioIVT</td><td>HUMANHLPB-0002562</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100X do hodowli tkankowej</td><td>VWR</td><td>97063-708</td><td>CAS: 8025-06-7</td></tr><tr><td>Polibren Odczynnik do infekcji / transfekcji</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>CAS: 28728-55-4</td></tr><tr><td>Pooled Human AB Serum Plasma Plasma Plasma Inaktywowana</td><td>termicznie Innowacyjne badania</td><td>ISERABHI100mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX, HEPES</td><td>Gibco</td><td>72400047</td><td></td></tr><tr><td>zestaw mikropęcherzyków streptawidyny (zawiera bufor separacyjny Akadeum)</td><td>Akadeum</td><td>11110-000</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów t opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Proces izolowania limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu założenia hodowli ex vivo jest kluczowy dla badań, testów klinicznych i terapii komórkowych. W tym badaniu przedstawiono prosty, nowatorski protokół izolacji, aktywacji i ekspansji limfocytów T z PBMC ex vivo. W badaniu wykorzystano technologię funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wyporem (BACS) do izolacji i aktywacji limfocytów T. Krótko mówiąc, protokół obejmuje pozytywną selekcję komórek CD3 + z PBMC pochodzących z leukopaku, a następnie 48-godzinną kostymulację wstępnie sprzężonymi mikropęcherzykami streptawidyny związanymi z anty-CD28 (SAMB) przed transdukcją w 24-dołkowych płytkach. Funkcjonalizowane mikropęcherzyki oferują wyjątkową możliwość aktywowania komórek, prowadząc do proliferacyjnych fenotypów, które pozwalają na ekspansję przy minimalnym wyczerpaniu. Technika ta zapewnia zmniejszone wyczerpanie, ponieważ mikropęcherzyki kostymulujące pozostają wyporne i wracają na wierzch pożywki hodowlanej, skracając w ten sposób czas, w którym rozprężające się komórki stykają się z czynnikami kostymulującymi. Wyniki wskazują, że wyizolowane i wyhodowane limfocyty T otrzymują wystarczającą stymulację, aby aktywować i proliferować, ale nie w stopniu, który prowadzi do nadmiernej aktywacji, co z kolei prowadzi do wyczerpania, o czym świadczy obecność nadmiernej ilości PD-1.

Limfocyty T wyizolowano z zakupionych PBMC i wysiano w celu aktywacji zgodnie z opisem w protokole. Próbki kontrolne ujemne (zakupione PBMC) nie były aktywowane. Próbki kontrolne te włączono w celu wykazania wpływu procesu aktywacji mikropęcherzykami na próbki doświadczalne w porównaniu z niepoddanymi działaniom i niepobudzonymi kontrolnymi limfocytami T, aby upewnić się, że zaobserwowane markery aktywacji były wynikiem dodanych czynników aktywujących, a nie cechą immanentną samych limfocytów T. Zgodnie ze schematem dośw...

Celem tego badania jest wykazanie wykonalności separacji opartej na flotacji w celu izolacji, aktywacji i ekspansji pierwotnych ludzkich limfocytów T.

Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Protokół aktywacji i ekspansji mikropęcherzyków jest istotny, ponieważ odpowiada na główną niezaspokojoną potrzebę w badaniach i produkcji terapii komórkowych, poprawiając trwałość i skuteczność terapii komórkami T. Oparta na wyporności technika pozytywnej selekcji, aktywacji i ekspansji Akadeum ogranicza nadmierną stymulację i późniejsze wyczerpanie limfocytów T podczas procesów aktywacji i ekspansji. Na początek inkubuj 3 razy od 10 do 8 komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 mililitra buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3.Delikatnie wymieszać składniki przez pipetowanie i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj do komórek pozbawione mikropęcherzyków awidyny w stosunku 0,5 do 1, zgodnie z instrukcjami producenta. I mieszaj za pomocą komercyjnego rotatora end-over-end z prędkością 20 obr./min przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej.Wirować przy 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z pozbawionymi mikropęcherzyków awidyny, a pozostałe niewybrane komórki znajdą się w granulce komórkowej na dnie probówki. Za pomocą dziewięciocalowej szklanej pipety włóż końcówkę poniżej warstwy komórek bąbelkowych na dno probówki.Odessać osad komórkowy i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieść je do nowej probówki. Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostawioną w oryginalnej probówce w jednym mililitrze kompletnego podłoża z komórek T. Odwirować subnatant o masie 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i użyć go do pośredniego pomiaru czystości i odzysku.Po odwirowaniu subnatantu i niewybranych komórek, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki przed liczeniem. Korzystając z automatycznego licznika komórek, policz komórki w subnatantze za pomocą mikroskopii jasnego pola i określ liczbę komórek przechwyconych w warstwie komórek bąbelkowych, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Aby wytworzyć sprzężoną anty-CD28 pozbawioną awidyny i mikropęcherzyków, dodaj biotynylowane przeciwciało anty-CD28 do komercyjnych mikropęcherzyków i mieszaj, stosując rotację od końca do końca przez co najmniej dwie godziny.Dodać mikropęcherzyki anty-CD28 sprzężone ze strep awidyną do przygotowanej zawiesiny komórek pęcherzykowych w stosunku 1,5 do 1. Mieszaj składniki, obracając się od końca do końca przez 15 minut. Następnie dostosuj całkowitą objętość do 2 milionów komórek na mililitr za pomocą kompletnego podłoża z komórek T lub innego pożądanego podłoża zgodnie z uzyskaną liczbą komórek.Rozprowadź jeden mililitr aktywowanych komórek na 24-dołkowej płytce i inkubuj w nawilżonym inkubatorze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach dodaj IL-2 i rozpuszczalny anty-CD3, aby zachęcić do dalszej ekspansji, zgodnie z obliczeniami na podstawie początkowej liczby komórek posianych w dniu zero. Umieść płytkę komórkową z powrotem w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Co dwa dni usuwać połowę pożywki z środka osadu. Zastąp go świeżą, kompletną pożywką z komórek T i dodaj IL-2 w stężeniu 50 jednostek na mililitr. Policz limfocyty T dwa razy w tygodniu, aby ocenić gęstość komórek.Gdy gęstość komórek przekroczy 2 razy 10 do 6 komórek lub 2,5 razy 10 do 6 komórek na mililitr, przenieś je do większego naczynia, rozcieńczając je do 5 razy 10 do 5 komórek na mililitr. Delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki, pipetując w górę i w dół. Usuń całą zawartość studzienki, w tym mikropęcherzyki, i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Umyj każdą studzienkę 400 mikrolitrami DPBS bez wapnia i magnezu i przenieś roztwór do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówkę o wadze 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 mikrolitrach buforu separacyjnego.Następnie podziel 50 mikrolitrów zawiesiny komórek na 25 mikrolitrów każdy w celu aktywacji i wyczerpania. Wybarwić komórki koktajlem barwiącym przeciwciała aktywujące i wyczerpujące i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj jeden mililitr buforu separacyjnego, delikatnie wymieszaj i odwiruj, aby wypłukać nadmiar przeciwciał.Całkowicie odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu separacyjnego i przenieść go do odpowiedniego naczynia w celu analizy cytometrii przepływowej. Zaobserwowano wzrost liczby żywotnych limfocytów T i transgenowo-dodatnich limfocytów T między próbką kontrolną a komórkami, które otrzymały kostymulację mikropęcherzykami.Zwiększone populacje komórek efektorowych zaobserwowano również w próbkach mikropęcherzyków. Żywotne aktywowane limfocyty T wyrażają zwiększony marker wczesnej aktywacji CD69 oraz marker aktywacji od średniej do późnej CD25. Całkowita liczba i odsetek markerów wyczerpania komórek PD1 dodatnich były również znacznie wyższe w próbkach komórek, które otrzymały kostymulację mikropęcherzyków.Właściwe mieszanie i dozowanie mikropęcherzyków jest niezbędne do zapewnienia dokładnego dozowania, ponieważ mikropęcherzyki szybko unoszą się na powierzchni bez mieszania. Spodziewamy się, że stanie się to poprzez umożliwienie szybkiego wzrostu dużej populacji limfocytów T o wyższej aktywności niż te bardziej wyczerpane limfocyty T, często obserwowane w innych metodach.

flotation-based-t-cell-isolation-activation-expansion-from-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

Izolacja i oczyszczanie limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej

Ten film pokazuje izolację limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) przy użyciu technologii funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wypornością (BACS). Technika izolacji polega na pozytywnej selekcji limfocytów T CD3 + poprzez znakowanie komórek biotynylowanymi przeciwciałami anty-CD3 i oddzielenie komórek związanych z przeciwciałami za pomocą mikropęcherzyków związanych streptawidyną.

Izolacja limfocytów T oparta na flotacji przy użyciu sortowania komórek aktywowanych wyporem

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Poznaj metodę flotacji do izolacji, aktywacji i ekspansji ludzkich limfocytów T z PBMC przy użyciu mikropęcherzyków. Technika ogranicza przeciążenie komórek i zwiększa ich trwałość w terapiach komórkowych.

Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, aktywacja i ekspansja limfocytów T opartych na flotacji z próbek ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu mikropęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów