Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Protokół ten umożliwia identyfikację i ilościowe określenie wirusa Zika bez polegania na efekcie cytopatycznym. Zależy to od rozpoznania przeciwciał w składniku wirusa. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla wirusa może pomóc w identyfikacji różnych serotypów wirusa w populacjach mieszanych.

Ta metoda ma przewagę nad klasycznymi testami tworzenia płytki nazębnej. Jest szybszy i umożliwia stosowanie w zastosowaniach o wysokiej przepustowości w przypadku aplikacji z automatycznym systemem obrazowania w celu szybkiego zliczania komórek. Proponowany protokół jest wysoce elastyczny

Przy odpowiednich modyfikacjach proponowany protokół może być stosowany do różnych typów komórek i celów wirusowych. Zacznij od wyhodowania komórek Vero w kolbie do hodowli komórek o powierzchni 75 metrów kwadratowych = centymetrowych, która zawiera 12 mililitrów DMEM uzupełnionych 10% FBS i dwoma milimolami L-glutaminy. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby zainfekować monowarstwę komórkową, użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby usunąć pożywkę wzrostową z kolby do hodowli komórkowych. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej przepłukać kolbę dwukrotnie trzema mililitrami DPBS. Następnie dodaj dwa mililitry DMEM bez surowicy i 20 mikrolitrów inokulum wirusa Zika do kolby do hodowli komórkowej.

Pozostawić kolbę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie kołysząc, aby pobudzić adsorpcję wirusa. Pod koniec inkubacji, używając pięciomililitrowej pipety serologicznej, ostrożnie usunąć i wyrzucić rozcieńczony inokulum wirusa z kolby do hodowli komórkowych. Przepłukać kolbę hodowli komórkowej dwukrotnie trzema mililitrami DPBS.

Następnie dodaj 12 mililitrów pożywki konserwacyjnej do kolby do hodowli komórkowych, aby utrzymać zainfekowane komórki. Inkubuj zakażone komórki Vero przez trzy dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po trzech dniach inkubacji należy użyć 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby pobrać supernatant kultury komórkowej zawierający wirusa Zika do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

W celu ilościowego określenia wirusa umieść komórki Vero na wyznaczonych płytkach i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Przygotuj sześć sterylnych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych do każdej płytki, aby wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie, w tym dodatkową probówkę do kontroli ujemnej. W przypadku konfiguracji z 24-dołkową płytką dodaj 450 mikrolitrów DMEM bez surowicy do wszystkich sześciu probówek wirówek.

W przypadku zestawu z 96-dołkową płytką należy dozować 135 mikrolitrów DMEM bez surowicy do sześciu dodatkowych probówek. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie w eksperymencie z 24-dołkową płytką, dodaj 50 mikrolitrów zapasu wirusa Zika do 10 do minus jednej probówki zawierającej 450 mikrolitrów DMEM bez surowicy. W eksperymencie z 96-dołkową płytką dodaj 15 mikrolitrów bulionu wirusa Zika do 10 do minus jednej probówki zawierającej 135 mikrolitrów DMEM bez surowicy.

Wirować każdą probówkę, aby dokładnie wymieszać wirusa i pożywkę, zapewniając równomierne rozprowadzenie cząsteczek wirusa w rozcieńczeniu. Używając świeżej końcówki do pipety, ponownie zawiesić 10 do minus jednej probówki i przenieść 50 i 15 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa Zika do 10 do minus dwóch probówek jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie odpowiednio dla płytek 24- i 96-dołkowych. Usuń i wyrzuć pożywkę kondycyjną dla każdej studzienki odpowiedniej płytki.

Przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie DPBS, aby usunąć wszelkie pozostałości. Zaczynając od najwyższego rozcieńczenia, dodać seryjnie rozcieńczony inokulum wirusa do studzienek, dążąc do najniższego rozcieńczenia. Po jednej godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa ze studzienek, zaczynając od najniższego do najwyższego stężenia.

Dwukrotnie przemyć zainfekowane komórki DPBS, aby usunąć wszelkie ślady zawiesiny wirusa. Pokryj studzienkę DMEM i 1,5% karboksymetylocelulozą o niskiej lepkości. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po inkubacji usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową i trzykrotnie przemyć komórki PBS. W przypadku płytki 96-dołkowej użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową, a następnie umyj komórki trzykrotnie 60 mikrolitrami PBS na studzienkę. Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Po 20 minutach wyrzuć paraformaldehyd i trzykrotnie umyj komórki PBS. Następnie dodać substrat peroksydazy 3,3'diaminobenzyny i inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności. Po 30 minutach zatrzymaj reakcję, myjąc studzienki wodą.

Wysuszyć płytki na powietrzu przez noc i przystąpić do wyliczania ognisk. Policz ogniska dla każdej kontrpróby wybranego rozcieńczenia i oblicz średnią liczbę ognisk dla każdego z nich. Zainfekowane komórki Vero zostały utrwalone w różnych punktach czasowych po infekcji.

W przypadku płytki 2-dołkowej pierwsze pojawienie się ognisk wirusa zaobserwowano 48 godzin po zakażeniu, chociaż rozmiar ognisk był zbyt mały, aby można je było dokładnie policzyć. Po 96 godzinach od zakażenia nie było żadnych oznak oderwania komórek. Po 60 godzinach od zakażenia rozmiar ognisk zwiększył się do optymalnego poziomu do liczenia.

Następnie, w miarę upływu czasu, ogniska stawały się większe i zaczęły łączyć się lub nakładać na siebie pod względem intensywności, tworząc skupiska, które rosły z czasem. W związku z tym ogniska powstałe 60 godzin po zakażeniu zostały wybrane do określenia miana wirusa Zika w 24-dołkowej płytce. W przypadku płytki 96-dołkowej komórki pozostały nienaruszone po 72 godzinach po zakażeniu.

Pojawienie się ognisk wirusa po raz pierwszy zaobserwowano 24 godziny po zakażeniu. Jednak do 36 godzin po zakażeniu rozmiar ognisk był zbyt mały. Optymalna wielkość ognisk została osiągnięta po 48 godzinach od zakażenia.

W tych ostatnich punktach czasowych obserwowano nakładające się lub łączone ogniska, a liczba nakładających się ognisk zwiększała się w czasie. Ogniska powstałe 48 godzin po zakażeniu zostały wybrane do określenia miana wirusa izolatów wirusa Zika. Delikatnie dodaj DPBS po boku każdej studzienki i kołysz płytkami do tyłu i do przodu od jednego do trzech razy, aby usunąć resztki komórkowe i nadmiar pożywki.

Technika ta przyniesie ogromne korzyści naukowcom zajmującym się badaniami nad wirusem Zika, a także może być szeroko zaadaptowana do ilościowego oznaczania innych klinicznie ważnych wirusów, co czyni ją cennym narzędziem do nadzoru i diagnozowania wirusów.