Name: Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę namnażania i kwantyfikacji wirusa Zika w komórkach Vero przy użyciu immunodetekcji kolorymetrycznej. Ta technika umożliwia szybką identyfikację serotypów w mieszanych populacjach bez obserwacji efektu cytopatycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie otrzymało wsparcie od Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Malezji w ramach Programu Grantów Długoterminowych na Badania (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) oraz dofinansowania dla programu Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Rysunek 3 w tym badaniu, który pokazuje przebieg barwienia w teście tworzenia ognisk, został zaadaptowany z "DAB Immunohistochemistry" przez BioRender.com (2022). Pobrane z https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Rozprzestrzenianie się wirusa
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Hoduj komórki Vero w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2 zawierającej 12 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 2 mM L-glutaminą (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Monitoruj komórki pod mikroskopem; gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90%, są gotowe do użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) . 
		UWAGA: Komórki Vero podwajają się mniej więcej co 24 h17. Rozcieńczenia w stosunku 1:10 powinny zająć od 3 do 4 dni, aby osiągnąć 80%-90% zlewności w kolbie o średnicy75 cm2. Monitoruj komórki codziennie lub co drugi dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie monowarstwy komórkowej
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę wzrostową z kolby do hodowli komórkowych za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Przepłukać kolbę 3 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (dPBS) firmy Dulbecco 2x za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. 
		UWAGA: Należy przygotować zlewkę z 10% podchlorynem sodu w celu dezynfekcji wszelkich wyrzuconych zakaźnych odpadów płynnych z kolb/talerzy.</li>
		<li>Dodać 2 ml DMEM bez surowicy (DMEM uzupełnione o 2 mM L-glutaminy bez FBS) i 20 μl inokulum ZIKV do kolby do hodowli komórkowych. Inkubować kolbę, delikatnie kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa. 
		UWAGA: Miareczkowanie początkowego zapasu ZIKV będzie pomocne w określeniu objętości dodatku inokulum ZIKV (krok 2). 
		UWAGA: ZIKV jest klasyfikowany jako patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wszystkie procedury z użyciem materiałów zawierających ZIKV muszą być przeprowadzane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i muszą być zgodne ze wszystkimi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie nośnika nakładki
	<ol>
		<li>Po 1 godzinnej inkubacji usunąć i wyrzucić rozcieńczony inokulum wirusa za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przepłukać kolbę hodowli komórkowych 3 ml dPBS 2x.</li>
		<li>Dodać 12 ml pożywki podtrzymującej (DMEM uzupełnionej o 2% FBS, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) do kolby do hodowli komórkowych, aby utrzymać zakażone komórki.</li>
		<li>Inkubować zakażone komórki Vero przez 3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Codziennie monitoruj pod mikroskopem pod kątem CPE zakażonych komórek Vero.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie supernatantu do hodowli komórkowych zawierającego ZIKV
	<ol>
		<li>W 3 dniu po zakażeniu można zaobserwować zaokrąglanie i odwarstwianie komórek (CPE) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-D). Zebrać supernatant hodowli komórkowej zawierający ZIKV do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Użyj filtra strzykawkowego z polieterosulfonu 0,22 μm (patrz tabela materiałów), aby przefiltrować supernatant hodowli komórkowej. Porcję 500 μl przefiltrowanego supernatantu z hodowli komórkowej rozlać do probówek z nakrętką o pojemności 2,0 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia><.
		UWAGA: Zebrany ZIKV może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. 
		UWAGA: W przypadku użycia igły strzykawkowej należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, ponieważ igła może przebić skórę. Należy ustanowić laboratoryjne standardowe procedury operacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja wirusa
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Wysiewać komórki Vero na wyznaczonych płytkach (płytka 24-dołkowa: 0,5 ml/basenik, 7,5 x 104 komórki/dołek; płytka 96-dołkowa: 0,1 ml/dołek, 1,5 x 104 komórki/basenik) i inkubować płytkę przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Istnieje pięć różnych punktów czasowych do przetestowania (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godzin po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu); Dlatego przygotuj jedną płytkę dla każdego punktu czasowego.</li>
		<li>Po 24 godzinnej inkubacji i gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90% (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E), płytka jest gotowa do infekcji. Przystąpić do przygotowania rozcieńczonego wywaru wirusa (krok 2.2) przed zakażeniem monowarstwy komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenie wirusa
	<ol>
		<li>W przypadku płytek 24- i 96-dołkowych należy przygotować sześć sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dla każdej płytki, aby przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie (10-1 do 10-5), w tym kontrolę ujemną. W przypadku konfiguracji eksperymentalnej dla płytki 24-dołkowej dodaj 450 μl DMEM bez surowicy do wszystkich sześciu probówek mikrowirówek. W przypadku konfiguracji eksperymentalnej dla płytki 96-dołkowej dodaj 135 μl DMEM bez surowicy do sześciu probówek. 
		UWAGA: Oznacz wyraźnie każdą probówkę, aby wskazać rozcieńczenie jej zawartości przed wykonaniem dziesięciokrotnego rozcieńczania szeregowego.</li>
		<li>Aby przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, w konfiguracji eksperymentalnej z 24-dołkową płytką, dodaj 50 μl bulionu ZIKV, który został zebrany z kroku 1, do probówki 10-1 zawierającej 450 μl DMEM bez surowicy. W przypadku eksperymentu z 96-dołkową płytką dodaj 15 μl bulionu ZIKV do probówki 10-1 zawierającej 135 μl DMEM bez surowicy.</li>
		<li>Wiruj każdą probówkę, aby wymieszać wirusa i pożywkę. Jest to pierwsze dziesięciokrotne rozcieńczenie. 
		UWAGA: Wymagane jest właściwe wymieszanie wirusa i pożywki hodowlanej w każdej probówce do rozcieńczania, aby zapewnić dokładne rozcieńczenie seryjne.</li>
		<li>W przypadku eksperymentu z płytką 24-dołkową należy użyć świeżej końcówki pipety, aby ponownie zawiesić probówkę 10-1 i przenieść 50 μl rozcieńczonego ZIKV do probówki 10-2 jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie. W przypadku eksperymentu z płytką 96-dołkową należy użyć świeżej końcówki pipety, aby ponownie zawiesić probówkę 10-1 i przenieść 15 μl rozcieńczonego ZIKV do probówki 10-2 jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.2.4 cztery razy, aż do piątej probówki (z wyłączeniem kontroli ujemnej). 
		UWAGA: Po każdym etapie pipetowania należy używać nowej końcówki do pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie monowarstwy komórkowej
	<ol>
		<li>Wyjmij i wyrzuć kondycjonowaną pożywkę z każdej studzienki (płytka 24-dołkowa: 0,5 ml/dołek; płytka 96-dołkowa: 0,1 ml/dołek).</li>
		<li>Przepłukać każdą studzienkę dPBS 2x (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/basenik).</li>
		<li>Pracując od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, dodać każdy seryjnie rozcieńczony inokulum wirusa do studzienki (płytka 24-dołkowa: 200 μL/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μL/basenik). 
		UWAGA: Infekcja każdego rozcieńczenia zostanie przeprowadzona w zduplikowanych studzienkach. Utrzymuj dwie niezainfekowane studzienki jako kontrolę negatywną. Oznacz płytkę i studzienki wyraźnie, aby uniknąć nieporozumień. Wymieniaj końcówki pipet po każdym etapie pipetowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
		<li>Inkubować płytkę, delikatnie kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie pożywki do hodowli komórkowych nakładki
	<ol>
		<li>Po 1 godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego do najwyższego stężenia.</li>
		<li>Przemyć zakażone komórki dPBS 2x (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/dołek).</li>
		<li>Pokryj studzienkę DMEM (uzupełnionym 2% FBS, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) i 1,5% karboksymetylocelulozy o niskiej lepkości (CMC; patrz tabela materiałów) (płytka 24-dołkowa: 1 ml / dołek; płytka 96-dołkowa: 0,2 ml / dołek).</li>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Nie naruszaj płytki podczas tego okresu inkubacji.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora do hodowli komórkowych w celu barwienia w różnych punktach czasowych (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godziny po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie
<ol>
	<li>Utrwalanie komórek
	<ol>
		<li>Po określonych godzinach inkubacji (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godziny po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu) należy usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową i przemyć komórki 3x 1x PBS. W przypadku płytki 96-dołkowej wyjąć i wyrzucić pożywkę nakładkową, a następnie przemyć komórki 3x 60 μL/basenik 1x PBS za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 min. 
		UWAGA: Paraformaldehyd jest stałym spolimeryzowanym formaldehydem. Jest to łatwopalny, stały, biały, krystaliczny proszek, który po zmieszaniu z wodą lub podgrzaniu uwalnia gazowy formaldehyd. Wszystkie procedury związane z użyciem paraformaldehydu muszą być przeprowadzane w certyfikowanym dygestoriach chemicznych lub zatwierdzonych obudowach z wywiewem, zgodnie z laboratoryjnymi procedurami SOP specyficznymi dla substancji chemicznych zawierających formaldehyd.</li>
		<li>Po 20 minutach wyrzuć paraformaldehyd i przemyj komórki 3x 1x PBS. Wykonaj permeabilizację, blokowanie i inkubację przeciwciał, wykonując kroki 3.2-3.5. 
		UWAGA: Wyrzucając 4% paraformaldehydu, postępuj zgodnie z procedurą usuwania odpadów uniwersytetu lub instytutu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenikanie komórek
	<ol>
		<li>Dodać 1% oktylofenoksyetanolu poli(etylenoksy)etanolu (patrz tabela materiałów), aby przeniknąć komórki (płytka 24-dołkowa: 200 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 40 μl/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Po 15 minutach wyrzuć oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol i umyj komórki 3x 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Dodać 3% odtłuszczonego mleka, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie w próbce (płytka 24-dołkowa: 500 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 100 μl/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Po 2 godzinach wyrzuć 3% odtłuszczone mleko i umyj komórki 3x 1x PBS. 
		UWAGA: To jest punkt zatrzymania. Po dodaniu 3% odtłuszczonego mleka płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 dni przed wprowadzeniem przeciwciał pierwotnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Dodać przeciwciało monoklonalne przeciwko flawiwirusowi, 4G2 (klon D1-4G2-4-15; przeciwciało pierwszorzędowe, patrz tabela materiałów) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku (stosunek 1:1,000) (płytka 24-dołkowa: 200 μl/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μL/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po 1 godzinie usunąć roztwór zawierający przeciwciało monoklonalne i przemyć komórki 3x 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Dodać kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (patrz tabela materiałów) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku (stosunek 1:1,000) (płytka 24-dołkowa: 200 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 40 μl/dołek). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po 1 godzinie usunąć roztwór zawierający przeciwciało drugorzędowe i przemyć komórki 3x 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja substratu
	<ol>
		<li>Dodać substrat peroksydazy 3,3'diaminobenzydyny (DAB) (patrz tabela materiałów) i inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności (płytka 24-dołkowa: 200 μl/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μl/basenik). Po 30 minutach zatrzymaj reakcję, myjąc studzienki wodą.</li>
		<li>Wysuszyć płytki na powietrzu przez noc i przystąpić do oznaczania ognisk po całkowitym wyschnięciu płytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Określenie miana wirusa
<ol>
	<li>Ręczny proces zliczania ognisk (format 24-dołkowy)
	<ol>
		<li>Ogniska można uwidocznić pod mikroskopem stereoskopowym. Wybierz rozcieńczenie, które wytwarza 50-200 ognisk.</li>
		<li>Policz ogniska dla każdej kontrpróby wybranego rozcieńczenia. Obliczyć średnią liczbę ognisk dla każdego z wybranych rozcieńczeń.</li>
		<li>Obliczyć jednostkę tworzącą ogniska na ml (FFU/ml) dla każdej próbki, postępując według poniższego wzoru: FFU/ml = średnia liczba zliczonych ognisk/(rozcieńczenie x objętość dodanego rozcieńczonego wirusa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zautomatyzowany proces zliczania ognisk (format 96-dołkowy)
	<ol>
		<li>Zeskanuj 96-dołkową płytkę w komercyjnym analizatorze oprogramowania.
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie oprogramowanie (patrz Spis materiałów), aby otworzyć.</li>
			<li>Kliknij Przełącz pakiety i upewnij się, że pakiet jest przełączony na dowolny, który ma zastosowanie (Rysunek uzupełniający 1A). Kliknij przycisk OK.</li>
			<li>Rozpocznij skanowanie, klikając przycisk Skanuj > Skanowanie pełnej płyty (Rysunek uzupełniający 1B).</li>
			<li>Kliknij Dashboard (Pulpit nawigacyjny), aby upewnić się, że format przechwytywania to format 96-dołkowy (rysunek uzupełniający 2A).</li>
			<li>Wybierz tryb centrowania jako "Automatyczne wyrównanie wstępne zweryfikowane przez użytkownika" (Rysunek uzupełniający 2B).</li>
			<li>Kliknij Wysuń, aby załadować płytę. 
			UWAGA: Otwórz pokrywę talerza i umieść ją do góry tak, aby rząd A znajdował się u góry (Rysunek uzupełniający 3A).</li>
			<li>Wprowadź nazwę tablicy rejestracyjnej i kliknij OK. Kliknij Załaduj, aby załadować płytę.</li>
			<li>Kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Następnie skalibruj pozycje dla A1, A12 i H1 za pomocą przycisków "Góra, Dół, Lewo, Prawo" i kliknij Potwierdź (Rysunek uzupełniający 3B). 
			UWAGA: Oprogramowanie rozpocznie skanowanie każdej studni.</li>
			<li>Po zakończeniu skanowania pojawi się obraz poglądowy. Kliknij Zamknij.</li>
			<li>Wyjdź ze skanowania, klikając Powrót do centrali.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Policz 96-dołkową płytkę za pomocą oprogramowania.
		<ol>
			<li>Kliknij opcję Count (Liczba> Smart Count (Inteligentne liczenie).</li>
			<li>W oprogramowaniu pokaże się "Krok 1 z 5: Wybierz płytki do policzenia". Kliknij Load plate(s) (Płyty obciążeniowe). Zaznacz cały folder i kliknij Wybierz, aby zaimportować zeskanowaną płytę (Rysunek uzupełniający 4A).</li>
			<li>W oprogramowaniu pokaże się "Krok 2 z 5: Zdefiniuj parametry zliczania". Kliknij Dostosuj parametry, a parametry zostaną wyświetlone (proces dyfuzji; mały/normalny/duży/największy/największy +1; separacja punktowa; zliczony obszar; równowaga tła; usuwanie włókien; bramkowanie). 
			UWAGA: Zacznij od jednego dołka i sprawdzaj tam iz powrotem, aby znaleźć najlepsze ustawienia dla wszystkich dołków.</li>
			<li>Po zakończeniu kliknij Dalej (Rysunek uzupełniający 4B).</li>
			<li>W oprogramowaniu pokaże się "Krok 3 z 5: Wybierz/odznacz studnie". Po zakończeniu wyboru studni do policzenia kliknij Dalej, aby kontynuować. 
			UWAGA: Studzienki wybrane do zliczenia pojawią się z literą "C" w prawym górnym rogu każdej studni (rysunek uzupełniający 5A).</li>
			<li>W oprogramowaniu pokaże się "Krok 4 z 5: Ustawienia wyjściowe". Kliknij Wyświetl/Modyfikuj ustawienia wyjściowe, aby sprawdzić, czy ustawienia (takie jak format obrazu) są odpowiednie. Kliknij Zapisz i wyjdź > Dalej (Rysunek uzupełniający 5B).</li>
			<li>W oprogramowaniu pokaże się "Krok 5 z 5: Rozpocznij automatyczne liczenie". Kliknij przycisk Rozpocznij automatyczne liczenie (rysunek uzupełniający 6A).</li>
			<li>Po zakończeniu kliknij Wyjdź z automatycznego liczenia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie kontroli jakości (QC) w komercyjnym analizatorze oprogramowania.
	<ol>
		<li>Na stronie panelu sterowania kliknij Kontrola jakości > Dodaj tabliczkę(i). Zaznacz cały folder, aby zaimportować zliczoną płytę, kliknij Wybierz > rozpocznij kontrolę jakości (rysunek uzupełniający 6B).</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie każdą studzienkę, aby sprawdzić miejsca. Kliknij Liczba, aby usunąć wszystkie plamy. Oprogramowanie zacznie liczyć. 
		UWAGA: Upewnij się, że opcja "Plamy: Usuń" jest zaznaczona. Zakończenie liczenia może być wskazywane przez zliczoną liczbę ognisk, na przykład "30" (Rysunek Uzupełniający 7A).</li>
		<li>Po zakończeniu liczenia (wskazywanym przez zliczoną liczbę ognisk, na przykład "30"), kliknij "Tak", aby usunąć plamy (rysunek uzupełniający 7B). Trzykrotnie kliknij lewym przyciskiem myszy miejsce, które chcesz usunąć. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć, a następnie kliknij Tak.</li>
		<li>Kliknij Finish Plate (Płyta zakończenia) i przejdź do przeglądu projektu po zakończeniu kontroli jakości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie za pomocą analizatora oprogramowania.
	<ol>
		<li>Sprawdź zeskanowany, zliczony i kontrolowany obraz płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li>
<li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island%2C+Federated+States+of+Micronesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Cao-Lormeau, V. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%2C+French+polynesia%2C+South+pacific%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li>
<li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients%2C+New+Caledonia%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li>
<li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+outbreaks+of+dengue%2C+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).</li>
<li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island%2C+South+Pacific%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+the+Americas%3A+early+epidemiological+and+genetic+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li>
<li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015).</li>
<li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li>
<li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+reverse+transcription+PCR+%28qRT-PCR%29+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+yellow+fever+virus%3A+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li>
<li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture%3A+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li>
<li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+quantification%2C+propagation%2C+detection%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li>
<li>Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tropical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).</li>
<li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+isolation%2C+propagation%2C+and+quantification+using+multiple+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
<li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li>
<li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li>
<li>Kang, W., Shin, E. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960(2012).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+VIsualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).</li>
<li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li>
<li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).</li>
<li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biken+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li>
<li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544(2021).</li>
<li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Istnieje kilka testów w celu określenia miana wirusa; PFA ma podobny protokół oznaczania ilościowego wirusa jak FFA, w którym inokulum wirusa jest rozcieńczane, aby umożliwić rozróżnienie poszczególnych blaszek lub ognisk. Po barwieniu, każda płytka lub ognisko wskazuje na pojedynczą zakaźną cząstkę w inokulum19. PFA jest barwiony fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia tworzenia się płytki nazębnej spowodowanej lizą lub śmiercią komórki. W związku z tym PFA jest bardziej czasochłonny, poniewa...

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) jest nową chorobą wirusową przenoszoną przez komary. Pierwsza izolacja ZIKV miała miejsce w Ugandzie w 1947 roku1,2; Od 1947 do 2007 r. pozostawała zaniedbana, ponieważ objawy kliniczne są najczęściej bezobjawowe i charakteryzują się samoograniczającą się chorobą gorączkową. W 2007 roku epidemia wirusa Zika rozpoczęła się na wyspach Yap3,4, po czym nastąpiły większe epidemie w regionach Pacyfiku (Polinezja Francuska, Wyspa Wielkanocna, Wyspy Cooka i Nowa Kaledonia) od 2013 do 2014 roku5,6,7,8, gdzie po raz pierwszy u dorosłych zgłoszono ciężkie powikłanie neurologiczne zespół Guillaina-Barrégo (GBS)9. W latach 2015 i 2016 pierwsza szeroko zakrojona epidemia ZIKV przetoczyła się przez obie Ameryki po pojawieniu się azjatyckiego genotypu ZIKV w Brazylii już w 2013 roku10. Podczas tej epidemii zgłoszono od 440 000 do 1,3 miliona przypadków małogłowia i innych zaburzeń neurologicznych u noworodków11. Obecnie nie ma specyficznego lekarstwa ani leczenia zakażenia ZIKV; W związku z tym istnieje pilna potrzeba medyczna szczepionek przeciwko ZIKV, które mogą zapobiegać zakażeniom, szczególnie w czasie ciąży.
Kwantyfikacja wirusów to proces mający na celu określenie liczby wirusów obecnych w próbce. Odgrywa ważną rolę w badaniach, a laboratoria akademickie obejmują wiele dziedzin, takich jak medycyna i nauki przyrodnicze. Proces ten jest również ważny w sektorach komercyjnych, takich jak produkcja szczepionek wirusowych, białek rekombinowanych, antygenów wirusowych lub środków przeciwwirusowych. Do ilościowego oznaczania wirusa można użyć wielu metod lub testów12. Wybór metod lub testów zwykle zależy od charakterystyki wirusa, pożądanego poziomu dokładności oraz charakteru eksperymentu lub badania. Ogólnie rzecz biorąc, metody ilościowego oznaczania wirusów można podzielić na dwie kategorie: testy molekularne, które wykrywają obecność wirusowego kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) oraz testy, które mierzą zakaźność wirusa in vitro12. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR, dla DNA) lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR, dla RNA)13 i cyfrowa kropelka PCR14 to przykłady typowych technik molekularnych stosowanych do ilościowego oznaczania wirusowego kwasu nukleinowego w danej próbce15. Jednak te bardzo czułe techniki molekularne nie są w stanie odróżnić wirusów żywotnych od nieżywotnych15. W związku z tym badania, które wymagają informacji na temat cech biologicznych, takich jak zakaźność wirusa na komórkach, nie mogą być przeprowadzone przy użyciu wyżej wymienionych technik molekularnych; Potrzebne są testy, które mogą zmierzyć i określić obecność żywych wirusów. Testy, które mierzą zakaźność wirusa, obejmują test tworzenia płytki nazębnej (PFA), 50% dawkę zakaźną kultury tkankowej (TCID50), test ogniskowania fluorescencyjnego i transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM)12.
PFA, opracowany przez Renato Dulbecco w 1952 roku, jest jedną z najczęściej używanych metod miareczkowania wirusów, w tym dla klasy ZIKV<sup="xref">16. Służy do bezpośredniego oznaczania stężeń wirusów dla zakaźnych wirionów litycznych. Metoda opiera się na zdolności wirusa litycznego do wywoływania efektów cytopatycznych (CPE; strefy śmierci komórki lub blaszki miażdżycowe, obszar infekcji otoczony niezakażonymi komórkami) w zaszczepionej monowarstwie komórek po zakażeniu wirusowym. Istnieje jednak kilka wad testu, które wpływają na jego użyteczność. Test jest czasochłonny (trwa około 7-10 dni, w zależności od wirusów), zależny od CPE i podatny na błędy. W niniejszym badaniu przedstawiono technikę immunokolorymetryczną, test formowania ostrości (FFA), do wykrywania i ilościowego oznaczania ZIKV w formatach płytek 24-dołkowych i 96-dołkowych.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy z polieterosulfonu</td><td>Sartorius</td><td>S6534-FMOSK</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>10 ml sterylna pipeta serologiczna</td><td>Labserv</td><td>14955156</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Rurka z nakrętką&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>SCT-200-SS-C-S</td> 24-dołkowa <td></td></tr><tr><td>płytka</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Sterylne pipety serologiczne</td><td>Labserv</td><td>14955157</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże peroksydazy 3,3'diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34065</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; Inkubator C z 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>5 mL sterylna pipeta serologiczna</td><td>Labserv</td><td>14955155</td><td></td></tr><tr><td>50 mL probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>LAB352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw flawiwirusowi, 4G2 (klon D1-4G2-4-15)</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB10216</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawizowana 20x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>22,8 g 8 mM Na2HPO4, 4,0 g 1,5 mM KH2PO4, 160 g 0,14 M NaCl, 4,0 g 2,7 mM KCl, 1 l MilliQ H2O</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego, klasa II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6 Uniwersalny analizator ELISpot/FluoroSpot</td><td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td><td>CTL-S6UNV12</td><td>Komercyjny analizator oprogramowania</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe surowica (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS Kozie przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)</td><td>MiliporeSigma</td><td>12-349</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer ulepszony</td><td></td></tr><tr><td>detergent IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanolIGEPAL&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjny wahacz</td><td>FINEPCR</td><td>CR300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza o niskiej lepkości (CMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta wielokanałowa (10 - 100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta wielokanałowa (30 - 300 &mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (10 - 100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (100 - 1000 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (20 - 200 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td>Sunlac Low Fat</td><td>N/A</td><td>Przygotuj 3% odtłuszczone mleko w 1x PBS do etapu blokowania barwienia</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Do dezynfekcji wszelkich wyrzuconych zakaźnych odpadów płynnych z kolb/płytek</td></tr><tr><td></td><td>Stereomikroskop Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowa, Luer Lock, 10 ml z igłą 21 G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td>SS10L21G</tr><tr><td>Komórki nerkowe afrykańskiej zielonej małpy Vero&nbsp;</td><td>-</td><td>ECACC 88020401</td><td>Otrzymane od współpracownika. Jednak ogniwa Vero uzyskane od innych dostawców powinny być w stanie być używane z pewną optymalizacją.</td></tr></tbody></table>

namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Wirus Zika (ZIKV) to wirus przenoszony przez komary należący do rodzaju Flavivirus. Zakażenie wirusem ZIKV wiąże się z wrodzonymi nieprawidłowościami mózgu i potencjalnie zespołem Guillaina-Barrégo u dorosłych. Badania nad ZIKV w celu zrozumienia mechanizmów choroby są ważne dla ułatwienia opracowania szczepionek i leczenia. Metoda ilościowego oznaczania wirusów jest kluczowa i fundamentalna w dziedzinie wirusologii. Test tworzenia ostrości (FFA) to test ilościowy wirusa, który wykrywa antygen wirusowy za pomocą przeciwciał i identyfikuje ogniska infekcji komórek za pomocą techniki barwienia immunologicznego peroksydazy. Obecne badanie opisuje protokół propagacji i kwantyfikacji wirusa przy użyciu formatów zarówno 24-dołkowych, jak i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości). W porównaniu z innymi podobnymi badaniami, protokół ten dodatkowo opisał optymalizację wielkości ognisk, co może służyć jako przewodnik do rozszerzenia zastosowania tego testu dla innych wirusów. Po pierwsze, namnażanie ZIKV odbywa się w komórkach Vero przez 3 dni. Supernatant hodowli zawierający ZIKV jest zbierany i oznaczany ilościowo przy użyciu FFA. Krótko mówiąc, kultura wirusa jest inokulowana na komórkach Vero i inkubowana przez 2-3 dni. Tworzenie ognisk jest następnie określane po zoptymalizowanych procesach barwienia, w tym utrwalaniu komórek, przepuszczalności, blokowaniu, wiązaniu przeciwciał i inkubacji z substratem peroksydazy. Barwione ogniska wirusowe są wizualizowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego (ręczne liczenie w formacie 24-dołkowym) lub analizatora programowego (automatyczne liczenie w formacie 96-dołkowym). FFA zapewnia powtarzalne, stosunkowo szybkie wyniki (3-4 dni) i nadaje się do stosowania w przypadku różnych wirusów, w tym wirusów nietworzących płytki nazębnej. Następnie protokół ten jest przydatny do badania infekcji ZIKV i może być wykorzystany do wykrywania innych klinicznie ważnych wirusów.

Ilość ZIKV można określić za pomocą FFA, zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 3. W przypadku płytki 24-dołkowej zakażone komórki Vero utrwalono po 48 h, 60 h, 72 h, 84 h i 96 h od zakażenia. Wyniki wykazały, że komórki pozostały nienaruszone (nie zaobserwowano odrywania się komórek) po 96 h (4 dniach) od zakażenia (Rysunek 4 oraz Rysunek uzupełniający 8A-E). Pojawienie się ognisk wirusowych zaobserwowano po raz pierwszy po 48 h (2 dnia...

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Protokół ten umożliwia identyfikację i ilościowe określenie wirusa Zika bez polegania na efekcie cytopatycznym. Zależy to od rozpoznania przeciwciał w składniku wirusa. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla wirusa może pomóc w identyfikacji różnych serotypów wirusa w populacjach mieszanych.Ta metoda ma przewagę nad klasycznymi testami tworzenia płytki nazębnej. Jest szybszy i umożliwia stosowanie w zastosowaniach o wysokiej przepustowości w przypadku aplikacji z automatycznym systemem obrazowania w celu szybkiego zliczania komórek. Proponowany protokół jest wysoce elastyczny.Przy odpowiednich modyfikacjach proponowany protokół może być stosowany do różnych typów komórek i celów wirusowych. Zacznij od wyhodowania komórek Vero w kolbie do hodowli komórek o powierzchni 75 metrów kwadratowych = centymetrowych, która zawiera 12 mililitrów DMEM uzupełnionych 10% FBS i dwoma milimolami L-glutaminy. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby zainfekować monowarstwę komórkową, użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby usunąć pożywkę wzrostową z kolby do hodowli komórkowych. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej przepłukać kolbę dwukrotnie trzema mililitrami DPBS. Następnie dodaj dwa mililitry DMEM bez surowicy i 20 mikrolitrów inokulum wirusa Zika do kolby do hodowli komórkowej.Pozostawić kolbę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie kołysząc, aby pobudzić adsorpcję wirusa. Pod koniec inkubacji, używając pięciomililitrowej pipety serologicznej, ostrożnie usunąć i wyrzucić rozcieńczony inokulum wirusa z kolby do hodowli komórkowych. Przepłukać kolbę hodowli komórkowej dwukrotnie trzema mililitrami DPBS.Następnie dodaj 12 mililitrów pożywki konserwacyjnej do kolby do hodowli komórkowych, aby utrzymać zainfekowane komórki. Inkubuj zakażone komórki Vero przez trzy dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po trzech dniach inkubacji należy użyć 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby pobrać supernatant kultury komórkowej zawierający wirusa Zika do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.W celu ilościowego określenia wirusa umieść komórki Vero na wyznaczonych płytkach i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Przygotuj sześć sterylnych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych do każdej płytki, aby wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie, w tym dodatkową probówkę do kontroli ujemnej. W przypadku konfiguracji z 24-dołkową płytką dodaj 450 mikrolitrów DMEM bez surowicy do wszystkich sześciu probówek wirówek.W przypadku zestawu z 96-dołkową płytką należy dozować 135 mikrolitrów DMEM bez surowicy do sześciu dodatkowych probówek. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie w eksperymencie z 24-dołkową płytką, dodaj 50 mikrolitrów zapasu wirusa Zika do 10 do minus jednej probówki zawierającej 450 mikrolitrów DMEM bez surowicy. W eksperymencie z 96-dołkową płytką dodaj 15 mikrolitrów bulionu wirusa Zika do 10 do minus jednej probówki zawierającej 135 mikrolitrów DMEM bez surowicy.Wirować każdą probówkę, aby dokładnie wymieszać wirusa i pożywkę, zapewniając równomierne rozprowadzenie cząsteczek wirusa w rozcieńczeniu. Używając świeżej końcówki do pipety, ponownie zawiesić 10 do minus jednej probówki i przenieść 50 i 15 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa Zika do 10 do minus dwóch probówek jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie odpowiednio dla płytek 24- i 96-dołkowych. Usuń i wyrzuć pożywkę kondycyjną dla każdej studzienki odpowiedniej płytki.Przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie DPBS, aby usunąć wszelkie pozostałości. Zaczynając od najwyższego rozcieńczenia, dodać seryjnie rozcieńczony inokulum wirusa do studzienek, dążąc do najniższego rozcieńczenia. Po jednej godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa ze studzienek, zaczynając od najniższego do najwyższego stężenia.Dwukrotnie przemyć zainfekowane komórki DPBS, aby usunąć wszelkie ślady zawiesiny wirusa. Pokryj studzienkę DMEM i 1,5% karboksymetylocelulozą o niskiej lepkości. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po inkubacji usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową i trzykrotnie przemyć komórki PBS. W przypadku płytki 96-dołkowej użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową, a następnie umyj komórki trzykrotnie 60 mikrolitrami PBS na studzienkę. Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Po 20 minutach wyrzuć paraformaldehyd i trzykrotnie umyj komórki PBS. Następnie dodać substrat peroksydazy 3,3'diaminobenzyny i inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności. Po 30 minutach zatrzymaj reakcję, myjąc studzienki wodą.Wysuszyć płytki na powietrzu przez noc i przystąpić do wyliczania ognisk. Policz ogniska dla każdej kontrpróby wybranego rozcieńczenia i oblicz średnią liczbę ognisk dla każdego z nich. Zainfekowane komórki Vero zostały utrwalone w różnych punktach czasowych po infekcji.W przypadku płytki 2-dołkowej pierwsze pojawienie się ognisk wirusa zaobserwowano 48 godzin po zakażeniu, chociaż rozmiar ognisk był zbyt mały, aby można je było dokładnie policzyć. Po 96 godzinach od zakażenia nie było żadnych oznak oderwania komórek. Po 60 godzinach od zakażenia rozmiar ognisk zwiększył się do optymalnego poziomu do liczenia.Następnie, w miarę upływu czasu, ogniska stawały się większe i zaczęły łączyć się lub nakładać na siebie pod względem intensywności, tworząc skupiska, które rosły z czasem. W związku z tym ogniska powstałe 60 godzin po zakażeniu zostały wybrane do określenia miana wirusa Zika w 24-dołkowej płytce. W przypadku płytki 96-dołkowej komórki pozostały nienaruszone po 72 godzinach po zakażeniu.Pojawienie się ognisk wirusa po raz pierwszy zaobserwowano 24 godziny po zakażeniu. Jednak do 36 godzin po zakażeniu rozmiar ognisk był zbyt mały. Optymalna wielkość ognisk została osiągnięta po 48 godzinach od zakażenia.W tych ostatnich punktach czasowych obserwowano nakładające się lub łączone ogniska, a liczba nakładających się ognisk zwiększała się w czasie. Ogniska powstałe 48 godzin po zakażeniu zostały wybrane do określenia miana wirusa izolatów wirusa Zika. Delikatnie dodaj DPBS po boku każdej studzienki i kołysz płytkami do tyłu i do przodu od jednego do trzech razy, aby usunąć resztki komórkowe i nadmiar pożywki.Technika ta przyniesie ogromne korzyści naukowcom zajmującym się badaniami nad wirusem Zika, a także może być szeroko zaadaptowana do ilościowego oznaczania innych klinicznie ważnych wirusów, co czyni ją cennym narzędziem do nadzoru i diagnozowania wirusów.

virus-propagation-and-cell-based-colorimetric-quantification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Poznaj metodę namnażania i kwantyfikacji wirusa Zika w komórkach Vero przy użyciu immunodetekcji kolorymetrycznej. Ta technika umożliwia szybką identyfikację serotypów w mieszanych populacjach bez obserwacji efektu cytopatycznego.

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Przeglądaj więcej filmów