Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Protokół ten jest istotny, ponieważ pokazuje pętle chromosomowe o wysokiej rozdzielczości i inne cechy interakcji krótkiego zasięgu. Główną zaletą tej techniki jest mapowanie organizacji genomu 3D z rozdzielczością nukleosomów o wysokim stosunku sygnału do szumu. Aby przeprowadzić miareczkowanie MNazy, rozmrozić jedną osadkę od jednej razy 10 do szóstej komórki na lodzie przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach DPBS i inkubować zawiesinę komórek na lodzie przez 20 minut.

Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 500 mikrolitrach buforu MB numer jeden. Rozmrozić jedną fiolkę po 20 jednostek na mikrolitr MNazy i rozcieńczyć ją 10 milimolowymi Tris dla warunków trawienia opisanych w tekście.

W odpowiednich odstępach czasu od 10 do 20 sekund dodać jeden mikrolitr pierwszego roztworu do mineralizacji MNazy do jednej z czterech probówek próbek, odwirować i inkubować w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przy 800 obr./min. Kontynuuj dodawanie jednego mikrolitra z pozostałych rozcieńczeń MNazy do pozostałych porcji komórek. Zatrzymać trawienie MNazy, dodając 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu zatrzymującego do każdej probówki w tej samej kolejności i w tym samym przedziale czasu, w którym dodano MNazę.

Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Dodaj 500 mikrolitrów PCI do każdej próbki i dokładnie wymieszaj przez wirowanie. Wirować przy 19 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu rozdzielenia faz.

I przenieś fazę wodną do nowych probówek. Oczyść DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj próbki w 12 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów barwnika ładującego do oczyszczonej próbki DNA.

Uruchom próbki na 1,5% żelu agarozowym i wybierz najlepszy stopień trawienia do eksperymentu. Optymalny stopień trawienia wykazuje niewielką lub żadną liczbę fragmentów subnukleosomalnych oraz stosunek mono do dinukleosomów wynosi od 70 do 90%. W tej reprezentatywnej próbie do dalszych eksperymentów wybrano pośredni stopień trawienia między pasami trzecim i czwartym.

Na podstawie miareczkowania MNazy trawić chromatynę, dodając odpowiednią ilość MNazy do każdej podwielokrotności próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 800 obr./min przez 10 minut. Zatrzymaj trawienie MNazy, dodając 1,6 mikrolitra 0,5 molowego EGTA do każdej podwielokrotności i inkubuj w ThermoMixerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.

Pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach 1X bufor NEB 2.1. Próbki zbiorcze odpowiadające ilości wejściowej pięć razy 10 do szóstej komórki lub mniej do dalszego przetwarzania.

Przed przystąpieniem do ligacji zbliżeniowej należy przenieść 10% próbki jako kontrolę wejściową w celu monitorowania poziomu trawienia MNazy. Dodaj 150 mikrolitrów 10 milimolowych Tris, 25 mikrolitrów 10% SDS i 25 mikrolitrów 20 miligramów na mililitr proteinazy K do kontroli trawienia i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pozostałą próbkę zebrać przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 90 mikrolitrach świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix jeden i inkubować w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 800 obr./min przez 15 minut. Dodać 10 mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr fragmentu Klenowa i inkubować w ThermoMixerze. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master dwa.

Inkubować przez 45 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 800 obr./min i wygasić reakcję enzymatyczną za pomocą EDTA, jak opisano w tekście. Inkubować w termomikserze przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, 800 obr./min. Pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.

Zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanej mikromieszanki głównej Micro-C i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej przy 15 do 20 obr./min. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawiesić próbkę w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix cztery i inkubować w mieszalniku ThermoMixer ustawionym na 37 stopni Celsjusza przez 15 minut przy 800 obr./min.

W celu odwrotnego sieciowania i odbiałczania dodaj 25 mikrolitrów 20 miligramów na mikrolitr proteinazy K i 25 mikrolitrów 10% SDS do próbki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc z przerywanym mieszaniem. Dodaj 500 mikrolitrów PCI do próbek i kontroli wejściowej, a następnie wymieszaj przez wirowanie. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przy 19 800 G przez pięć minut i przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.

Zagęścić DNA i wymyć próbki w 30 mikrolitrach, a kontrole wejściowe w 15 mikrolitrach. Uruchom 1,5% żel agarozowy, aby oddzielić mononukleosomy i dinukleosomy. Wytnij fragmenty DNA, które mają rozmiar dinukleosomalny i wyekstrahuj DNA zgodnie z opisem w tekście.

Dodaj 150 mikrolitrów wstępnie przygotowanych kulek do 150 mikrolitrów próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie. Usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach 1X TBW i powtórz ten krok.

Powtórz separację magnetyczną, a po klarowaniu roztworu usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach 0,1X TE. Powtórzyć i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach 0,1X TE. Przenieś roztwór do probówek PCR i wykonaj manipulację DNA zgodnie z opisem w tekście. Po zakończeniu ligacji adaptera umyj próbkę w 1X TBW, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 20 mikrolitrach 0,1X TE. Zoptymalizuj liczbę cykli PCR i wzmocnij biblioteki sekwencji zgodnie z opisem w tekście. Chromatynę z 250 000 komórek na reakcję trawiono czterokrotnym rozcieńczeniem MNazy.

Najwyższe stężenie, 10 jednostek, wykazało nadmiernie strawioną chromatynę składającą się prawie wyłącznie z mononukleosomalnego DNA. Trawienie 250 000 mysich komórek ES z 0,625 jednostki MNazy stanowiło najbardziej obiecujący punkt wyjścia dla trawienia preparatywnego w eksperymentach Micro-C. Należy jednak wziąć pod uwagę pośrednie stężenie MNazy między warunkami pokazanymi na torach trzecim i czwartym, odpowiadające pięciu jednostkom na 1 milion komórek.

Pasmo mononukleosomu ligowanego zbliżeniowo miało przybliżoną wielkość 300 par zasad, podobną do dinukleosomów. W związku z tym stosunek sygnału pasma mono do dinukleosomów przesunął się z przewagą mononukleosomów w kierunku dinukleosomów. Jakość i ilość przygotowanej biblioteki sekwencjonowania oceniano za pomocą minimalnego PCR.

Wizualizacja pokazała jedno wyraźne pasmo przy 420 parach zasad i brak pasm dla dimerów adapterowych. Podczas gdy obie próbki w tym badaniu wykazywały wysokie wskaźniki map, dobra próba miała wyższy odsetek odczytów cis. Wysoki wskaźnik interakcji transchromosomalnych wskazuje na losowe zdarzenia ligacji, chociaż niektóre interakcje transchromosomalne mogą być ważne.

Ponadto dobra próbka miała umiarkowany wskaźnik par odczytu mapowania do przodu i do tyłu, z odległościami mniejszymi niż 500 par podstaw. Wskazywało to na niski odsetek dinukleosomów nierozszczepionych przez MNazę o wielkości podobnej do dwóch nukleosomów ligowanych zbliżeniowo. Odpowiedni stopień trawienia MNazy ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu.

Nadmiernie strawione nukleosomy są nieefektywnie ligowane, a niedostatecznie strawiona chromatyna ma dużą frakcję niestrawionych dinukleosomów, które mogą zanieczyścić bibliotekę sekwencjonowania. Micro-C można połączyć z podejściem do przechwytywania w celu zmapowania organizacji genomu specyficznej dla locus z niezwykle wysoką rozdzielczością.