Name: Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj metodę Micro-C-XL do mapowania trójwymiarowej organizacji genomu ssaków z rozdzielczością nukleosomową. Technika ta umożliwia badanie pętli chromosomowych i krótkozasięgowych interakcji chromatyny z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christl Gaubitz i Kathleen Stewart-Morgan za ich krytyczną lekturę rękopisu. Dziękujemy Anji Groth i laboratorium Groth za ich wsparcie w tworzeniu naszego laboratorium. Dziękujemy za wsparcie pracownikom platformy CPR/reNEW Genomics: H. Wollmannowi, M. Michautom i A. Kalvisie. Centrum Medycyny Komórek Macierzystych Fundacji Novo Nordisk (reNEW) jest wspierane przez grant Fundacji Novo Nordisk o numerze NNF21CC0073729. Centrum Badań nad Białkami (CPR) Fundacji Novo Nordisk jest wspierane przez grant Fundacji Novo Nordisk o numerze NNF14CC0001. Dziękujemy laboratorium Brickman w Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, za mysie komórki ES.

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+Assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+Micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+details+of+mammalian+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Holde%2C+KE+%22Chromatin%22">Chromatin</a>. , Springer. New York, NY. (1989).</li>
<li>Oksuz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+protocol+for+genome-wide+chromosome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnylab%2Fdistiller-nf%3B+v033%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Mirnylab/distiller-nf; v033.</a> Zenodo. , (2019).</li>
<li>Venev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open2c%2Fcooltools%3A+v0.4.1%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Open2c/cooltools: v0.4.1.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Abdennur, N., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooler%3A+Scalable+storage+for+Hi-C+data+and+other+genomically+labeled+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays.</a> Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-promoter+contact+formation+requires+RNAPII+and+antagonizes+loop+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powodzenie eksperymentu Micro-C zależy od kilku krytycznych kroków w protokole, które muszą być starannie wykonane. Po pierwsze, sieciowanie za pomocą dodatkowego środka sieciującego DSG lub EGS może prowadzić do agregacji komórek, w zależności od typu komórki. Dodanie 0,1%-0,5% BSA do reakcji sieciowania znacznie zmniejsza agregację bez wpływu na wydajność sieciowania. Nieefektywne sieciowanie może skutkować zwiększonymi wskaźnikami interakcji transchromosomalnych, które wskazują na losowe ligacje. Drugim, ale najważniejszym krokiem w tym protokole jest trawienie chromatyny za pomocą MNazy. Nieoptymalne trawienie chromatyny prowadzi do nieefektywnej ligacji zbliżeniowej (nadmierne trawienie) lub zwiększonego tempa dinukleosomów nieligowanych w pobliżu (niedostateczne trawienie). Skuteczność reakcji ligacji można ocenić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ryc. 1B) i dodatkowo najlepiej oszacować za pomocą sekwencjonowania o niskim nakładzie wejściowym. Jeśli sekwencjonowanie o niskim poziomie wejściowym wykaże albo wysoki współczynnik duplikacji (nieefektywna ligacja), albo zwiększony wskaźnik dinukleosomów, należy ponownie ocenić stopień trawienia MNazy. Warto zauważyć, że utrata próbki podczas wykonywania protokołu może prowadzić do zmniejszenia złożoności biblioteki. Stężenie próbki najlepiej ocenić po oczyszczeniu DNA (etap 5.3) lub za pomocą minimalnej reakcji PCR (etap 8). Całkowita wydajność DNA z komórek 5 x 106 ssaków po oczyszczeniu DNA wynosi zwykle >2 μg. Stężenie DNA powinno być kontrolowane po trawieniu MNazą, trawieniu ExoIII i oczyszczaniu DNA. Endogenne nukleazy, których obfitość jest specyficzna dla typu komórki i gatunku, mogą być źródłem degradacji DNA. Ponadto oczyszczanie DNA na podstawie kolumn może prowadzić do utraty próbki z powodu niezgodności z SDS w reakcjach deproteinacji. Wytrącanie etanolu można rozważyć, jeśli stężenie DNA jest niskie na tym etapie.
Ponieważ Micro-C wymaga miareczkowania MNazy specyficznej dla próbki, zastosowanie Micro-C do populacji małych komórek, takich jak małe narządy z różnych organizmów modelowych, zarodki i pojedyncze komórki, organoidy lub biopsje pacjentów, jest trudne. W tym przypadku Hi-C 3.0 oferuje ugruntowaną alternatywę wykorzystującą reakcję końcową za pomocą endonukleaz restrykcyjnych specyficznychdla sekwencji 8,9.
Micro-C to szeroko stosowana technologia konformacji chromosomów o wysokiej rozdzielczości o wysokim zakresie dynamiki i niskim stosunku sygnału do szumu, co czyni ją szczególnie odpowiednią do badania cech chromosomówkrótkiego zasięgu 4,5,8, takich jak pętle chromosomowe. Rozdzielczość Micro-C pozwala na wychwycenie pętli promotor-wzmacniacz, które wykraczają poza granicę wykrywalności Hi-C, skutecznie umożliwiając bardziej szczegółową analizę związku między organizacją genomu a regulacją 13,14,15. Co więcej, strategie wychwytywania DNA zostały niedawno połączone z Micro-C w celu zwiększenia rozdzielczości specyficznej dla locus docelowych loci genomowych do niespotykanych dotąd poziomów, ujawniając nowe informacje na temat ultrastruktury genomu 3D 16,17,18. Podsumowując, przewidujemy, że Micro-C i jego pochodne będą kluczową technologią do analizy roli genomu 3D w regulacji transkrypcji, a w konsekwencji w różnicowaniu i utrzymaniu typów komórek.

Micro-C-XL to technika pomiaru konformacji genomu 3D z rozdzielczością nukleosomów. Micro-C-XL opiera się na szeroko stosowanej technologii Hi-C opartej na ligacji zbliżeniowej, która zmieniła nasze rozumienie organizacji genomów 3D1. Micro-C-XL i jego pierwsza wersja, Micro-C, zostały początkowo opracowane w Saccharomyces cerevisiae2,3, a następnie dostosowane do systemów komórkowych ssaków, dla których protokół wykazał swój pełny potencjał w wykrywaniu cech krótkiego zasięgu genomu 3D, takich jak pętle chromosomów i miejsca izolacji. Ta wersja jest oparta na najnowszych publikacjach Micro-C-XL dotyczących ssaków4,5. Ponieważ Micro-C-XL zastępuje Micro-C, Micro-C-XL jest odtąd określany w manuskrypcie jako Micro-C.
Główne różnice między Micro-C i Hi-C6 są następujące: 1) fragmentacja genomu za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy) w porównaniu z enzymami restrykcyjnymi i 2) dodatkowe środki sieciujące z większymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi w porównaniu tylko z formaldehydem. Oba etapy w znacznym stopniu przyczyniają się do poprawy stosunku sygnału do szumu Micro-C w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Rozmiar fragmentacji ogranicza rozdzielczość, do której organizacja genomu 3D może zostać rozwiązana podczas protokołu ligacji zbliżeniowej. MNaza to nukleaza, która preferencyjnie trawi dostępne DNA i pozostawia nienaruszone DNA chronione nukleosomami. Ślad nukleosomów za pomocą sekwencjonowania MNazy wykazał, że nukleosomy w pełni pokrywają większość genomów eukariotycznych7. Ponieważ nukleosomy są rozmieszczone w całym genomie ze średnimi odstępami 160-220 pz, w zależności od gatunku i typu komórki, MNaza jest idealnym enzymem do mapowania architektury genomu w wysokiej rozdzielczości.
Użycie dodatkowego środka sieciującego w połączeniu z formaldehydem (FA) w metodzie Micro-C dodatkowo poprawia stosunek sygnału do szumu2,8. Specyficzne dla amin środki sieciujące z dłuższymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi ułatwiają wiązanie białko-białko. Są to zazwyczaj glutaran disuccinimidylu (DSG) lub bursztynian bis-sukcynimidylowy glikolu etylenowego (EGS) o odstępach odpowiednio 7,7 A i 16,1 A. Redukcja szumu za pomocą EGS lub DSG jest szczególnie widoczna w eksperymentach o wysokim współczynniku fragmentacji, takich jak Micro-C, i przypuszczalnie występuje z powodu zmniejszenia częstości losowych zdarzeń ligacji8.
Niedawno opracowany protokół Hi-C 3.0, który wykorzystuje sieciowanie ESG/DSG i wiele kombinacji enzymów restrykcyjnych, redukuje szum w eksperymentach Hi-C i znacznie poprawia wykrywanie pętli chromosomowych i miejsc izolacji8,9. Mimo to, porównanie różnych cech danych o interakcjach w poszczególnych lokalizacjach wykazało, że Micro-C miał lepsze wykrywanie cech krótkiego zasięgu, takich jak pętle chromosomowe i miejsca izolacji, w porównaniu zarówno z Hi-C 3.0, jak i konwencjonalnym Hi-C8. Jednak Hi-C 3.0 poprawia wykrywanie cech krótkiego zasięgu i utrzymuje silną detekcję przedziałów genomu w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Podsumowując, wybór metody wychwytywania konformacji chromosomów powinien być podyktowany kwestią obiektywną i biologiczną.
Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół dla udanych eksperymentów Micro-C, które mogą rozwikłać organizację genomu 3D.

<table><tbody><tr><td>1 mM Biotyna dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotyna dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Egzonukleaza III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 Bufor ligazy DNA&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS bez Mg2+ i Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0,1 mM b-merkaptoetanolu&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligaze&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Fragment Klenowa</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>określany jako: magnes magnetyczny do probówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>określany jako: magnes magnetyczny do probówek PCR</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0,5M pH 8,0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%&nbsp;</td>System kontroli <td>jakości 20824365</td> <td>firmy VWR Chemical</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromek etydyny&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy bis(bursztynian sukcynimidylu) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>15%</td></tr><tr><td>FBS Gel Barwnik ładujący fioletowy (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor Halt Proteinazy (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>mysie embrionalne komórki macierzyste&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (startery Dual Index)</td><td>Startery</td><td>wzmacniające NEB E7600S</td><td>do bibliotek sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki NEBNext Ultra II DNA dla biblioteki</td> sekwencjonowania Illumina <td>NEB</td><td>E7645L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinaza K (40 mg / ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Uwaga. Zobacz producentów MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>określany jako: Zestaw do elucji żelu DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>określany jako: komercyjny zestaw do oczyszczania DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania ilościowego DNA Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>przyrząd do kwantyfikacji DNA o wysokiej czułości&nbsp;</td></tr><tr><td>Szybkie ładowanie fioletowy 1kb plus Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIwybierz rozmiar koraliki do wyboru Beckman</td><td>Coulter</td><td>B23319</td><td>koraliki paramagnetyczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszalnik ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5382000015</td><td>określany jako: termomikser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysty fenol chloroform Alkohol izoamylowy (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Analizator</td><td></td><td></td><td></td> fragmentów</tr></tbody></table>

mapowanie interakcji genomu 3d ssaków za pomocą micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

Trójwymiarowa (3D) organizacja chromosomów jest głównym czynnikiem regulacji genomu i specyfikacji typu komórki. Na przykład uważa się, że elementy cis-regulatorowe, znane jako wzmacniacze, regulują aktywność dystalnych promotorów poprzez interakcję w przestrzeni 3D. Technologie wychwytywania konformacji chromosomów w całym genomie (3C), takie jak Hi-C, zmieniły nasze rozumienie organizacji genomów w komórkach. Obecne zrozumienie organizacji genomu 3D jest ograniczone rozdzielczością, z jaką można rozwiązać topologiczną organizację chromosomów w przestrzeni 3D. Micro-C-XL mierzy fałdowanie chromosomów z rozdzielczością na poziomie nukleosomu, podstawowej jednostki chromatyny, wykorzystując nukleazę mikrokokową (MNazę) do fragmentacji genomów podczas protokołu wychwytywania konformacji chromosomów. Skutkuje to lepszym stosunkiem sygnału do szumu w pomiarach, ułatwiając w ten sposób lepsze wykrywanie miejsc izolacji i pętli chromosomowych w porównaniu z innymi technologiami 3D obejmującymi cały genom. W artykule przedstawiono wizualnie, szczegółowy protokół krok po kroku do przygotowania wysokiej jakości próbek Micro-C-XL z komórek ssaków.

Prawidłowe przygotowanie bibliotek Micro-C można ocenić na kilku etapach protokołu. Najważniejszym krokiem jest wybór odpowiedniego stopnia trawienia przez MNase. W związku z tym należy przeprowadzić miareczkowanie stężenia MNase, aby w każdej próbce konsekwentnie uzyskiwać 70%-90% mono-nukleosomów w stosunku do di-nukleosomów. Należy zauważyć, że trawienie chromatyny przebiega inaczej w przypadku euchromatyny i heterochromatyny, przy czym MNase trawi heterochromatynę mniej efektywnie. Zatem optymalny stopień trawienia zależy od analizowanego regionu chromatyny oraz badanego typu komórek, ponieważ względna proporcja euchromatyny i heterochromatyny jest specyficzna dla danego typu komórek. Dlatego zaleca się staranne miareczkowanie wymaganego stężenia MNase oraz wstępną ocenę sukcesu eksperymentu Micro-C za pomocą sekwencjonowania materiału o niskiej ilości wejściowej (low-input sequencing).
Typowy wzór miareczkowania MNase chromatyny traktowanej malejącymi ilościami MNase przedstawiono na Rysunku 1A. Tutaj chromatyna z 250 000 komórek na reakcję jest trawiona czterokrotnym rozcieńczeniem MNase. Najwyższe stężenie (10 U MNase, ścieżka 2) wykazuje przetrawioną nadmiernie chromatynę, składającą się niemal wyłącznie z DNA mononukleosomalnego (~150 bp). Co istotne, centrum prążka mononukleosomalnego w żelu agarozowym znajduje się niżej w porównaniu z odpowiadającymi mu prążkami w próbkach z mniejszymi stężeniami MNase, co wskazuje na nadmierne trawienie DNA nukleosomalnego. Nadmiernie przetrawione nukleosomy ulegają nieefektywnej ligacji w reakcji ligacji w bliskości; zatem próbka na ścieżce 2 jest suboptymalna dla eksperymentów Micro-C. Ścieżka 3 (2,5 U MNase) wykazuje niemal odpowiedni stopień trawienia dla eksperymentów Micro-C. W tym przypadku prążek mononukleosomalny jest dominującym gatunkiem, a smug podnukleosomalna, świadcząca o nadmiernie przetrawionych nukleosomach, jest zredukowana, choć wciąż obecna. Stopień trawienia na ścieżce 4 (0,635 U MNase) stanowi idealny warunek dla eksperymentu Micro-C w tym przykładzie miareczkowania. Obecny jest wyraźny prążek mononukleosomalny bez DNA podnukleosomalnego. Intensywność prążków dla DNA mononukleosomalnego i dinukleosomalnego jest niemal równa, co wskazuje na wydajność mononukleosomów na poziomie 66% lub wyższym. Warto zauważyć, że DNA dinukleosomalne jest około dwukrotnie większe od DNA mononukleosomalnego (~320 bp vs. ~150 bp), zatem intensywność jego prążka na mol DNA jest dwukrotnie wyższa w porównaniu z jego mononukleosomalnym odpowiednikiem. Stopień trawienia na ścieżce 5 (0,156 U MNase) wykazuje niedostatecznie przetrawioną chromatynę z niemal całkowitym brakiem DNA nukleosomalnego, co czyni tę próbkę suboptymalną.
Podsumowując, w tym przykładzie trawienie 2,5 x 105 mysich komórek ES przy użyciu 0,625 U MNase (co odpowiada 2,5 U MNase na 1 x 106 komórek w 200 µL) stanowi najbardziej obiecujący punkt wyjścia dla trawień preparatywnych w eksperymentach Micro-C. Należy jednak rozważyć również pośrednie stężenie MNase między warunkami zastosowanymi dla próbek w ścieżce 3 i ścieżce 4 (co odpowiada 5 U MNase na 1 x 106 komórek w 200 µL). Co ważne, trawienie chromatyny za pomocą MNase nie może być skalowane liniowo i nie zaleca się zwiększania skali trawienia preparatywnego ponad 4-krotnie. Aby przygotować biblioteki Micro-C z więcej niż 1 x 106 komórek, zaleca się trawienie chromatyny w aliquotach po 1 x 106 komórek i ich łączenie po inaktywacji MNase.
Aby ocenić skuteczność protokołu ligacji bliskościowej, kontrolę wejściową, która została poddana trawieniu MNazą, ale nie ligacji bliskościowej (krok 3.8), należy porównać z próbką poddaną ligacji bliskościowej (krok 5.3) za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym (Ryc. 1B). Prążek mono-nukleosomu po ligacji bliskościowej ma wielkość około 300 bp, podobnie jak di-nukleosomy. W związku z tym stosunek sygnału prążka mono- do di-nukleosomowego powinien przesunąć się z przewagi mono-nukleosomów (ścieżka 1) w stronę di-nukleosomów (ścieżka 3 i ścieżka 4). Ponieważ z żelu agarozowego na tym etapie wycina się i oczyszcza DNA di-nukleosomowe, zaleca się rozdzielenie próbek na kilka ścieżek, aby uniknąć ich przeładowania.
Zaleca się ocenę jakości i ilości przygotowanej biblioteki sekwencjonowania za pomocą minimalnej reakcji PCR. W tej procedurze DNA z 1 µL kulek (1/20 całkowitej próbki) jest amplifikowane przez 16 cykli w 10 µL mieszaniny reakcyjnej PCR. Całkowita koncentracja biblioteki z minimalnego PCR zazwyczaj mieści się w zakresie 50-500 ng po 16 cyklach PCR. Teoretycznie odpowiada to bibliotece o masie 1-10 µg z pozostałych 19 µL próbki, gdyby ona również została amplifikowana przez 16 cykli. Zaleca się stosowanie minimalnej liczby cykli PCR niezbędnej do wygenerowania biblioteki o masie około 100 ng z całkowitej ilości DNA. Zakładając logarytmiczną amplifikację w PCR, teoretyczną koncentrację DNA otrzymanego z 19 µL materiału wyjściowego przy 16 cyklach można sukcesywnie dzielić przez dwa, aby obliczyć liczbę cykli PCR wymaganą do wygenerowania biblioteki o masie 100 ng. Na przykład uzyskanie 100 ng z 1 µL po 16 cyklach odpowiada uzyskowi 1 900 ng przy amplifikacji z 19 µL. W tym scenariuszu 12 cykli powinno idealnie wygenerować bibliotekę sekwencjonowania o masie 118 ng z całkowitej ilości DNA (1 900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Pozostałe 9 µL próbki z minimalnego PCR można następnie wykorzystać do oceny jakości biblioteki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Ryc. 1C). Wizualizacja powinna wykazać jeden wyraźny prążek przy 420 bp oraz brak prążków dla dimerów adapterów (120 bp). Mogą pojawić się również mniejsze fragmenty, które odpowiadają niewykorzystanym starterom PCR.
Następnie, przed przystąpieniem do zasobożernym sekwencjonowania głębokiego, zaleca się analizę i potwierdzenie poprawnego przygotowania próbek Micro-C za pomocą sekwencjonowania z niskim wkładem materiału. Zazwyczaj biblioteki są sekwencjonowane do głębokości odczytu od 5 x 106 do 1 x 107 i oceniane na podstawie następujących kryteriów: wskaźnika duplikacji odczytów sekwencjonowania, stosunku interakcji cis- do trans-chromosomalnych oraz częstotliwości orientacji odczytów sekwencjonowania. Biblioteki Micro-C są przetwarzane za pomocą Distiller, kompletnego potoku analitycznego, który przetwarza dane z plików odczytów sekwencjonowania (format Fastq) na pliki par odczytów (format Bedpe) i skalowalne macierze interakcji (formaty Cool i Mcool), wykorzystując cooler, pairtools oraz cooltools10,11,12. Potok generuje również plik podsumowujący, który jest idealny do oceny jakości bibliotek Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Wskaźnik duplikacji PCR dostarcza informacji o złożoności biblioteki sekwencjonowania i może zostać wyodrębniony z wygenerowanego pliku *.stats. Wysokiej jakości biblioteki Micro-C wygenerowane z 5 milionów lub więcej komórek charakteryzują się wskaźnikiem duplikacji PCR poniżej 5%-10%. Należy zauważyć, że niektóre platformy sekwencjonowania generują duplikaty PCR podczas formowania klastrów, niezależnie od złożoności biblioteki sekwencjonowania. Rycina 2A przedstawia względne wskaźniki duplikacji dla dwóch eksperymentów: jednego, który uznajemy za próbkę dobrą, oraz jednego będącego próbką złą. W tym przykładzie obie próbki wykazały akceptowalne wskaźniki mapowania. Kolejnymi kryteriami oceny jakości bibliotek Micro-C są stosunek cis do trans oraz częstotliwości orientacji odczytów. W obrębie jądra komórkowego chromosomy zajmują oddzielne terytoria chromosomalne i w związku z tym rzadko oddziałują z innymi chromosomami. Wysoki wskaźnik wykrytych interakcji trans-chromosomalnych wskazuje na wysoką częstotliwość losowych ligacji. Należy odnotować, że na tym poziomie analizy zła próbka wykazała wysoki wskaźnik interakcji trans-chromosomalnych w porównaniu z dobrą próbką (Rycina 2B). W przypadku Micro-C pożądanym jest wskaźnik interakcji cis-chromosomalnych na poziomie 70% lub wyższym.
Biblioteka Micro-C zawiera fragmenty o rozmiarze zbliżonym do prążka DNA dinukleosomowego, który może współoczyszczać się z próbką poddaną ligacji zbliżeniowej i zanieczyszczać eksperyment. Zanieczyszczenia te są zawsze oddziaływaniami cis-chromosomalnymi. Dlatego ważne jest również przeprowadzenie oceny częstości orientacji odczytów. Częstość zanieczyszczenia dinukleosomowego można oszacować za pomocą sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing). DNA dinukleosomowe pochodzi z dwóch sąsiadujących nukleosomów, które nie zostały przecięte przez MNase. W związku z tym powstałe odczyty sekwencjonowania zawsze będą wykazywać orientację odczytu forward-reverse (F i R), a odległość między parami odczytów będzie wynosić około 320 bp. Fragmenty poddane ligacji zbliżeniowej mogą w porównaniu do nich być ligowane w czterech orientacjach, dając pary odczytów F-R, R-R, R-F i F-F, idealnie w równym obfitości (Rycyna 2C). Ponadto wykazują one różne odległości między dwiema parami odczytów. Aby oszacować ilość zanieczyszczeń dinukleosomowych, częstość orientacji odczytów można obliczyć z plików *stats generowanych przez program distiller (Rycyna 2D). Co istotne, w niniejszej pracy frakcja odczytów F-R (czerwona) była wyższa w próbce złej w porównaniu z próbką dobrą, co stało się bardziej widoczne po przeprowadzeniu stratyfikacji orientacji odczytów ze względu na odległość (Rycyna 2E). Frakcja F-R jest zdominowana przez fragmenty dinukleosomowe w porównaniu z bibliotekami Micro-C, gdy pary odczytów są stratyfikowane na odczyty o odległościach &lt;562 bp lub ≥562 bp. Tutaj frakcja odczytów o odległości &lt;562 bp jest zdominowana przez odczyty F-R, podczas gdy frakcja o odległościach ≥562 bp wykazuje równomierny rozkład między cztery możliwe orientacje, co wskazuje, że globalna nadreprezentacja odczytów F-R wynika z zanieczyszczeń dinukleosomowych. Wybór 562 bp jako progu dla podziału na podzbiory jest zdefiniowany przez binowanie w wygenerowanym pliku *stats. Choć nie jest to konieczne dla tej kontroli jakości, bardziej precyzyjny podział można osiągnąć poprzez wyodrębnienie odległości z pliku *pairs, który również jest generowany przez program distiller. Należy zauważyć, że odczyty dinukleosomowe nie obniżają jakości próbki Micro-C, ponieważ mogą zostać zidentyfikowane i pominięte podczas przetwarzania danych. Jednak nie zawierają one cennych informacji o oddziaływaniach 3D i rozcieńczają one odczyty informacyjne.
Zatem staranna miareczkowanie MNase oraz rzetelna kontrola jakości z wykorzystaniem sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing) są najlepszymi narzędziami do optymalizacji jakości eksperymentów Micro-C.
<img alt="Wyniki elektroforezy, biblioteki Micro-C, subnukleosomalne DNA, ligacja i analiza wielkości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etapy pośrednie protokołu Micro-C. (A) Elektroforeza żelowa na agarozie chromatyny z 2,5 x 105 mysich komórek ES trawionych różnymi stężeniami MNase. Prążki mono-, di- i trinukleosomalne są zaznaczone strzałkami. M: drabinka DNA (ścieżka 1/6); 10 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 2); 2,5 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 3); 0,625 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 4); 0,156 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 2). (B) Elektroforeza żelowa na 1,0% agarozie przygotowanych próbek Micro-C (ścieżka 3 i ścieżka 4) oraz kontroli wejściowej trawionej MNase (ścieżka 1). Ścieżka 1 i ścieżka 2 (M: drabinka DNA) zostały wzmocnione, aby podkreślić względną zmianę intensywności fragmentów mononukleosomalnych względem dinukleosomalnych. Prążki mono- i dinukleosomalne są zaznaczone strzałkami. Prążek dinukleosomalny w próbce poddanej ligacji bliskościowej obejmuje DNA dinukleosomalne oraz DNA biblioteki Micro-C. (C) Elektroforeza żelowa na 1,0% agarozie bibliotek sekwencyjnych Micro-C amplifikowanych z 1 µL próbki w celu oceny jakości. Ścieżka 1 (M): drabinka DNA; ścieżka 2 (S): biblioteka Micro-C. (D) Wykres z analizatora fragmentów (Fragment Analyzer) końcowej biblioteki Micro-C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań chromatyny; wykresy słupkowe; odczyty zmapowane/niezmapowane, odczyty cis/trans-chromosomalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Statystyki próbek dla sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing) w przypadku dobrej i złej próbki. (A) Wykres słupkowy procenta odczytów zmapowanych (zielony) i niezmapowanych (czerwony). (B) Znormalizowany ułamek odczytów mapujących oddziaływania cis- i trans-chromosomalne. Zestawy danych zostały znormalizowane do odczytów mapujących w cis. Odczyty mapujące w cis zostały podzielone warstwowo ze względu na odległość między pierwszym a drugim odczytem w próbkach sekwencjonowanych metodą paired-end: ≤1 kbp (żółty), &gt;1 kbp i ≤10 kbp (pomarańczowy) oraz &gt;10 kbp (czerwony). (C) Schemat potencjalnych form molekularnych o rozmiarach di-nukleosomalnych. (D) Procentowe udziały orientacji par odczytów dla wszystkich odczytów z dobrej i złej próbki. (E) Analogicznie jak w panelu (D), ale z podziałem na odległości (lewo, &lt;562 bp i prawo, ≥562 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>44 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 µL 100 mM ATP</td>
			<td>2 µL</td>
			<td>8.8 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM DTT</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>22 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>68 µL</td>
			<td>299.2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 j./µL T4 PNK</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>22 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>90 µL</td>
			<td>396 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Master mix Micro-C 1. Skład master mixu do reakcji trawienia końców.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM biotyny-dATP</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>44 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Biotyna-dCTP</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>44 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina dTTP i dGTP o stężeniu 10 mM</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>4.4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x bufor do ligazy T4 DNA</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>22 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200x BSA</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>1.1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>23.75 µL</td>
			<td>104.5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Master mix Micro-C 2. Skład master mixu do reakcji znakowania końcowego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składniki</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEB T4 Ligase reaction buffer</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>220 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>422,5 µL</td>
			<td>1859 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>25 µL</td>
			<td>110µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Micro-C master mix 3. Skład master mixu do reakcji ligacji bliskościowej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>88 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>180 µL</td>
			<td>792 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nukleaza ExoIII</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>44 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Master mix Micro-C 4. Skład master mixu do reakcji usuwania biotyny.

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pokazuje pętle chromosomowe o wysokiej rozdzielczości i inne cechy interakcji krótkiego zasięgu. Główną zaletą tej techniki jest mapowanie organizacji genomu 3D z rozdzielczością nukleosomów o wysokim stosunku sygnału do szumu. Aby przeprowadzić miareczkowanie MNazy, rozmrozić jedną osadkę od jednej razy 10 do szóstej komórki na lodzie przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach DPBS i inkubować zawiesinę komórek na lodzie przez 20 minut.Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 500 mikrolitrach buforu MB numer jeden. Rozmrozić jedną fiolkę po 20 jednostek na mikrolitr MNazy i rozcieńczyć ją 10 milimolowymi Tris dla warunków trawienia opisanych w tekście.W odpowiednich odstępach czasu od 10 do 20 sekund dodać jeden mikrolitr pierwszego roztworu do mineralizacji MNazy do jednej z czterech probówek próbek, odwirować i inkubować w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut przy 800 obr./min. Kontynuuj dodawanie jednego mikrolitra z pozostałych rozcieńczeń MNazy do pozostałych porcji komórek. Zatrzymać trawienie MNazy, dodając 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu zatrzymującego do każdej probówki w tej samej kolejności i w tym samym przedziale czasu, w którym dodano MNazę.Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Dodaj 500 mikrolitrów PCI do każdej próbki i dokładnie wymieszaj przez wirowanie. Wirować przy 19 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu rozdzielenia faz.I przenieś fazę wodną do nowych probówek. Oczyść DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj próbki w 12 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów barwnika ładującego do oczyszczonej próbki DNA.Uruchom próbki na 1,5% żelu agarozowym i wybierz najlepszy stopień trawienia do eksperymentu. Optymalny stopień trawienia wykazuje niewielką lub żadną liczbę fragmentów subnukleosomalnych oraz stosunek mono do dinukleosomów wynosi od 70 do 90%. W tej reprezentatywnej próbie do dalszych eksperymentów wybrano pośredni stopień trawienia między pasami trzecim i czwartym.Na podstawie miareczkowania MNazy trawić chromatynę, dodając odpowiednią ilość MNazy do każdej podwielokrotności próbki. Dobrze wymieszaj i inkubuj w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 800 obr./min przez 10 minut. Zatrzymaj trawienie MNazy, dodając 1,6 mikrolitra 0,5 molowego EGTA do każdej podwielokrotności i inkubuj w ThermoMixerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.Pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach 1X bufor NEB 2.1. Próbki zbiorcze odpowiadające ilości wejściowej pięć razy 10 do szóstej komórki lub mniej do dalszego przetwarzania.Przed przystąpieniem do ligacji zbliżeniowej należy przenieść 10% próbki jako kontrolę wejściową w celu monitorowania poziomu trawienia MNazy. Dodaj 150 mikrolitrów 10 milimolowych Tris, 25 mikrolitrów 10% SDS i 25 mikrolitrów 20 miligramów na mililitr proteinazy K do kontroli trawienia i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pozostałą próbkę zebrać przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w 90 mikrolitrach świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix jeden i inkubować w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 800 obr./min przez 15 minut. Dodać 10 mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr fragmentu Klenowa i inkubować w ThermoMixerze. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master dwa.Inkubować przez 45 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 800 obr./min i wygasić reakcję enzymatyczną za pomocą EDTA, jak opisano w tekście. Inkubować w termomikserze przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, 800 obr./min. Pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanej mikromieszanki głównej Micro-C i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej przy 15 do 20 obr./min. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawiesić próbkę w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix cztery i inkubować w mieszalniku ThermoMixer ustawionym na 37 stopni Celsjusza przez 15 minut przy 800 obr./min.W celu odwrotnego sieciowania i odbiałczania dodaj 25 mikrolitrów 20 miligramów na mikrolitr proteinazy K i 25 mikrolitrów 10% SDS do próbki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc z przerywanym mieszaniem. Dodaj 500 mikrolitrów PCI do próbek i kontroli wejściowej, a następnie wymieszaj przez wirowanie. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przy 19 800 G przez pięć minut i przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.Zagęścić DNA i wymyć próbki w 30 mikrolitrach, a kontrole wejściowe w 15 mikrolitrach. Uruchom 1,5% żel agarozowy, aby oddzielić mononukleosomy i dinukleosomy. Wytnij fragmenty DNA, które mają rozmiar dinukleosomalny i wyekstrahuj DNA zgodnie z opisem w tekście.Dodaj 150 mikrolitrów wstępnie przygotowanych kulek do 150 mikrolitrów próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie. Usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach 1X TBW i powtórz ten krok.Powtórz separację magnetyczną, a po klarowaniu roztworu usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach 0,1X TE. Powtórzyć i ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach 0,1X TE. Przenieś roztwór do probówek PCR i wykonaj manipulację DNA zgodnie z opisem w tekście. Po zakończeniu ligacji adaptera umyj próbkę w 1X TBW, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 20 mikrolitrach 0,1X TE. Zoptymalizuj liczbę cykli PCR i wzmocnij biblioteki sekwencji zgodnie z opisem w tekście. Chromatynę z 250 000 komórek na reakcję trawiono czterokrotnym rozcieńczeniem MNazy.Najwyższe stężenie, 10 jednostek, wykazało nadmiernie strawioną chromatynę składającą się prawie wyłącznie z mononukleosomalnego DNA. Trawienie 250 000 mysich komórek ES z 0,625 jednostki MNazy stanowiło najbardziej obiecujący punkt wyjścia dla trawienia preparatywnego w eksperymentach Micro-C. Należy jednak wziąć pod uwagę pośrednie stężenie MNazy między warunkami pokazanymi na torach trzecim i czwartym, odpowiadające pięciu jednostkom na 1 milion komórek.Pasmo mononukleosomu ligowanego zbliżeniowo miało przybliżoną wielkość 300 par zasad, podobną do dinukleosomów. W związku z tym stosunek sygnału pasma mono do dinukleosomów przesunął się z przewagą mononukleosomów w kierunku dinukleosomów. Jakość i ilość przygotowanej biblioteki sekwencjonowania oceniano za pomocą minimalnego PCR.Wizualizacja pokazała jedno wyraźne pasmo przy 420 parach zasad i brak pasm dla dimerów adapterowych. Podczas gdy obie próbki w tym badaniu wykazywały wysokie wskaźniki map, dobra próba miała wyższy odsetek odczytów cis. Wysoki wskaźnik interakcji transchromosomalnych wskazuje na losowe zdarzenia ligacji, chociaż niektóre interakcje transchromosomalne mogą być ważne.Ponadto dobra próbka miała umiarkowany wskaźnik par odczytu mapowania do przodu i do tyłu, z odległościami mniejszymi niż 500 par podstaw. Wskazywało to na niski odsetek dinukleosomów nierozszczepionych przez MNazę o wielkości podobnej do dwóch nukleosomów ligowanych zbliżeniowo. Odpowiedni stopień trawienia MNazy ma kluczowe znaczenie dla tego eksperymentu.Nadmiernie strawione nukleosomy są nieefektywnie ligowane, a niedostatecznie strawiona chromatyna ma dużą frakcję niestrawionych dinukleosomów, które mogą zanieczyścić bibliotekę sekwencjonowania. Micro-C można połączyć z podejściem do przechwytywania w celu zmapowania organizacji genomu specyficznej dla locus z niezwykle wysoką rozdzielczością.

mapping-mammalian-3d-genome-interactions-with-micro-c-xl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Test ACT (associated chromosome trap) jest nową, nieobciążoną metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań DNA. Charakterystyka dalekosiężnych oddziaływań DNA pozwoli nam określić związek architektury jądra z ekspresją genów zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.

Zintegrowana pułapka chromosomowa do identyfikacji długodystansowych oddziaływań DNA

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Poznaj metodę Micro-C-XL do mapowania trójwymiarowej organizacji genomu ssaków z rozdzielczością nukleosomową. Technika ta umożliwia badanie pętli chromosomowych i krótkozasięgowych interakcji chromatyny z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Przeglądaj więcej filmów