Name: Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj mikroskopię poklatkową z zubożeniem białek w mejozie Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala identyfikować unikalne funkcje białek podczas segregacji chromosomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Obrazowania Mikroskopii Świetlnej na Uniwersytecie Indiana. Prace te zostały wsparte grantem z National Institutes of Health (GM105755).

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ten łączy w sobie system NDT80-in do synchronizacji komórek, technikę kotwiczenia do zubożenia białek z jądra oraz fluorescencyjną mikroskopię poklatkową do obrazowania pączkujących komórek drożdży podczas mejozy. System NDT80-in to metoda synchronizacji mejotycznego cyklu komórkowego, która wykorzystuje zatrzymanie i uwolnienie profazy I 4,8. Chociaż poszczególne komórki będą się nieznacznie różnić pod względem ilości czasu spędzonego ...

Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna jest cennym narzędziem do badania dynamiki segregacji chromosomów mejotycznych u pączkujących drożdży1,2. Pączkujące komórki drożdży mogą zostać nakłonione do poddania się mejozie poprzez głód kluczowych składników odżywczych3. Podczas mejozy komórki przechodzą jedną rundę segregacji chromosomów, po której następują dwa podziały, aby utworzyć cztery produkty mejotyczne, które są pakowane w zarodniki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Poszczególne komórki mogą być wizualizowane na każdym etapie mejozy, co generuje dane przestrzenne i czasowe, które można łatwo przeoczyć za pomocą obrazowania komórek stałych. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób połączenie poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej z dwiema wcześniej ustalonymi metodami, indukowalnym systemem NDT80 (NDT80-in) i techniką zakotwiczenia, może być wykorzystane do badania funkcji określonych białek w różnych stadiach mejotycznych.
System NDT80-in to potężne narzędzie do synchronizacji mejotycznego cyklu komórkowego, które opiera się na indukowalnej ekspresji środkowego czynnika transkrypcyjnego mejozy NDT804,5. Wyrażenie NDT80 jest wymagane dla prophase I exit6,7. Dzięki systemowi NDT80-in, NDT80 jest pod kontrolą promotora GAL1-10 w komórkach eksprymujących czynnik transkrypcyjny Gal4 połączony z receptorem estrogenowym (Gal4-ER)4,5. Ponieważ Gal4-ER dostaje się do jądra tylko wtedy, gdy jest związany z β-estradiolem, komórki NDT80-in zatrzymują się w profazie I pod nieobecność β-estradiolu, co umożliwia synchronizację komórek w profazie I (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Dodatek β-estradiolu sprzyja translokacji czynnika transkrypcyjnego Gal4-ER do jądra, gdzie wiąże GAL1-10, aby napędzać ekspresję NDT80, prowadząc do synchronicznego wejścia do podziałów mejotycznych. Chociaż mikroskopia poklatkowa może być wykonywana bez synchronizacji, zaletą korzystania z synchronizacji jest możliwość dodania inhibitora lub leku, gdy komórki znajdują się na określonym etapie mejozy.
Technika kotwiczenia to indukowalny system, dzięki któremu białko może zostać usunięte z jądra przez dodanie rapamycyny8. Technika ta jest idealna do badania białek jądrowych podczas podziału komórek w pączkujących drożdżach, ponieważ komórki drożdży przechodzą zamkniętą mitozę i mejozę, w której otoczka jądrowa nie ulega rozpadowi. Co więcej, technika ta jest bardzo przydatna w przypadku białek, które pełnią wiele funkcji podczas mejozy. W przeciwieństwie do delecji, zmutowanych alleli lub mejotycznych alleli zerowych, usunięcie białka docelowego z jądra na określonym etapie nie wpływa negatywnie na aktywność białka docelowego na wcześniejszych etapach, co pozwala na dokładniejszą interpretację wyników. System zakotwiczenia wykorzystuje przenoszenie podjednostek rybosomalnych między jądrem a cytoplazmą, które następuje podczas dojrzewania rybosomów8. Aby zubożyć białko docelowe z jądra, białko docelowe jest znakowane domeną wiążącą FKBP12-rapamycynę (FRB) w szczepie, w którym podjednostka rybosomalna Rpl13A jest znakowana FKBP12. Bez rapamycyny FRB i FKBP12 nie wchodzą w interakcje, a białko znakowane FRB pozostaje w jądrze. Po dodaniu rapamycyny, rapamycyna tworzy stabilny kompleks z FKBP12 i FRB, a kompleks jest transportowany z jądra w wyniku interakcji z Rpl13A (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Aby zapobiec śmierci komórki po dodaniu rapamycyny, komórki są nosicielami mutacji tor1-1 genu TOR1. Dodatkowo komórki te zawierają fpr1Δ, allel zerowy białka S. cerevisiae FKBP12, który zapobiega endogennemu Fpr1 konkurowaniu z Rpl13A-FKBP12 dla wiązania FRB i rapamycyny. Mutacje tła zakotwiczenia, tor1-1 i fpr1Δ, nie wpływają na czasy mejotyczne ani segregację chromosomów2.
Aby zademonstrować użyteczność tej techniki, białko kinetochorowe Ctf19 było wyczerpywane w różnych punktach czasowych podczas mejozy. Ctf19 jest składnikiem kinetochoru, który jest zbędny w mitozie, ale wymagany do prawidłowej segregacji chromosomów w mejozie9,10,11,12,13. W mejozie kinetochor jest zrzucany w profazie I, a Ctf19 jest ważny dla ponownego złożenia kinetochoru9,14. W tym protokole zsynchronizowano komórki z systemem NDT80-in, a technikę zakotwiczenia zastosowano w celu wyczerpania docelowego białka Ctf19 z jądra przed i po uwolnieniu z profazy I oraz po segregacji chromosomów mejozy I (<silna klasa = "xfig" >Figura 1). Protokół ten można dostosować do zubożenia innych interesujących białek na dowolnym etapie mejozy i mitozy.

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>Zrób 1mM zapasy w 95% EtOH</td></tr><tr><td>0,22 uM Gwintowany filtr butelkowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific BP399500</td><td></td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:10 do stosowania jako rozpuszczalnik do</td></tr><tr><td>ConA 24 mm x 50 mm szkiełko nakrywkowe nr 1,5</td><td>VWR Północnoamerykańskie</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe 25 mm x 75 mm</td><td>VWR North American</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Sól półsiarczanu adeniny</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>Do uzupełnienia SC, SCA i 1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Zrób jako 1 mg / ml w 1X</td></tr><tr><td>kamerze CCD PBS CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometria</td><td></td><td>stosowana w sekcji 4.3</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco Drożdże Azot Zasada bez aminokwasów</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Milipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 Mikroskop z odwróconym obiektywem</td><td>Nikon</td><td></td><td>Używany w sekcji 4.4</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>NIH</td><td></td><td>Pobierz z https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Osobisty mikroskop DeltaVision</td><td>Stosowana precyzja</td><td></td><td>stosowana w sekcji 4.3</td></tr><tr><td>L-tryptofan&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>Do suplementu SC, SCA i 1% Kac</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Crayola</td><td>&nbsp; 2302880000</td><td>Aby zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe w uchwycie na szkiełko</td></tr><tr><td>NIS Elements AR 5.30.04 Oprogramowanie do obrazowania</td> firmy <td>Nikon</td><td></td><td>używane w sekcji 4.4</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>Używane w sekcji 4.4</td></tr><tr><td>Plastikowy uchwyt końcówki do pipet</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Wytnij przekrój 4 kwadraty x 4 kwadraty części stojaka tego produktu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td><td>Wytwarzaj zapasy 1 mg / ml w</td></tr><tr><td>uszczelniaczu silikonowym</td> DMSO <td>Aqueon</td><td>100165001</td><td>Znany również jako klej akwariowy.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp; Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Stosowana precyzja</td><td></td><td>zastosowana w sekcji 4.3</td></tr><tr><td>Syntetyczna kompletna mieszanina (Kaiser)&nbsp;</td><td>Olejek</td><td></td> immersyjny Formedium DSCK2500 <td></td></tr><tr><td>Type N&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna zrewolucjonizowała zrozumienie mejotycznych zdarzeń cyklu komórkowego, dostarczając danych czasowych i przestrzennych, które często nie są widoczne podczas obrazowania stałych komórek. Pączkujące drożdże okazały się ważnym organizmem modelowym do badania mejotycznej segregacji chromosomów, ponieważ wiele genów mejotycznych jest wysoce konserwatywnych. Mikroskopia poklatkowa mejozy u pączkujących drożdży pozwala na monitorowanie różnych mutantów mejotycznych w celu pokazania, w jaki sposób mutacja zakłóca procesy mejotyczne. Jednak wiele białek funkcjonuje w wielu punktach mejozy. Użycie mutantów utraconych funkcji lub mejotycznych mutantów zerowych może zatem zakłócić wczesny proces, blokując lub zakłócając późniejszy proces i utrudniając określenie fenotypów związanych z każdą pojedynczą rolą. Aby obejść to wyzwanie, protokół ten opisuje, w jaki sposób białka mogą być warunkowo wyczerpane z jądra na określonych etapach mejozy, jednocześnie monitorując zdarzenia mejotyczne za pomocą mikroskopii poklatkowej. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób komórki są synchronizowane w profazie I, w jaki sposób technika kotwiczenia jest wykorzystywana do zubożenia białek z jądra na określonych etapach mejotycznych oraz jak obrazowanie poklatkowe jest wykorzystywane do monitorowania segregacji chromosomów mejotycznych. Jako przykład użyteczności tej techniki, białko kinetochoru Ctf19 zostało zubożone z jądra w różnych punktach czasowych podczas mejozy, a liczbę mas chromatyny analizowano pod koniec mejozy II. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można dostosować do zubożenia różnych białek jądrowych z jądra przy jednoczesnym monitorowaniu podziałów mejotycznych.

Aby monitorować segregację chromatyny, białko histonowe Htb2 oznakowano mCherry. W profazie I chromatyna występuje w postaci pojedynczej masy Htb2. Po segregacji chromosomów homologicznych w pierwszym podziale mejozy chromatyna pojawia się jako dwie oddzielne masy (Rysunek 3A). Po segregacji chromatyd siostrzanych chromatyna występuje w postaci czterech mas. Jeśli niektóre chromosomy nie przyłączą się do mikrotubul wrzeciona, po mejozie I lub mejozie II mogą być widoczne dodatkowe masy.
...

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Poprzez synchronizację komórek w pierwszej fazie profazy, a następnie wyczerpanie białka docelowego na określonym etapie, metoda ta może zidentyfikować tymczasowo odrębne funkcje określonych białek. Warunkowe zubożenie białek w określonych stadiach miozy zapobiega resztkowym skutkom, jakie tradycyjny mutant miotyczny może mieć na późniejszych etapach. Metoda ta może być wykorzystana do badania pączkującej mitozy drożdży i innych organizmów, które nie ulegają rozpadowi otoczki jądrowej.Ponadto metoda ta może być stosowana w innych organizmach do badania zdarzeń cyklu komórkowego przed rozpadem otoczki jądrowej. Na początek przygotuj podkładkę agarową, która zostanie użyta do stworzenia monowarstwy komórek do obrazowania. Odetnij i wyrzuć nakrętkę i dolną jedną trzecią 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki, aby utworzyć cylinder, który posłuży jako forma do podkładki agarowej.Umieść wycięty cylinder probówki do mikrowirówki na czystym szklanym szkiełku podstawowym górną częścią probówki do góry nogami, siedząc na szkiełku. Przygotuj sześć mililitrów 5% roztworu agaru w 50-mililitrowej zlewce. Odetnij końcówkę pipety, aby zrobić większy otwór i odpipetuj około 500 mikrolitrów stopionego agaru do probówki mikrowirówkowej.Pozostaw w temperaturze pokojowej, aż agar zestale się. Aby przygotować komórki drożdży, odwiruj 200 mikrolitrów kultury zarodnikowej o stężeniu 800 G przez dwie minuty w jednomililitrowych probówkach wirówek. Wyrzucić 180 mikrolitrów supernatantu.Zawiesić osad w pozostałym supernatancie, obracając i przesuwając probówkę. Odpipetować sześć mikrolitrów skoncentrowanych komórek na szkiełko nakrywkowe w środku komory na miejscu z ConA. Chwyć cylinder z podkładką agarową i ostrożnie zsuń go ze szkiełka podstawowego.Upewnij się, że agar jest całkowicie płaski na dole i używając dolnej części końcówki pipety, lekko dociśnij formę do mikrowirówki, tak aby podkładka agarowa została wypchnięta nieco powyżej granicy probówki. Następnie odwróć formę tak, aby podkładka agarowa była skierowana w dół w kierunku komory. Za pomocą kleszczyków delikatnie umieść podkładkę agarową na wierzchu komórek, a końcówkę pipety, delikatnie przesuń podkładkę agarową po komorze od 10 do 20 razy, aby utworzyć monowarstwę komórek na szkiełku nakrywkowym.Trzymaj podkładkę agarową w komorze przez 12 do 15 minut. Następnie przenieś dwa mililitry kultury zarodnikowej do dwóch probówek do mikrowirówek i wiruj z prędkością 15,700 G przez dwie minuty. Po przeniesieniu supernatantu do czystych probówek do mikrowirówek, ponownie odwirować w tych samych warunkach i zebrać supernatant do oczyszczenia probówek do mikrowirówek.Dodać kroplami dwa mililitry supernatantu do komory zawierającej podkładkę agarową. Gdy ciecz dotrze do górnej części komory, podkładka agarowa najprawdopodobniej będzie unosić się na wodzie. Delikatnie usuń podkładkę agarową kleszczami i wyrzuć ją.Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów na górze komory, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Aby ustawić film pod mikroskopem, zamontuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie szkiełka. Przyklej glinę formierską do boku szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać ją bezpiecznie w uchwycie szkiełka.Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Użyj pokręteł regulacji zgrubnej i precyzyjnej, aby ustawić ostrość komórek za pomocą DIC lub jasnego pola. W menu głównym oprogramowania do pozyskiwania obrazów kliknij Plik, wybierz Pobierz, a pojawią się cztery okna.W oknie o nazwie Resolve 3D kliknij ikonę kolby Erlenmeyera. Spowoduje to otwarcie okna zatytułowanego Design Run Experiment, które zawiera elementy sterujące służące do konfigurowania eksperymentu w celu skonfigurowania filmu poklatkowego. Na karcie Projektowanie przejdź do karty z etykietą Sekcje.Zaznacz pole obok opcji Przekrój Z i ustaw odstęp między sekcjami optycznymi na jeden mikrometr, a liczbę sekcji optycznych na pięć. Następnie w zakładce Kanały kliknij ikonę plusa i wybierz odpowiedni kanał. Następnie zaznacz pole obok opcji Obraz referencyjny i ustaw pozycję Z na środek próbki z menu rozwijanego.Wybierz wartość transmitancji i czasu ekspozycji z menu rozwijanego. Na karcie Upływ czasu zaznacz pole obok opcji Upływ czasu i wprowadź wartości minut i godzin, aby określić przedział czasu akwizycji obrazu. Zaznacz pole wyboru Utrzymuj ostrość przy ostatecznym ustawieniu ostrości, aby zapobiec przesuwaniu się sceny podczas filmu.Na karcie Punkty zaznacz pole obok opcji Lista punktów wizyty. W menu głównym kliknij Widok i wybierz Lista punktów. Przenieś stolik do obszaru komory, w którym znajduje się monowarstwa komórek.Kliknij Zaznacz punkt w oknie Lista punktów. Przesuń scenę, aby zaznaczyć od 25 do 30 punktów bez nakładania się, aby uniknąć prześwietlenia komórek i obrazować każde pole podczas każdego kursu czasowego. W oknie Lista punktów wybierz opcję Kalibruj wszystko, aby ustawić najwyższą ostrość dla każdego punktu.Na karcie Uruchom zapisz plik w odpowiednim miejscu docelowym na komputerze. W oknie Uruchom eksperyment wybierz przycisk Odtwórz, aby uruchomić film. Otwórz oprogramowanie Fiji.Otwórz kanały DIC i mCherry. Uzyskaj pojedynczą projekcję maksymalnej intensywności kanału mCherry, klikając Obraz, a następnie Stosy i Projekt Z i wybierz Maksymalna intensywność z menu rozwijanego. Aby scalić kanały DIC i mCherry na jednym obrazie, kliknij Obraz, Kolor i wybierz Scal kanały.Podążaj za pojedynczą komórką przez mejozę. Po zakończeniu mejozy II zapisz liczbę mas DNA. W komórkach typu dzikiego z tłem zakotwiczonym na końcu mejozy II znajdują się zazwyczaj cztery masy DNA, reprezentujące cztery produkty mejozy.W niewielkiej części komórek po mejozie II widoczne są tylko trzy masy.Gdy Ctf19-FRB jest zakotwiczony w momencie uwolnienia profazy I, około 47% komórek wykazuje więcej niż cztery masy DNA po zakończeniu mejozy, co sugeruje defekt w przyczepianiu kinetochorów i mikrotubul. Po zakotwiczeniu Ctf19-FRB, albo po złożeniu kinetochoru, ale przed mejozą I, albo po mejozie II, około 16% komórek wykazuje dodatkowe masy DNA. Jedną z najważniejszych części tego protokołu jest dodawanie supernatantu kroplami do komory, aby uniknąć zakłócenia monowarstwy.Dodatkowo zwróć uwagę na czas potrzebny na przygotowanie się do obrazowania, aby uwzględnić je w swojej analizie. Zmieniając białka upakowane fluorescencyjnie, procedura ta może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania dotyczące czasu trwania cyklu komórkowego, segregacji chromosomów, obfitości białek i lokalizacji białek.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj mikroskopię poklatkową z zubożeniem białek w mejozie Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala identyfikować unikalne funkcje białek podczas segregacji chromosomów.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów