Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae
11 października 2022
Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.
Poprzez synchronizację komórek w pierwszej fazie profazy, a następnie wyczerpanie białka docelowego na określonym etapie, metoda ta może zidentyfikować tymczasowo odrębne funkcje określonych białek. Warunkowe zubożenie białek w określonych stadiach miozy zapobiega resztkowym skutkom, jakie tradycyjny mutant miotyczny może mieć na późniejszych etapach. Metoda ta może być wykorzystana do badania pączkującej mitozy drożdży i innych organizmów, które nie ulegają rozpadowi otoczki jądrowej.
Ponadto metoda ta może być stosowana w innych organizmach do badania zdarzeń cyklu komórkowego przed rozpadem otoczki jądrowej. Na początek przygotuj podkładkę agarową, która zostanie użyta do stworzenia monowarstwy komórek do obrazowania. Odetnij i wyrzuć nakrętkę i dolną jedną trzecią 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki, aby utworzyć cylinder, który posłuży jako forma do podkładki agarowej.
Umieść wycięty cylinder probówki do mikrowirówki na czystym szklanym szkiełku podstawowym górną częścią probówki do góry nogami, siedząc na szkiełku. Przygotuj sześć mililitrów 5% roztworu agaru w 50-mililitrowej zlewce. Odetnij końcówkę pipety, aby zrobić większy otwór i odpipetuj około 500 mikrolitrów stopionego agaru do probówki mikrowirówkowej.
Pozostaw w temperaturze pokojowej, aż agar zestale się. Aby przygotować komórki drożdży, odwiruj 200 mikrolitrów kultury zarodnikowej o stężeniu 800 G przez dwie minuty w jednomililitrowych probówkach wirówek. Wyrzucić 180 mikrolitrów supernatantu.
Zawiesić osad w pozostałym supernatancie, obracając i przesuwając probówkę. Odpipetować sześć mikrolitrów skoncentrowanych komórek na szkiełko nakrywkowe w środku komory na miejscu z ConA. Chwyć cylinder z podkładką agarową i ostrożnie zsuń go ze szkiełka podstawowego.
Upewnij się, że agar jest całkowicie płaski na dole i używając dolnej części końcówki pipety, lekko dociśnij formę do mikrowirówki, tak aby podkładka agarowa została wypchnięta nieco powyżej granicy probówki. Następnie odwróć formę tak, aby podkładka agarowa była skierowana w dół w kierunku komory. Za pomocą kleszczyków delikatnie umieść podkładkę agarową na wierzchu komórek, a końcówkę pipety, delikatnie przesuń podkładkę agarową po komorze od 10 do 20 razy, aby utworzyć monowarstwę komórek na szkiełku nakrywkowym.
Trzymaj podkładkę agarową w komorze przez 12 do 15 minut. Następnie przenieś dwa mililitry kultury zarodnikowej do dwóch probówek do mikrowirówek i wiruj z prędkością 15,700 G przez dwie minuty. Po przeniesieniu supernatantu do czystych probówek do mikrowirówek, ponownie odwirować w tych samych warunkach i zebrać supernatant do oczyszczenia probówek do mikrowirówek.
Dodać kroplami dwa mililitry supernatantu do komory zawierającej podkładkę agarową. Gdy ciecz dotrze do górnej części komory, podkładka agarowa najprawdopodobniej będzie unosić się na wodzie. Delikatnie usuń podkładkę agarową kleszczami i wyrzuć ją.
Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów na górze komory, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Aby ustawić film pod mikroskopem, zamontuj szkiełko nakrywkowe w uchwycie szkiełka. Przyklej glinę formierską do boku szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać ją bezpiecznie w uchwycie szkiełka.
Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Użyj pokręteł regulacji zgrubnej i precyzyjnej, aby ustawić ostrość komórek za pomocą DIC lub jasnego pola. W menu głównym oprogramowania do pozyskiwania obrazów kliknij Plik, wybierz Pobierz, a pojawią się cztery okna.
W oknie o nazwie Resolve 3D kliknij ikonę kolby Erlenmeyera. Spowoduje to otwarcie okna zatytułowanego Design Run Experiment, które zawiera elementy sterujące służące do konfigurowania eksperymentu w celu skonfigurowania filmu poklatkowego. Na karcie Projektowanie przejdź do karty z etykietą Sekcje.
Zaznacz pole obok opcji Przekrój Z i ustaw odstęp między sekcjami optycznymi na jeden mikrometr, a liczbę sekcji optycznych na pięć. Następnie w zakładce Kanały kliknij ikonę plusa i wybierz odpowiedni kanał. Następnie zaznacz pole obok opcji Obraz referencyjny i ustaw pozycję Z na środek próbki z menu rozwijanego.
Wybierz wartość transmitancji i czasu ekspozycji z menu rozwijanego. Na karcie Upływ czasu zaznacz pole obok opcji Upływ czasu i wprowadź wartości minut i godzin, aby określić przedział czasu akwizycji obrazu. Zaznacz pole wyboru Utrzymuj ostrość przy ostatecznym ustawieniu ostrości, aby zapobiec przesuwaniu się sceny podczas filmu.
Na karcie Punkty zaznacz pole obok opcji Lista punktów wizyty. W menu głównym kliknij Widok i wybierz Lista punktów. Przenieś stolik do obszaru komory, w którym znajduje się monowarstwa komórek.
Kliknij Zaznacz punkt w oknie Lista punktów. Przesuń scenę, aby zaznaczyć od 25 do 30 punktów bez nakładania się, aby uniknąć prześwietlenia komórek i obrazować każde pole podczas każdego kursu czasowego. W oknie Lista punktów wybierz opcję Kalibruj wszystko, aby ustawić najwyższą ostrość dla każdego punktu.
Na karcie Uruchom zapisz plik w odpowiednim miejscu docelowym na komputerze. W oknie Uruchom eksperyment wybierz przycisk Odtwórz, aby uruchomić film. Otwórz oprogramowanie Fiji.
Otwórz kanały DIC i mCherry. Uzyskaj pojedynczą projekcję maksymalnej intensywności kanału mCherry, klikając Obraz, a następnie Stosy i Projekt Z i wybierz Maksymalna intensywność z menu rozwijanego. Aby scalić kanały DIC i mCherry na jednym obrazie, kliknij Obraz, Kolor i wybierz Scal kanały.
Podążaj za pojedynczą komórką przez mejozę. Po zakończeniu mejozy II zapisz liczbę mas DNA. W komórkach typu dzikiego z tłem zakotwiczonym na końcu mejozy II znajdują się zazwyczaj cztery masy DNA, reprezentujące cztery produkty mejozy.
W niewielkiej części komórek po mejozie II widoczne są tylko trzy masy.Gdy Ctf19-FRB jest zakotwiczony w momencie uwolnienia profazy I, około 47% komórek wykazuje więcej niż cztery masy DNA po zakończeniu mejozy, co sugeruje defekt w przyczepianiu kinetochorów i mikrotubul. Po zakotwiczeniu Ctf19-FRB, albo po złożeniu kinetochoru, ale przed mejozą I, albo po mejozie II, około 16% komórek wykazuje dodatkowe masy DNA. Jedną z najważniejszych części tego protokołu jest dodawanie supernatantu kroplami do komory, aby uniknąć zakłócenia monowarstwy.
Dodatkowo zwróć uwagę na czas potrzebny na przygotowanie się do obrazowania, aby uwzględnić je w swojej analizie. Zmieniając białka upakowane fluorescencyjnie, procedura ta może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania dotyczące czasu trwania cyklu komórkowego, segregacji chromosomów, obfitości białek i lokalizacji białek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową do badania mejozy u drożdży pączkujących, ze szczególnym uwzględnieniem warunkowego usuwania specyficznych białek podczas segregacji chromosomów meiotycznych. Poprzez synchronizację komórek drożdży w profazie I oraz manipulację poziomami białek na kluczowych etapach, metoda ta pozwala na ujawnienie odrębnych funkcji białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Mejoza
- Regulacja cyklu komórkowego
- Funkcja białek w segregacji chromosomów
Wprowadzenie
- Mikroskopia poklatkowa umożliwia obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Drożdże pączkujące stanowią efektywny model do badania mechanizmów mejozy.
- Poprzednie metody mogą pozostawiać efekty resztkowe wpływające na kolejne etapy.
Zastosowane metody
- Mikroskopia poklatkowa połączona z synchronizacją cyklu komórkowego.
- Drożdże pączkujące jako główny model biologiczny.
- Warunkowe usuwanie białek docelowych w konkretnych etapach mejozy.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano unikalne role białek poprzez analizę czasu ich deplecji.
- Wykazano kluczowe funkcje niezbędne do prawidłowej segregacji chromosomów.
- Wskazano na defekty w przyłączaniu kinetochorów powiązane z deplecją białek.
Wnioski
- Protokół ten skutecznie wyjaśnia funkcje białek podczas mejozy.
- Oferuje spostrzeżenia istotne dla zrozumienia zdarzeń cyklu komórkowego oraz mutacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Specyficzna dla etapu deplecja jądrowa w połączeniu z mikroskopią time-lapse umożliwia precyzyjną analizę funkcji białek podczas segregacji chromosomów meiotycznych w S. cerevisiae. Podejście to rozwiązuje problem niejednoznaczności mechanistycznej spowodowanej plejotropowymi rolami białek, co pozwala na uzyskanie wyższej pewności prognostycznej w walidacji celów. Metoda ta usprawnia podejmowanie decyzji na wczesnym etapie odkryć poprzez wyjaśnienie zależności czasowych oraz funkcjonalnych skutków perturbacji białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji białek występujących w różnych etapach czasowych mejozy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację efektów wywołanych deplecją białek w konkretnych stadiach.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celu poprzez wyjaśnienie ról mechanistycznych.
- Ułatwia selekcję projektów w portfelu badawczym dzięki rozróżnieniu fenotypów pierwotnych od wtórnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele drożdżowe do dalszego przesiewu regulatorów mejozy.
- Standaryzuje ilościowe odczyty, takie jak liczenie masy chromatyny po mejozie II.
- Umożliwia powtarzalną ocenę fenotypów mutantów w wielu różnych warunkach.
- Wspiera skalowalne procesy obrazowania w przesiewach związków chemicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla przebiegu chorób, w których kluczowa jest wierność segregacji chromosomów.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Zmniejsza ryzyko w procesie translacyjnym poprzez wyjaśnienie funkcji białek w konserwowanych szlakach.
- Wspiera identyfikację biomarkerów dzięki ilościowym wynikom obrazowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się na styku wczesnego etapu poszukiwań i identyfikacji związku wiodącego, umożliwiającB redukcję ryzyka mechanistycznego przed opracowaniem modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez czasową kontrolę deplecji białek i obserwację bezpośrednich skutków fenotypowych.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych danych obrazowych do analizy porównawczej mutantów lub interwencji.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wyniki, takie jak obliczenia masy DNA i defekty segregacji, do oceny statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy wglądy w mechanizmy z systemami istotnymi dla chorób, w których zaangażowane są błędy segregacji chromosomów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do analizy funkcji białek w odniesieniu do wielu celów i etapów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanicystyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania i deplecji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wyjaśnienie obciążeń związanych z celem na konkretnych etapach.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu genetyki drożdży, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanych platform obrazowania time-lapse oraz oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja czasu drenażu oraz parametrów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu w odniesieniu do dynamiki otoczki jądrowej.
- Kluczowe dla zachowania integralności monowarstwy i jakości danych są staranne obchodzenie się z próbkami oraz precyzyjne przestrzeganie ram czasowych.
