Name: Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia dosercowego komórek PC3 w celu stworzenia mysiego modelu przerzutów raka prostaty do kości. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych metastazy i testowanie terapii in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 i 2020YFE0201600), National Nature Science Foundation (81973877 i 82174408), projektów badawczych w ramach budżetu Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (2021LK047) oraz Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation.

Sześcio- do ośmiotygodniowych samców myszy atymicznych BALB/c (n = 10) trzymano w indywidualnie wentylowanych klatkach dla myszy (5 myszy/klatkę) w pomieszczeniu dla zwierząt wolnym od specyficznych patogenów (SPF) w warunkach 12-godzinnego cyklu światła/ciemności, z wolnym dostępem do paszy SPF i sterylnej wody. Myszy były karmione adaptacyjnie przez tydzień przed eksperymentami. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>W dniu wstrzyknięcia komórek raka prostaty dwukrotnie przemyć 80%-90% zlewających się komórek PC-3 znakowanych lucyferazyą (PC-3-lucyferaza) hodowanych w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej z wstępnie zimnym sterylnym PBS (pH 7,4). Trypsynizuj przez 3 minuty 1,5 ml 0,25% trypsyny i zbierz komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml po wygaszeniu trypsyny 6 ml pożywki F-12 zawierającej 10% surowicy. 
	UWAGA: Linia komórkowa PC-3-lucyferazy pochodzi z linii komórkowej PC-3 po transfekcji wektorem pLV-lucyferazy15.</li>
	<li>Użyć automatycznego licznika komórek i obliczyć stężenie komórek, przenosząc 20 μl zawiesiny komórek na płytkę do zliczania komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Odwirować komórki przy 800 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w pożywce F-12 (patrz Tabela materiałów) do końcowej gęstości komórek 1 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas, aż do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przynieś komórki na salę operacyjną i zakończ wstrzykiwanie komórek w ciągu 2 godzin 
	UWAGA: Należy przygotować dodatkowe zawiesiny komórek (zwykle podwajane objętości w zależności od potrzeb), aby zapewnić dokładne dawki iniekcyjne (na przykład, aby uniknąć martwych przestrzeni wewnątrz strzykawek).</li>
</ol>
2. Chirurgia iniekcji dosercowej ludzkich komórek raka prostaty
UWAGA: Aparatem chirurgicznym używanym do iniekcji dosercowych jest strzykawka o pojemności 1 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż do momentu wyzdrowienia zwierzęcia ze znieczulenia.
<ol>
	<li>Trzymaj mysz w pomieszczeniu dla zwierząt z filtrem SPF. Wszystkie procedury należy wykonywać za pomocą wysterylizowanych aparatów w aseptycznej szafie.</li>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą 2% izofluranu z 98% tlenem przy natężeniu przepływu tlenu 2 l/min. 
	UWAGA: Rozsmaruj niewielką ilość maści okulistycznej na oczach myszy, aby uniknąć wysuszenia podczas znieczulenia. Całą operację należy wykonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona, szczypiąc palce u nóg myszy przed wstrzyknięciem komórek. Jeśli reakcje (np. szarpnięcie lub drgawki) utrzymują się, poczekaj na dodatkowy czas, aż znieczulenie zacznie działać.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i unieruchamij obie kończyny górne prostopadle rozciągnięte od linii środkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Unieruchom mysz od brzucha w dół za pomocą chirurgicznej taśmy klejącej. Unikaj mocnego naciskania i przemieszczania narządów wewnętrznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Utrzymanie anatomii topograficznej (tj. mocowanie za pomocą taśmy klejącej) jest niezbędne, ponieważ wstrzyknięcie dosercowe jest ślepe (tj. dokładne miejsce wstrzyknięcia na sercu jest niewidoczne gołym okiem).</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę klatki piersiowej wacikiem z 70% etanolu.</li>
	<li>Zidentyfikuj mysi wyrostek mieczykowaty w zagłębieniu na najniższym końcu środkowego mostka, dotykając palpacyjnie środka przedniej ściany klatki piersiowej. Zidentyfikuj wcięcie szyjne myszy w centralnym zagłębieniu na górnej granicy manubrium, dotykając palcami od środka przedniej ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Oznacz najniższy punkt wyrostka mieczykowatego i wcięcie szyjki za pomocą markera (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Zrób trzeci znak pośrodku tych dwóch punktów orientacyjnych i nieco po prawej (po lewej stronie zwierzęcia) tuż nad sercem w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. 
	UWAGA: Miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1-2 mm na lewo od linii środkowej, a punkt wstrzyknięcia znajduje się między trzecim a czwartym żebrem myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Załadować 200 μl zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Utrzymuj pęcherzyk powietrza w strzykawce, jak pokazano w Rysunek 2C, aby upewnić się, że krew pulsuje. Zawiesina komórek musi być dokładnie wymieszana przed załadowaniem.</li>
	<li>Wprowadzić pionowo igłę 26 G przez miejsce wstrzyknięcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Trzymaj strzykawkę stabilnie na stole lub drugą ręką trzymaj ją stabilnie. Upewnić się, że długa oś strzykawki jest prostopadła do miejsca wstrzyknięcia i wprowadzić strzykawkę na około 2 mm podskórnie.</li>
	<li>Jaskrawoczerwona pulsacja krwi jest widoczna w piaście igły i/lub zawiesinie komórek, gdy końcówka igły jest prawidłowo wprowadzona do lewej komory. Jeśli pulsacja krwi jest niewidoczna, końcówka igły nie znajduje się w sercu. Wycofać igłę i wymienić ją (w przypadku, gdy krzepnięcie krwi wewnątrz igły zatrzymuje pulsowanie krwi). Ponownie wprowadzić igłę.</li>
	<li>Wstrzyknąć komórki. Zawiesinę komórkową (100 μl) należy wstrzykiwać bardzo powoli przez 40-60 s i cały czas trzymać rękę trzymającą strzykawkę stabilnie. 
	UWAGA: Należy uważnie obserwować zawiesinę komórek w strzykawce i nie wstrzykiwać pęcherzyków powietrza znajdujących się wewnątrz strzykawki do serca.</li>
	<li>Uciskać miejsce wstrzyknięcia suchym bawełnianym wacikiem przez 15 sekund, aby zapewnić hemostazę po wsunięciu igły.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i monitoruj zwierzę, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
	<li>Wyobraź sobie mysz za pomocą systemu bioluminescencji in vivo w ciągu 24 godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że komórki rakowe dostały się do krążenia ogólnoustrojowego. 
	UWAGA: Prawidłowo wstrzyknięte komórki rakowe dostają się do krążenia tętniczego przez lewą komorę serca, co jest widoczne przez sygnalizację bioluminescencyjną widoczną w całym ciele (na przykład patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo.
	<ol>
		<li>Włącz instrument i komputer. Otwórz oprogramowanie, gdy wskaźnik zasilania na instrumencie i komputerze rozjaśni się, a następnie otwórz okno Akwizycja obrazu.</li>
		<li>Zidentyfikuj system obrazowania in vivo podłączony do komputera w okienku urządzenia. Umieść mysz, która ma być zobrazowana, w komorze obrazowania w pozycji leżącej. Następnie zamknij drzwi komory obrazowania.</li>
		<li>Ustaw parametry w okienku Ustawienia dostępnym w oknie Akwizycja obrazu.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry za pomocą opcji Obiektyw > Zoom > 1x, Obiektyw > Ostrość > 108 i Obiektyw > Przysłona > F 2.8, aby obrazy były wyraźne.</li>
			<li>Ustaw kanał fotografowania w Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF oraz Filter&Light > Light Intensity > Middle.</li>
			<li>Ustaw typ zdjęcia, które ma zostać zrobione: Typ > obrazowania > pojedynczej klatki, Obrazowanie > czas ekspozycji > 500 ms, Obrazowanie > trybie HDR > trybie niskiego wzmocnienia. Kliknij przycisk Pobierz, aby uzyskać obraz.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja wzrostu raka z przerzutami za pomocą bioluminescencji in vivo. 
	UWAGA: W każdym punkcie czasowym wizualizacji wstrzyknij dootrzewnowo 200 μl substratu lucyferyny myszy o wadze 20 g (150 mg / kg) i odczekaj 15 minut przed znieczuleniem (2% izofluranu zmieszanego z 98% tlenu w komorze indukcyjnej). Umieść mysz na platformie systemu obrazowania bioluminescencyjnego. Utrzymuj znieczulenie przez maskę nosową z 2% izofluranem.</li>
</ol>
3. Badanie patologiczne
<ol>
	<li>Cztery tygodnie po wstrzyknięciu komórki należy poświęcić mysz przez wdychanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Unieruchom mysz w pozycji leżącej. Wykonaj pionowe nacięcie (około 6 cm) od brzucha do klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić i dokładnie zbadać wszystkie narządy w jamie brzusznej i klatce piersiowej pod kątem zmian nowotworowych i/lub zmian patologicznych. 
	UWAGA: W przypadku badania wstrzyknięcia komórek rakowych wewnątrz serca, zmiany rakowe w śródpiersiu przylegającym do serca sugerują błędnie wstrzyknięte komórki rakowe (komórki, które nie zostały wstrzyknięte do lewej komory serca); W związku z tym myszy te nie są uwzględniane w końcowym gromadzeniu danych.</li>
	<li>Wytnij guzy przerzutowe nożyczkami. Zmierz długie średnice (a) i krótkie średnice (b) guza za pomocą suwmiarki, aby obliczyć objętość guza (V) za pomocą wzoru V = 1/2 × a × b2 i zważ guz za pomocą wagi elektronicznej.</li>
	<li>Utrwal tkanki nowotworowe w 10% roztworze formaliny, a następnie zanurz w parafinie. Alternatywnie, zamroź guzy w ciekłym azocie.</li>
	<li>Wyciąć kości (kończyny tylne, kręgi i/lub żebra) ze zmianami przerzutowymi. Umieść próbkę każdej myszy w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 10% roztworu formaliny przez 24 godziny po usunięciu skóry i mięśni, a następnie odwapnieniu przez 14 dni w 10% roztworze EDTA z częstą wymianą buforu (co 3 dni).</li>
	<li>Zanurz próbkę w parafinie i podziel próbki na sekcje do rutynowego badania histologicznego16.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cancerstatistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Cancerstatistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+complications+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal complications of malignancy.</a> Cancer. 80, 1588-1594 (1997).</li>
<li>Macedo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+metastases%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bone metastases: An overview.</a> Oncology Reviews. 11 (1), 321(2017).</li>
<li>Rea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+prostate+cancer+translational+research%3A+From+xenograft+to+PDX%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX.</a> BioMed Research International. 2016, 9750795(2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+GFP+intravital+imaging+of+the+differences+in+cellular+and+angiogenic+behavior+of+subcutaneous+and+orthotopic+nude-mouse+models+of+human+PC-3+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).</li>
<li>Stephenson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+model+for+human+prostate+cancer+using+orthotopic+implantation+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice.</a> Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal models of bone metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).</li>
<li>Corey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+osseous+prostate+cancer+models%3A+intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells.</a> The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).</li>
<li>Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cell+line+CWR22+elicits+osteoblastic+response+in+immunodeficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interactions%22%5BJournal%5D)">Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).</li>
<li>Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+inactivation+leads+to+multimodal+inhibition+of+prostate+cancer+cell+dissemination+in+a+preclinical+bone+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model.</a> International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).</li>
<li>Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+established+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Emerging and established models of bone metastasis.</a> Cancers. 10 (6), 176(2018).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+prostate+cancer+cell+line+%28Probasco%29+produces+osteoblastic+metastases+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo.</a> The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Brylka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+Metastases+in+immunocompromised+mice+after+intracardiac+injection+of+MDA-MB-231-SCP2+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells.</a> Cancers. 14 (3), 556(2022).</li>
<li>Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+is+a+more+potent+inhibitor+of+breast+cancer+metastasis+to+bone+and+related+osteolysis+than+EPA%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).</li>
<li>Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+mouse+models+of+human+prostate+cancer+and+their+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).</li>
<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cachexia%3A+mediators%2C+signaling%2C+and+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways.</a> Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-%CE%B2+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).</li>
<li>Talbot, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+body-weight+reduction+as+a+humane+endpoint%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal.</a> Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Yin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+blockade+inhibits+PTHrP+secretion+by+breast+cancer+cells+and+bone+metastases+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).</li>
<li>Schneider, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((turnover+mediates+preferential+localization+of+prostate+cancer+in+the+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton.</a> Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).</li>
<li>Padalecki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+18+suppresses+prostate+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Urologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases.</a> Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu wytworzenia przerzutów do kości jest idealnym modelem mysim do badania funkcji i mechanizmów przerzutów raka prostaty do kości oraz oceny skuteczności terapeutycznej. Badania wykazały, że uszkodzenie kości najprawdopodobniej występuje w bliższej części kości piszczelowej i dalszej części kości udowej17, co może być spowodowane ich wysokim unaczynieniem i aktywnością metaboliczną.
Ponieważ przerzuty do kości s...

Rak prostaty jest najczęstszym nowotworem u mężczyzn w 112 krajach i zajmuje drugie miejsce pod względem śmiertelności w krajach o wyższym wskaźniku rozwoju społecznego1,2. Większość zgonów u pacjentów z rakiem prostaty jest spowodowana przerzutami, a u około 65%-75% przypadków wystąpią przerzuty do kości3,4. Dlatego pilnie potrzebna jest profilaktyka i leczenie przerzutów do kości raka gruczołu krokowego, aby poprawić wyniki kliniczne pacjentów z rakiem prostaty. Zwierzęcy model przerzutów do kości jest niezbędnym narzędziem do badania wieloetapowego procesu i mechanizmów molekularnych zaangażowanych w każdy etap przerzutów raka prostaty do kości, identyfikując w ten sposób cele terapeutyczne i opracowując nowe terapie5.
Najczęstsze metody generowania eksperymentalnych modeli zwierzęcych raka prostaty z przerzutami do kości obejmują ortotopię, inkon dotrzon (np. dopiszczelowy) i dosercowe wstrzykiwanie komórek raka prostaty. Model przerzutów do kości z iniekcją ortotopową jest generowany przez bezpośrednie wstrzyknięcie komórek raka prostaty do prostaty myszy6,7. Ten eksperymentalny model zwierzęcy ma bardzo podobne cechy kliniczne do przerzutów do kości raka prostaty. Jednak przerzuty występują głównie w pachowym węźle chłonnym i płucach, a nie w kostnej8,9. Model iniekcji dopiszczelowej w przypadku raka gruczołu krokowego bezpośrednio wstrzykuje komórki raka prostaty do kości piszczelowej z dużą szybkością tworzenia się guza w kości piszczelowej (piszczelowej)10,11; Jednak kora kostna i jama szpiku kostnego łatwo ulegają uszkodzeniu. Dodatkowo metoda iniekcji piszczelowej nie może stymulować patologicznego procesu przerzutów raka prostaty do kości, w którym komórki rakowe kolonizują kość poprzez krążenie. Aby zbadać krążenie, wynaczynienie naczyniowe i przerzuty odległe z wyższym wskaźnikiem przerzutów do kości komórek rakowych, opracowano technikę wstrzykiwania dosercowego poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie komórek raka prostaty do lewej komory myszy 8,12,13. To sprawia, że jest to cenny model zwierzęcy do badań nad przerzutami do kości8. Metoda iniekcji dosercowej wykazuje wskaźnik przerzutów do kości wynoszący około 75%9,14, znacznie wyższy niż metoda iniekcji ortotopowej. Dlatego wstrzyknięcie dosercowe jest idealną metodą generowania modelu zwierzęcego z przerzutami raka prostaty do kości.
Ta praca ma na celu opisanie procesu tworzenia mysiego modelu przerzutów raka prostaty do kości, umożliwiając czytelnikom wizualizację założenia modelu. Obecna praca dostarcza szczegółowych procesów, środków ostrożności i obrazów ilustracyjnych w celu wygenerowania modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości poprzez wstrzyknięcie do serca ludzkich komórek raka prostaty u myszy atymicznych. Metoda ta stanowi skuteczne narzędzie do dalszego badania mechanizmów molekularnych i efektów terapeutycznych in vivo przerzutów raka prostaty do kości.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki i igły 1 ml</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>Komórki wstrzyknięto do komór myszy Maszyna</td></tr> do <tr><td>znieczulenia</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>Sprzęt do znieczulania myszy</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>&nbsp; Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Myszy atymiczne BALB/c</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>Samiec</td><td>w wieku 6-8 tygodni, samce myszy</td></tr><tr><td>System obrazowania bioluminescencyjnego</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>Do śledzenia wzrostu guza i przerzutów do płuc, jeśli wstrzyknięte komórki są znakowane lucyferazyą</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (15 ml, 50 ml)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Roztwór Corning</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1105</td><td>&nbsp; Do odwapniania pożywki</td></tr><tr><td>kostnej F-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>21700075, GIBCO</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL539A</td><td>Do mocowania próbki każdej myszy</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Do znieczulenia&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>Odczynnik do transfekcji plazmidu</td></tr><tr><td>Linia komórkowa PC-3</td><td>Bank komórek Chińskiej Akademii Nauk</td><td>TCHu 158</td><td>Linia komórkowa raka prostaty</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>Umyj ludzkie komórki kostniakomięsaka</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co. , Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>Do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Wektor (pLV-lucyferaza)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plazmid do transfekcji</td></tr><tr><td>System obrazowania rentgenowskiego</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Do uzyskiwania obrazów rentgenowskich w celu wykrycia wzrostu guza</td></tr><tr><td>&mu; CT80</td><td>Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd</td><td>Scanco Medical AG, Szwajcaria</td><td>Do wykrywania zniszczenia kości. Mico-CT jest wyposażony w 3DCalc, rekonstrukcję stożka,&nbsp; oraz &mu; Oprogramowanie do wizualizacji modelu CT Ray V3.4A.</td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

Jako najczęstszy nowotwór złośliwy u mężczyzn, rak prostaty (PC) zajmuje drugie miejsce pod względem śmiertelności, głównie ze względu na 65%-75% wskaźnik przerzutów do kości. Dlatego niezbędne jest zrozumienie procesu i powiązanych mechanizmów przerzutów raka prostaty do kości w celu opracowania nowych metod leczenia. W tym celu niezbędnym narzędziem jest zwierzęcy model przerzutów do kości. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe procedury generowania mysiego modelu przerzutów do kości poprzez wstrzyknięcie do serca komórek raka prostaty. System obrazowania bioluminescencyjnego może określić, czy komórki raka prostaty zostały dokładnie wstrzyknięte do serca i monitorować przerzuty komórek rakowych, ponieważ ma ogromne zalety w monitorowaniu rozwoju zmian przerzutowych. Model ten odwzorowuje naturalny rozwój rozsianych komórek nowotworowych w celu tworzenia mikroprzerzutów do kości i imituje patologiczny proces przerzutów raka prostaty do kości. Stanowi skuteczne narzędzie do dalszego badania mechanizmów molekularnych i efektów terapeutycznych in vivo tej choroby.

Obrazowanie bioluminescencyjne oferuje ogromne zalety w monitorowaniu rozwoju zmian przerzutowych w modelu z wewnątrzsercowym wstrzykiwaniem komórek. Wkrótce po wstrzyknięciu komórek nowotworowych (w ciągu 24 h) zastosowano obrazowanie bioluminescencyjne w celu wizualizacji komórek nowotworowych wnikających do krążenia ogólnego (Rysunek 3A). Wyraźny sygnał bioluminescencyjny w całym organizmie będzie widoczny w przypadku prawidłowego wstrzyknięcia komórek nowotworowych do krążenia tętniczego...

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

Metoda ta może pomóc w stworzeniu idealnego modelu, który ściśle naśladuje naturalny postęp przerzutów komórek raka prostaty do kości in vivo. Technika ta ma tę zaletę, że daje przerzuty do kości i reprezentuje naturalny proces przerzutów komórek raka prostaty do kości in vivo. Technika ta przynosi korzyści w badaniu mechanizmów molekularnych i badaniu efektów terapeutycznych in vivo w przypadku przerzutów do kości raka prostaty.W dniu wstrzyknięcia należy pobrać od 80 do 90% zlewających się komórek PC3 znakowanych lucyferazą wyhodowanych w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej i rozpocząć przygotowanie komórek do wstrzyknięcia, przemując je dwukrotnie zimnym sterylnym PBS. Trypsynizuj umyte komórki 1,5 mililitra 0,25% trypsyny przez trzy minuty, po czym ugasz trypsynę, dodając sześć mililitrów pożywki F12 zawierającej 10% surowicy i zbierz komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Przenieść 20 mikrolitrów zebranej zawiesiny komórek na płytkę do liczenia komórek i obliczyć stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.Następnie odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy stężeniu 800 G. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórek w pożywce F12, aby osiągnąć pożądaną końcową gęstość komórek. Teraz przenieś komórki na salę operacyjną i wykonaj wstrzyknięcie komórek w ciągu dwóch godzin. Utrzymuj komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia.Aby rozpocząć operację, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i unieruchomij obie kończyny górne, prostopadle rozciągając je od linii środkowej. Za pomocą chirurgicznej taśmy klejącej unieruchamiaj mysz od brzucha w dół bez mocnego naciskania i przemieszczania narządów wewnętrznych. Zdezynfekuj skórę klatki piersiowej za pomocą wacika z 70% etanolu.Następnie obmacuj palpacyjnie środek przedniej ściany klatki piersiowej, aby zlokalizować mysi wyrostek mieczykowaty w zagłębieniu na najniższym końcu środkowego mostka. Oznacz najniższy punkt wyrostka mieczykowatego. Następnie, badając palpacyjnie od środka przedniej ściany klatki piersiowej, zlokalizuj wcięcie szyjne myszy w centralnym zagłębieniu na górnej granicy manubrium i zaznacz najniższy punkt wcięcia szyjnego.Teraz zlokalizuj i zaznacz punkt środkowy między poprzednimi dwoma znakami, lekko w prawo i tuż nad sercem w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. To jest punkt wtrysku. Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek przed załadowaniem 200 mikrolitrów zawiesiny do jednomililitrowej strzykawki zamontowanej za pomocą igły o rozmiarze 26.Pozostawić trochę powietrza w strzykawce między tłokiem a zawiesiną, aby umożliwić dopływ pulsującej krwi podczas wstrzyknięcia. Aby wykonać wstrzyknięcie, należy wprowadzić igłę pionowo przez miejsce wstrzyknięcia. Jeśli końcówka igły zostanie prawidłowo wprowadzona do lewej komory, w piaście igły będzie widoczna jaskrawoczerwona pulsująca krew.Ponów próbę wstrzyknięcia, jeśli pulsacja krwi nie jest widoczna lub krew krzepnie. Po prawidłowym wprowadzeniu igły należy wstrzyknąć 100 mikrolitrów zawiesiny komórek bardzo powoli przez 40 do 60 sekund stabilną ręką. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy wycofać igłę, uciskając miejsce wstrzyknięcia suchym bawełnianym wacikiem przez 15 sekund, aby zapewnić hemostazę.Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i monitoruj zwierzę, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia. Obrazowanie bioluminescencyjne wykonane 24 godziny po wstrzyknięciu myszu komórek PC3 znakowanych lucyferazą wykazało sygnały z całego ciała zwierzęcia wskazujące na obecność komórek rakowych w krążeniu ogólnoustrojowym. Zmiany przerzutowe pojawiły się w tylnych kończynach myszy dwa tygodnie po wstrzyknięciu.Zmiany przerzutowe powiększały się w miarę upływu czasu i zaczęły pojawiać się w innych miejscach. Wywołane komórkami raka prostaty zmiany przerzutowe w kościach zostały następnie wykryte za pomocą obrazowania rentgenowskiego, które wykazało zniszczenie kości w bliższej części kości piszczelowej zwierzęcia. To samo potwierdziła również mikrotomografia komputerowa.Zmiany przerzutowe zostały dodatkowo potwierdzone w tkankach zatopionych w parafinie poprzez barwienie hematyną i eozyną. Dokładne miejsce wstrzyknięcia jest bardzo ważne, aby zapewnić wskaźnik sukcesu tego modelu. Można to osiągnąć poprzez praktykę.

intra-cardiac-injection-human-prostate-cancer-cells-to-create-bone

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

W tym filmie pokazujemy procedurę podawania komórek raka prostaty do modelu mysiego do wstrzykiwania dogruczołowo prostaty. Ortotopowe modele myszy mogą być wykorzystywane do badania pochodzenia choroby i odpowiedzi na terapie lecznicze w nieinwazyjnym i klinicznie istotnym środowisku.

Wstrzyknięcie komórek rakowych do gruczołu krokowego: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Poznaj metodę wstrzyknięcia dosercowego komórek PC3 w celu stworzenia mysiego modelu przerzutów raka prostaty do kości. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych metastazy i testowanie terapii in vivo.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Przeglądaj więcej filmów