Mikrosonda radiometryczna wewnątrztkankowa do pomiaru promieniowania in situ w żywej tkance

Protokół ten jest istotny, ponieważ upraszcza i umożliwia pomiary promieniowania w grubych materiałach, co pozwala nam zebrać ważne informacje podczas badania żywych systemów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przestrzennie rozdzielcze pomiary spektralne w materiałach o wysokiej absorpcji przy użyciu sprzętu, który można skonstruować, oraz eksperymentów, które można przeprowadzić w laboratoriach terenowych. Tę metodę można dostosować i zastosować do dowolnego żywego systemu.

Technika wykonywania sond jest zniuansowana, ale praktyka czyni mistrza. Dostosuj technikę pomiaru w zależności od sondowanego materiału i wprowadź zmiany, które spowodują pewniejsze położenie tkanki i mniejsze tarcie sondy. Aby rozpocząć, zbuduj szklaną tuleję za pomocą 5,75-calowej pipety Pasteura.

Za pomocą montowanego zacisku krokodylkowego zamontuj szklaną pipetę za szeroki koniec tak, aby zwężający się koniec był skierowany w dół w kierunku podłogi, a orientacja pipety była prostopadła do podłogi. Umieść podkładkę z taśmą izolacyjną na 50-gramowym plastikowym uchwycie imadła, aby zapobiec ślizganiu się, i zawieś uchwyt imadła na stożkowym końcu pipety. Za pomocą małego palnika butanowego podgrzej zwężający się koniec pipety zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Gdy długość pipety zwiększy się o około pięć cali, natychmiast usuń płomień. Następnie użyj małych nożyczek lub noża do szkła, aby przyciąć pociągnięty koniec pipety. Spiłuj wszelkie ostre obszary przyciętego końca za pomocą papieru karborundowego i spłucz wszelkie drobne odłamki szkła lub kurz za pomocą alkoholu izopropylowego, a następnie sprężonego powietrza.

Użyj żyletki, aby przeciąć światłowód i usunąć jedno złącze SMA ze światłowodu zakończonego SMA. Upewnij się, że cięcie znajduje się blisko jednego z zakończeń SMA. Następnie usuń następujące pięć centymetrów osłony z tworzywa sztucznego i włókna szklanego, tak aby gołe włókno światłowodowe było odsłonięte i wystawało z reszty całego zespołu.

Użyj palnika butanowego, aby wypalić powłokę polimerowo-poliamidową z włókna szklanego. Spłucz izopropanolem i wytrzyj gołe włókno szklane niestrzępiącą się chusteczką. Teraz zamontuj goły koniec światłowodu bezpośrednio w szczypcach zacisk na stole lub krawędzi półki, pozwalając, aby końcówka światłowodu zakończona SMA zwisała w kierunku podłogi.

Około czterech do sześciu cali od miejsca, w którym gołe światłowód jest trzymany w zacisku szczypiec, dodaj ciężarki do ciągnięcia za pomocą dwóch małych zacisków na osłoniętym końcu włókna. Aby wyciągnąć włókno, zacznij od włączonego płomienia palnika butanowego. Trzymaj pochodnię butanową w odległości jednego centymetra od gołego włókna, jak opisano w manuskrypcie.

I pozwól włóknu rozciągnąć się, ciągnąć, oddzielać i opaść na podłogę. Sprawdź włókno pod mikroskopem i w razie potrzeby przytnij koniec włókna małymi nożyczkami do preparowania. Użyj piankowego, nieprzezroczystego pisaka, aby przyciemnić boki włókna i zapobiec przedostawaniu się rozproszonego światła.

Delikatnie przeciągnij końcówkę pisaka w poprzek włókna, pozostawiając odsłonięty tylko niewielki obszar na końcówce. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie włóż stożkowy światłowód do szerokiego końca zmienionej szklanej pipety i dociśnij światłowód, aż około jednego milimetra gołego włókna będzie wystawać ze stożkowego końca pipety. Za pomocą taśmy izolacyjnej przymocuj osłonięty koniec światłowodu do szerokiego końca pipety.

Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na małej igle. Ostrożnie przyłóż kroplę kleju do przyciętej krawędzi wyciągniętej pipety, unikając gołego końca wyciągniętego włókna. Aby zmodyfikować końcówkę włókna za pomocą kuli rozpraszającej, utwórz surowiec, mieszając kroplę kleju utwardzanego promieniami UV z proszkiem dwutlenku tytanu w równych proporcjach.

Przymocuj sondę do mikromanipulatora z uchwytem pręta montażowego tak, aby sonda znajdowała się w orientacji poziomej. Przygotuj zbiornik roboczy materiału rozpraszającego, zanurzając końcówkę drutu lub igły w przygotowanej mieszaninie tak, aby utworzyła się kropla kleju. Zamontuj drut lub igłę z kroplą w pobliżu końcówki sondy poziomej.

Umieść kulę rozpraszającą na końcówce sondy. Za pomocą mikromanipulatora powoli i ostrożnie wepchnij końcówkę światłowodu sondy w przygotowaną mieszaninę. Następnie szybko wyjmuje końcówkę z kleju i ogląda rozpraszającą się kulkę w mikroskopie.

Powtarzaj, aż na końcówce światłowodu osadzi się kulista kropla kleju o pożądanym rozmiarze. Przygotuj naczynia do zamontowania próbek. Za pomocą palnika butanowego podgrzej dużą końcówkę pipety Pasteura, aby stopić otwór o średnicy 0,5 centymetra w dnie plastikowej szalki Petriego.

Uszczelnij otwór na spodniej stronie naczynia taśmą izolacyjną lub taśmą laboratoryjną. Następnie napełnij jedną szalkę Petriego w jednej czwartej długości, a drugą szalkę Petriego do końca płynną żelatyną i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej tuż przed żelowaniem. W jednym naczyniu umieść biopsję w poduszce z lepkiej żelatyny, która utworzyła się w otworze w dnie naczynia.

Za pomocą pipety Pasteura delikatnie dodaj żelatynę o temperaturze pokojowej wokół biopsji, aż szalka Petriego będzie pełna. W przypadku próbki zerowej należy używać wyłącznie naczynia wypełnionego żelatyną. Przymocuj sondę do pionowo zorientowanego uchwytu tak, aby był skierowany w stronę źródła światła i przymocuj sondę za pomocą clamps, wąż clamps lub taśma do słupka stołu optycznego.

Podłącz końcówkę światłowodu sondy zakończoną SMA do spektrometru światłowodowego USB i podłącz spektrometr do komputera za pomocą USB. Utrzymuj sondę i manipulatory w dokładnie wyrównanej pozycji, w której będą zbierane dane. Użyj bawełnianego wacika, cienkiej igły lub zakraplacza, aby ostrożnie nałożyć niewielką ilość smaru silikonowego na część sondy, która zostanie włożona do tkanki, aby zmniejszyć tarcie między bokami sondy a próbką tkanki.

Teraz usuń taśmę zakrywającą otwór w szalce Petriego próbki i umieść ją w uchwycie na próbkę, upewniając się, że jest bezpiecznie utrzymywana na miejscu przez tarcie. Za pomocą mikromanipulatora opuścić próbkę na sondę i pozwolić sondzie wprowadzić się do żelatyny przez otwór na spodzie płytki Petriego. Kontynuuj, aż sonda znajdzie się około pięciu milimetrów od dna warstwy żelatyny.

Włącz źródło światła. Korzystając z oprogramowania spektrometru, dostosuj czas integracji spektrometru, aż sygnał będzie tak wysoki, jak to możliwe, ale nie nasycony. Ustaw średnią liczbę skanów z zakresu od dwóch do pięciu, a wartość pikseli wygładzania na sześć.

Użyteczne czasy integracji na tym etapie mogą wynosić od jednej do 15 milisekund dla tego punktu odniesienia. Sprawdzić, czy czas całkowania jest odpowiedni dla pomiaru, upewniając się, że widmo nie jest ani zbyt hałaśliwe, ani nasycone. W razie potrzeby zmień czas integracji.

Przesuń próbkę na określoną odległość za pomocą mikromanipulatora i wykonaj pomiary. Kontynuuj zapisywanie widm w każdej pionowej pozycji w tkance. Uwidoczniony jest mikroskopijny wygląd sondy przechodzącej przez tkankę.

Pokazano procentowy udział światła na różnych głębokościach tkanek w stosunku do linii podstawowej. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że te sondy są delikatne, więc nie spiesz się i upewnij się, że złącza sondy są bezpieczne, zanim przejdziesz dalej. Po wykonaniu sondy techniki pomiarowe można dostosować.

Na przykład, bez kuli rozpraszającej, sondy mogą być używane do pomiaru promieniowania docierającego do detektora z jednego kierunku. Po opracowaniu tej sondy naukowcy byli w stanie zmierzyć światło zarówno w mózgu, jak i tkance tłuszczowej u myszy za pomocą wariacji naszego aparatu pomiarowego. Pomogło to odpowiedzieć na pytanie, czy jest wystarczająco dużo światła, aby aktywować fotoreceptory obecne głęboko w tkance.