Name: Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę oznaczania efektywności krycia haploidów Saccharomyces cerevisiae w badaniach specjacji. Protokół umożliwia pomiar krzyżowania szczepów SK1AM i ScAM oraz analizę wpływu glukozy na procesy ewolucyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632) dla S.S. P.N. jest pracownikiem naukowym wspieranym przez grant DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632). A.M. jest wspierany przez Radę Badań Naukowych i Przemysłowych (CSIR), Rząd Indii, jako Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). Autorzy dziękują Paike Jayadeva Bhat za dyskusje.

UWAGA: Protokół w ogólnym zarysie obejmuje następujące etapy: (1) nanoszenie haploidów w siatkach wydajności kojenia na płytkę YPD, (2) mieszanie haploidów w równych ilościach po 24 h inkubacji i pozostawienie zmieszanych haploidów na kilka godzin w celu przeprowadzenia kojenia (7 h w niniejszym badaniu), (3) wysiewanie zmieszanych komórek na podłoże YPD w celu izolacji pojedynczych kolonii po 7 h w 30 °C oraz wreszcie (4) określenie liczby powstałych diploidów przy użyciu markerów aukstroficznych. Kroki te zostaną szczegółowo omówione poniżej (patrz również Rysunek 2).
1. Wysiewanie haploidów na siatkach do oceny wydajności kojenia
<ol>
	<li>Rewiwiować haploidy a i α z zapasów mrożonych poprzez wysianie ich na płytkę z agarem YPD (2% agar, 2% dekstroza, 1% pepton, 0,5% ekstraktu drożdżowego) i inkubować przez 48 h w temperaturze 30 °C w celu uzyskania odizolowanych pojedynczych kolonii.</li>
	<li>Szczepić pojedyncze kolonie z płytki YPD do 5 mL medium YPD (2% dekstroza, 1% pepton, 0,5% ekstraktu drożdżowego) i inkubować w 30 °C przez 48 h przy wstrząsaniu z prędkością 250 rpm. Po tym okresie inkubacji komórki znajdują się w stacjonarnej fazie wzrostu.</li>
	<li>Narysować siatkę efektywności kojenia na świeżej płytce YPD. Narysować siatkę jako prostokąt o wymiarach 1 cm x 1,5 cm podzielony na trzy pola, z których każde ma wymiary 1 cm x 0,5 cm, jak pokazano na Rysunku 2A.</li>
	<li>Nanieść 5 µL kultury YPD dwóch typów kojenia na lewy i prawy prostokąt (Rysunek 2B). Objętość ta odpowiada w przybliżeniu 5 x 105 komórek haploidalnych w każdej sekcji. Inkubować płytki przez 24 h w temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Celem zastosowania siatki jest zapewnienie precyzji pomiarów eksperymentalnych (takich jak liczba komórek w eksperymencie). Rozmiar siatki jest na tyle mały, aby był wykonalny eksperymentalnie, ale jednocześnie na tyle duży, aby można było łatwo manipulować próbkami (np. pobierać komórki z siatki) i aby nie była ona podatna na dryf lub zdarzenia przypadkowe.</li>
</ol>
​2. Mieszanie haploidów i krzyżowanie
UWAGA: Po 24 h (Rysunek 2C) taką samą liczbę komórek obu typów haploidalnych zeskrobuje się z obu siatek, miesza i nanosi w centralnym prostokącie (Rysunek 2D).
<ol>
	<li>Aby zmieszać równą liczbę komórek, należy za pomocą sterylnego wykałaczki pobrać około 1/3 plamki naniesionej w zewnętrznych polach i resuspender w 20 µL wody w sterylnej probówce 1,5 mL dla każdego z haploidów.</li>
	<li>Należy rozcieńczyć 5 µL tej zawiesiny w 2 mL wody. Pomiar OD tej rozcieńczonej zawiesiny należy przeprowadzić za pomocą spektrofotometru przy 600 nm. Następnie należy zmieszać równą liczbę komórek z dwóch szczepów, w oparciu o wartość OD oraz liczbę komórek/mL przy 1 OD dla danego szczepu. Należy obliczyć objętość przeznaczoną do zmieszania i pobrać ją z pozostałych 15 µL zawiesiny poszczególnych haploidów. 
	UWAGA: Liczba komórek naniesionych w środkowym prostokącie jest taka, aby komórki tworzyły monowarstwę. Zakładając, że komórka drożdży jest sferą o promieniu 2,58 µm33, prostokątne pole o wymiarach 1 cm x 0,5 cm wymagałoby około 1,7 x 106 komórek do utworzenia monowarstwy. Należy zadbać o to, aby nie było fizycznego kontaktu między komórkami naniesionymi do kojenia a dwiema siatkami komórek haploidalnych. Ponieważ należy zmieszać równą liczbę każdego typu komórek haploidalnych, z każdego szczepu dodaje się 8,5 x 105 komórek. Liczbę komórek oblicza się na podstawie pomiarów OD, przyjmując, że 1 OD przy 600 nm jest w przybliżeniu równoważne 1 x 107 komórkom34. Na przykład, jeśli OD600 zawiesiny haploidu a wynosi 0,17, a haploidu α wynosi 0,11, można obliczyć liczbę komórek w 5 μL każdej zawiesiny haploidalnej. Aby zapewnić 8,5 x 105 komórek każdego typu haploidu, miesza się 1,25 μL zawiesiny haploidu a i 1,93 μL zawiesiny haploidu α.</li>
	<li>Wymagane objętości obu haploidów należy dodać do nowej, sterylnej probówki 1,5 mL i dobrze wymieszać za pomocą pipety. Końcowa objętość tej zawiesiny wynosi zazwyczaj około 6–8 µL. Zawiesinę tę należy nanieść na środkową siatkę. Płytkę inkubuje się w temperaturze 30 °C przez 7 h, aby zapewnić haploidom wystarczającą ilość czasu na kojenie (Rysunek 2E).</li>
</ol>
3. Wysiewanie zmieszanych komórek na agar YPD
<ol>
	<li>Po 7 h inkubacji zeskrobać komórki z centralnego prostokąta za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety i rozcieńczyć w 2 mL sterylnej wody. Następnie zawiesinę komórkową wysiać na agar YPD w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Aby określić czynnik rozcieńczenia niezbędny do otrzymania pojedynczych kolonii, należy zmierzyć OD pierwszej probówki, do której dodano zeskrobane komórki. Specyficzne czynniki rozcieńczenia muszą zostać określone dla każdego rodzaju/szczepu komórek. 
	UWAGA: Na przykład OD600 na poziomie 0,15 odpowiada 3 x 106 komórkom w zawiesinie o objętości 2 mL (przyjmując, że 1 OD = 1 x 107 komórek/mL). Aby uzyskać kilkaset kolonii na płytce YPD, zawiesinę komórkową rozcieńczono seryjnie dwukrotnie w stosunku 1:20, a następnie do wysiewania użyto 100 μL końcowego rozcieńczenia.</li>
	<li>Po wysianiu inkubować płytki YPD w temperaturze 30 °C przez 36–48 h aż do pojawienia się pojedynczych kolonii. Należy upewnić się, że z każdego eksperymentu kojarzenia do przesiewania uzyskano kilkaset pojedynczych kolonii, aby zapewnić możliwość wykrycia istotności statystycznej w danych (Rysunek 2F). </li>
</ol>
4. Przesiewanie diploidów z wykorzystaniem markerów aukstroficznych
<ol>
	<li>Określ, jaka część uzyskanych kolonii jest diploidalna. Aby zidentyfikować kolonie diploidalne na płytce, przenieś pojedyncze kolonie, wysiewając je indywidualnie metodą kreskową na płytkę z podłożem podwójnie brakującym (2% glukozy, 0,66% bazy azotowej, 0,05% mieszanki aminokwasów double drop-out oraz 2% agaru), w której brakuje aminokwasów, względem których szczepy są aukstroficzne, jak pokazano na Rycynie 2G. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 48 h. 
	UWAGA: Kolonie można również przenieść na płytkę z podłożem podwójnie brakującym za pomocą metody replica plating. W niniejszym badaniu do ilościowego oznaczenia wydajności kojarzenia szczepów SK1AM stosowano podłoże z brakiem tryptofanu i leucyny (trp− leu−), a dla szczepów ScAM stosowano podłoże z brakiem tryptofanu i uracylu (trp− ura−). Na płytce z podłożem podwójnie brakującym rosną tylko kolonie diploidalne, ponieważ posiadają one oba markery aukstroficzne: geny TRP1 i LEU2 w szczepach SK1AM oraz geny TRP1 i URA3 w szczepach ScAM.</li>
	<li>Dodatkowo wysiej metodą kreskową lub replica plating kolonie na podłóżach pojedynczo brakujących (trp− lub leu− lub ura−), aby określić częstotliwość występowania każdego z dwóch rodzajów haploidów w populacji.</li>
	<li>Oblicz wydajność kojarzenia, η, w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie wydajności kojarzenia haploidów: η = (Liczba skojarzonych haploidów / Całkowita liczba haploidów)." src="/files/ftp_upload/64596/64596eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">    Równ. (1) 
	gdzie liczba skojarzonych haploidów jest równa dwukrotności liczby diploidów zidentyfikowanych na płytce z podłożem podwójnie brakującym (ponieważ każdy diploid powstał w wyniku kojarzenia dwóch haploidów). Całkowita liczba haploidów jest równa sumie liczby wysianych haploidów oraz dwukrotności liczby wysianych diploidów. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli po wysiewie metodą kreskową/replica plating 100 kolonii na podłożu podwójnie brakującym urośnie tylko 60 kolonii, wydajność kojarzenia wynosi 75% (ponieważ 60 x 2 haploidów skojarzyło się, tworząc 60 diploidów, a 40 haploidów nie skojarzyło się).</li>
</ol>

<ol><li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+A+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone-regulated+genes+required+for+yeast+mating+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation.</a> Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).</li>
<li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+and+fuse%3A+How+yeast+cells+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate and fuse: How yeast cells do it.</a> Open Biology. 3 (3), 130008(2013).</li>
<li>Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinase+pathways+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).</li>
<li>Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+walk-through+of+the+yeast+mating+pheromone+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway.</a> Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).</li>
<li>Reid, B. J., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mating+in+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).</li>
<li>Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+pheromone-response+is+a+metabolically+active+stationary+phase+for+bio-production%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).</li>
<li>Bagnat, M., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+polarization+during+yeast+mating%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell surface polarization during yeast mating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).</li>
<li>Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genes+required+for+cell+fusion+during+yeast+conjugation%3A+Evidence+for+a+pheromone-induced+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).</li>
<li>Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+sensu+stricto+as+a+model+system+for+evolution+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology.</a> Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).</li>
<li>Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+isolation+in+Saccharomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Reproductive isolation in Saccharomyces.</a> Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).</li>
<li>Mayr, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMayr%2C+E+%22Systematics+and+the+Origin+of+Species%2C+from+the+Viewpoint+of+a+Zoologist%22">Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).</li>
<li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+yeast+mating+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).</li>
<li>McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+regulation+of+a+gene+required+for+cell+fusion+during+mating+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).</li>
<li>Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAR1+is+required+for+oriented+polarization+of+yeast+cells+in+response+to+mating+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones.</a> Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).</li>
<li>Maclean, C. J., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prezygotic+reproductive+isolation+between+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus.</a> BMC Evolutionary Biology. 8, 1(2008).</li>
<li>Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+choice+assays+and+mating+propensity+differences+in+natural+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations.</a> Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).</li>
<li>Leu, J. Y., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+mating+discrimination+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast.</a> Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).</li>
<li>Kim, J., Hirsch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleolar+protein+that+affects+mating+efficiency+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+altering+the+morphological+response+to+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone.</a> Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+dynamically+modify+their+environment+to+achieve+better+mating+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency.</a> Science Signaling. 4 (186), (2011).</li>
<li>Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+species+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of species recognition.</a> Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).</li>
<li>McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+in+wild+yeast%3A+Delayed+interest+in+sex+after+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Johnston, S. A., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+yeast+regulatory+gene+GAL4+and+analysis+of+its+dosage+effects+on+the+galactose%2Fmelibiose+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).</li>
<li>Mahilkar, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Study+of+metabolic+specialization+leading+to+speciation%2C+using+yeast+as+a+model+system%22">Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system</a>. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).</li>
<li>Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Gal3+proteins+showing+altered+Gal80p+binding+cause+constitutive+transcription+of+Gal4p-activated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).</li>
<li>Rice, W. R., Hostert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+experiments+on+speciation%3A+What+have+we+learned+in+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years.</a> Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).</li>
<li>White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past+and+future+of+experimental+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The past and future of experimental speciation.</a> Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--The+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).</li>
<li>Domitrovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+study+of+YER067W%2C+a+new+protein+involved+in+yeast+metabolism+control+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance.</a> PLoS One. 5 (6), 11163(2010).</li>
<li>Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mendelian+inheritance+of+adaptive+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mendelian inheritance of adaptive enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).</li>
<li>Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incipient+speciation+by+divergent+adaptation+and+antagonistic+epistasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast.</a> Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).</li>
<li>Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+co-evolution+leads+to+hybrid+incompatibility+through+pentatricopeptide+repeat+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins.</a> EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).</li>
<li>Lee, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+of+nuclear+and+mitochondrial+genomes+causes+hybrid+sterility+between+two+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species.</a> Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).</li>
<li>Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxotrophic+yeast+strains+in+fundamental+and+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).</li>
<li>Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhani%2C+HD+%22From+a+to+%CE%B1%3A+Yeast+as+a+Model+for+Cellular+Differentiation%22">From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).</li>
<li>Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+S.+cerevisiae+mating+type+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR.</a> Trends in Genetics. 6 (8), 236(1990).</li>
<li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li>
<li>Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+adaptive+divergence+under+varying+degrees+of+gene+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow.</a> Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów w tej pracy. Autorzy z przyjemnością dzielą się szczepami pochodzącymi z SK1 do użytku non-profit.

Kwantyfikacja efektywności krycia u S. cerevisiae jest niezbędna do przeprowadzenia badań związanych z genami zaangażowanymi w szlaki godowe lub zbadania wpływu środowiska zewnętrznego na zachowania godowe. W ciągu ostatnich dwóch dekad S. cerevisiae stał się również popularnym modelem do rozwiązywania problemów związanych ze specjacją 14,36,37,38. Obecność dwóch typów krycia ...

Saccharomyces cerevisiae, powszechnie nazywany pączkującym drożdżem, to jednokomórkowy eukariont. Ma dwa typy krycia, A i α, i wykazuje zarówno bezpłciowe, jak i płciowe cykle rozrodcze. Typy kojarzenia a i α są haploidami i mogą dzielić się mitotycznie pod nieobecność innego typu kojarzenia w otaczającym środowisku, który reprezentuje bezpłciowy cykl drożdży. Kiedy dwa typy kojarzenia znajdują się w bliskiej odległości, przestają dzielić się mitotycznie i łączą się, tworząc komórkę diploidalną. Drożdże diploidalne mogą albo dzielić się mitotycznie w obecności składników odżywczych, albo ulegać mejozie w warunkach głodu azotu w obecności ubogiego źródła węgla, które nie ulega fermentacji, takiego jak acetate1. Powoduje to powstawanie zarodników, które pozostają w stanie uśpienia, dopóki nie pojawią się sprzyjające warunki wzrostu. Cykl życiowy zostaje zakończony, gdy te zarodniki wykiełkują, a dwa typy haploidalne zostaną uwolnione z powrotem do puli haploidalnej2,3 (Rysunek 1).

Łączenie komórek drożdży obejmuje kilka etapów, takich jak aglutynacja, tworzenie projekcji godowej lub "shmoo", po której następuje fuzja komórkowa i jądrowa4,5. Dwa typy krycia a i α wytwarzają odpowiednio współczynnik a i α czynnik, aby zainicjować krycie. Czynniki te to feromony polipeptydowe, które wiążą się z receptorami (Ste2 i Ste3) obecnymi na powierzchni komórki o przeciwnym typie krycia5. Wiązanie feromonów z receptorami inicjuje szlak odpowiedzi feromonów, szlak transdukcji sygnału kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)6,7,8. Powoduje to zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1, co prowadzi do metabolicznie aktywnej fazy stacjonarnej9. Komórki przestają wtedy dzielić się mitotycznie, a białka potrzebne do krycia są syntetyzowane. Ponieważ komórki haploidalne nie mogą się do siebie zbliżać, projekcja godowa lub "shmoo" jest skierowana w stronę partnera godowego. Kiedy komórki wchodzą w kontakt, ściana komórkowa ulega degradacji, a zawartość cytoplazmatyczna łączy się, co powoduje krzyżowanie się, tworząc komórkę diploidalną10,11. Efektywność krycia między haploidami została wykorzystana jako miara specjacji w szczepach wyewoluowanych w laboratorium, a także między istniejącymi gatunkami12.

Będąc prostym organizmem eukariotycznym, drożdże są modelem z wyboru dla dużej liczby pytań badawczych związanych ze złożonymi organizmami eukariotycznymi. Jedno z takich pytań wiąże się ze specjacją i ewolucją barier rozrodczych13,14. W przypadku organizmów rozmnażających się płciowo gatunek jest definiowany przez koncepcję gatunku biologicznego (BSC) zaproponowaną przez Ernsta Mayra15. Zgodnie z tą koncepcją mówi się, że dwa osobniki populacji należą do dwóch różnych gatunków, jeśli nie mogą się krzyżować i są izolowane reprodukcyjnie. Załamanie płciowego cyklu rozrodczego (który obejmuje fuzję gamet w celu utworzenia zygoty, rozwój zygoty w potomstwo i osiągnięcie dojrzałości płciowej u potomstwa) prowadzi do izolacji reprodukcyjnej. Jak pokazano w Rysunek 1, cykl życiowy S. cerevisiae jest porównywalny do płciowego cyklu rozrodczego: a) fuzja dwóch typów krycia a i α jest podobna do fuzji gamet w organizmach rozmnażających się płciowo; b) zdolność diploida do przechodzenia podziału mitotycznego jest równoznaczna z rozwojem zygoty w potomstwo; oraz c) diploidalny zarodniknik poddawany jest porównywalny z procesem gametogenezy14.

Izolacja pre-zygotyczna występuje, gdy obserwuje się kojarzenie selektywne. Mając równe szanse na kojarzenie się z dwoma genetycznie różnymi typami a, typ α preferencyjnie kojarzy się z jednym z nich nad drugim lub odwrotnie14. W przypadku eksperymentów ewolucyjnych, w których haploidy ewoluowały w różnych środowiskach, obecność bariery przed kryciem można określić, przeprowadzając test kojarzenia. Spadek efektywności krycia w porównaniu z przodkiem wskazuje na ewolucję bariery przed kryciem. Izolacja postzygotyczna może powstać z powodu niezdolności diploidalnego do skutecznego podziału mitotycznego i/lub zarodnikowania w celu wytworzenia haploidalnych zarodników14. Można je określić ilościowo, mierząc odpowiednio tempo wzrostu diploidów i obliczając wydajność zarodnikowania. W związku z tym, aby zbadać ewolucję barier rozrodczych, potrzebne są solidne metody ilościowego określania (a) wydajności krycia, (b) mitotycznego wzrostu diploidu oraz (c) wydajności zarodnikowania diploidalnego. W niniejszej pracy przedstawiono solidną metodę ilościowego określania skuteczności kojarzenia szczepów drożdży.

W eksperymentach laboratoryjnych, jednym ze sposobów wykrywania występowania krycia jest użycie markerów auksotroficznych, które uzupełniają wymagania żywieniowe. Gdy dwa typy kojarzenia są auksotroficzne dla dwóch różnych aminokwasów, tylko komórka diploidalna utworzona w wyniku fuzji dwóch typów kojarzenia może rosnąć na pożywce z niedoborem obu aminokwasów. W związku z tym markery auksotroficzne są przydatne do wykrywania krycia zarówno jakościowo, jak i ilościowo. Test jakościowy wystarczy do zidentyfikowania typu krycia szczepu po mejozie16. Testy ilościowe są niezbędne, gdy ktoś jest zainteresowany identyfikacją zmniejszenia krycia podczas badania genów zaangażowanych w szlak kojarzenia17,18. Ponadto, w związku z tym, że drożdże są coraz częściej wykorzystywane w badaniach specjacji, konieczny jest wygodny i powtarzalny test kojarzenia, ponieważ kwantyfikacja skuteczności krycia jest miarą bariery przedzygotycznej.

Efektywność krycia między dwoma typami krycia drożdży została wcześniej określona ilościowo16,19,20. Większość poprzednio używanych metod ma podobny wygląd z kilkoma wariantami16,21,22,23,24,25. Niektóre z nich używają kultur we wczesnej fazie logarytmicznej, podczas gdy kilka innych używa kultur szczepów haploidalnych w środkowej fazie logarytmicznej. Istnieją różnice w proporcjach, w których te dwa typy krycia są mieszane. Prawie wszystkie protokoły wykorzystują membranę nitrocelulozową. Zawiesiny obu typów krycia pobrane z wcześniej wyhodowanych kultur są mieszane i filtrowane na membranie nitrocelulozowej umieszczonej na płytce YPD. W jednym z wariantów protokołu haploidalna zawiesina jest bezpośrednio łatana na płycie YPD21. W eksperymentach dotyczących genów zaangażowanych w produkcję feromonów dwóch typów kojarzenia, feromony są dodawane zewnętrznie podczas tworzenia zawiesin dwóch typów kojarzenia24.

Po inkubacji przez kilka godzin (zazwyczaj około 5 godzin) po wymieszaniu haploidów, komórki są zmywane z błony, rozcieńczane i powlekane na selektywnych podłożach. W jednej z wcześniejszych metod opisanych w 1973 roku, efektywność tworzenia lub kojarzenia zygoty została obliczona poprzez zliczenie liczby pączków, komórek niepączkujących i par kojarzących się pod mikroskopem za pomocą hemocytometru26. Jednak większość metod opisanych później wykorzystuje markery auksotroficzne do rozróżnienia haploidów i diploidów. Efektywność krycia jest obliczana jako procent komórek diploidalnych w stosunku do liczby komórek diploidalnych i haploidalnych w puli komórkowej16,21,23.

Jednakże, pomimo wielu doniesień o używaniu drożdży jako organizmu modelowego do badania specjacji, do tej pory w literaturze nie ma standardowego protokołu do obliczania efektywności krycia. Komórki w fazie logarytmicznej mogą nie być idealne do ilościowego określenia wydajności krycia. Podczas krycia cykl komórkowy dwóch haploidów zostaje zatrzymany, a zatem komórki podczas krycia nie dzielą się9. Ponieważ wiadomo również, że cykl komórkowy jest podobnie zatrzymany w komórkach w fazie stacjonarnej27, użycie takich komórek może sprawić, że protokół będzie bardziej powtarzalny. Komórki fazy stacjonarnej można mieszać i układać na płytkach YPD (tj. w środowisku bogatym w składniki odżywcze) w celu krycia. Konwencjonalne procedury wymagają również membrany nitrocelulozowej i zmywania komórek, co sprawia, że proces jest uciążliwy i podatny na błędy w obsłudze. Ponadto stosowane do tej pory protokoły określają ilościowo skuteczność krycia w odniesieniu do jednego haploidu. Jednak przy pomiarze izolacji reprodukcyjnej skuteczność krycia określa się ilościowo dla określonej kombinacji haploidów, a nie dla pojedynczego haploidu.

Aby rozwiązać te problemy, tutaj przedstawiamy solidną metodę ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży, która jest wysoce powtarzalna i łatwa w użyciu. Co więcej, metoda ta oraz zastosowane w niej szczepy drożdży mogą być również wykorzystane w badaniach nad wpływem przepływu genów na ewolucję barier godowych.

W tym badaniu użyto dwóch różnych szczepów S. cerevisiae. Jeden ze szczepów wywodzi się z tła SK1; zostało to zmodyfikowane w naszym laboratorium poprzez dodanie markerów auksotroficznych w pobliżu locus MAT. Wynikowe genotypy haploidów przedstawiono w tabeli 128,29,30. W szczepie SK1 haploidalny miał gen TRP1 wstawiony w pobliżu locus MAT, a α haploidalny miał gen LEU2 wstawiony w pobliżu locus MAT. W szczepie ScAM geny TRP1 i URA3 zostały wprowadzone odpowiednio do haploidów a i α. Miejsce insercji znajdowało się w regionie ARS chromosomu III (Chr III: 197378..197609). Dla opisanego tutaj protokołu wystarczą markery auksotroficzne w dowolnym miejscu genomu. Jednak posiadanie markerów auksotroficznych w pobliżu locus MAT oznacza, że szczepy te mogą być również wykorzystywane do badań badających wpływ przepływu genów na specjację31,32. Markery dodano w pobliżu locus MAT, aby zapobiec przetasowaniu markerów w wyniku rekombinacji. W związku z tym protokół ten może być wykorzystany do ilościowego określenia wydajności krycia w badaniach obejmujących specjację, a także do identyfikacji zmiany wydajności krycia podczas badania białek zaangażowanych w szlak kojarzenia.

<table><tbody><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Life Science</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Agar w proszku regularny do bakteriologii</td><td>SRL</td><td>19661 (0140186)</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu, Hi-AR</td><td>HiMedia</td><td>GRM1273</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma Life Science</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Szklane płytki Petriego</td><td>HiMedia</td><td>PW008</td><td>&nbsp; Wymiar 90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma Life Science</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma Life Science</td><td>A7219</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorek L-histydyny monohydrat</td><td>Sigma Life Science</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma Life Science</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Aldrich</td><td>62840</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Life Science</td><td>M5308</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma Life Science</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma Life Science</td><td>V0513</td><td></td></tr><tr><td>Krycie siatka</td><td></td><td></td> wydajności <td>1 cm x 1,5 cm siatka prostokątna narysowana na płytce Petriego</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>HiMedia</td><td>RM001</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Life Science</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy w proszku</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów i siarczanu</td> <td>amonuBD Difco</td><td>233520</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie efektywności krycia haploidów u saccharomyces cerevisiae

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w genetyce, ewolucji i biologii molekularnej. W ostatnich latach stał się również popularnym organizmem modelowym do badania problemów związanych ze specjacją. Cykl życiowy drożdży obejmuje zarówno fazę rozmnażania bezpłciowego, jak i płciowego. Łatwość przeprowadzania eksperymentów ewolucyjnych oraz krótki czas generacji organizmu pozwalają na badanie ewolucji barier rozrodczych. Wydajność, z jaką dwa typy kojarzenia (a i α) łączą się w pary, tworząc diploidalny a/α, jest określana jako wydajność krycia. Każdy spadek skuteczności krycia między haploidami wskazuje na barierę przedzygotyczną. W związku z tym, aby określić ilościowo zakres izolacji reprodukcyjnej między dwoma haploidami, wymagana jest solidna metoda ilościowego określania wydajności krycia. W tym celu przedstawiono tutaj prosty i wysoce powtarzalny protokół. Protokół obejmuje cztery główne kroki, które obejmują łatanie haploidów na płytce YPD, mieszanie haploidów w równych liczbach, rozcieńczanie i posiewanie dla pojedynczych kolonii, a na koniec obliczanie wydajności na podstawie liczby kolonii na płytce odpadającej. Markery auksotroficzne są stosowane w celu wyraźnego rozróżnienia między haploidami a diploidami.

Ilościowe oznaczenie wydajności kojenia dwóch typów kojenia 
Opisany tutaj protokół został zastosowany do ilościowego oznaczenia wydajności kojenia między dwoma szczepami drożdży – pomiędzy SK1AMa a SK1AMα oraz pomiędzy ScAMa a ScAMα (Rysunek 3A). W tych eksperymentach kojenie dwóch haploidów powtarzano co najmniej 12 razy. W każdym powtórzeniu eksperymentu na podłoża double drop-out wykreślono co najmnie...

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Protokół ten jest prostą metodą ilościowego określania wydajności, z jaką różne szczepy i gatunki drożdży łączą się ze sobą. Proponowana metoda jest prosta, solidna i wydajna. Metodę można rozszerzyć na dowolny szczep drożdży.Metoda opisana w tym badaniu może być wykorzystana do zrozumienia, w jaki sposób zachodzi specjacja w drożdżach. Co więcej, szczepy, które opisujemy, mogą być szczególnie przydatne do projektowania eksperymentów z przepływem genów. Mocną stroną tej metody jest to, że jest naprawdę prosta.W zależności od użytego szczepu mogą być konieczne pewne korekty, takie jak czas inkubacji. Rozpocznij ożywianie haploidów A i Alfa z zamrożonych wywarów, nakładając inokulum drożdży na dekstrozę peptonu z ekstraktem drożdżowym lub płytkę agarową YPD. Pozwól im rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby uzyskać pojedyncze kolonie.Po inkubacji zaszczepić pojedyncze kolonie z płytki YPD i pięciu mililitrów pożywki YPD i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Po tym okresie inkubacji komórki znajdują się w stacjonarnej fazie wzrostu. Na świeżej płytce YPD narysuj siatkę efektywności łączenia jako prostokąt o wymiarach 1 na 1,5 centymetra podzielony na trzy pola, z których każde ma wymiary 1 na 0,5 centymetra.Zaszczepić pięć mikrolitrów kultury YPD dwóch typów krycia na skrajnym lewym i prawym prostokącie. Ta objętość odpowiada mniej więcej 5 razy 10 piątym komórkom haploidalnym w każdej sekcji. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Aby wymieszać równą liczbę komórek drożdży, usuń około 1/3 wzrostu drożdży powstałego w zewnętrznych pudełkach za pomocą sterylnej wykałaczki i ponownie zawieś usunięte komórki w 20 mikrolitrach wody w sterylnej fiolce o pojemności 1,5 mililitra. Postępuj zgodnie z tym dla każdego haploida. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów tej zawiesiny w dwóch mililitrach wody i zmierzyć gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru o długości 600 nanometrów.Na podstawie wartości gęstości optycznej i liczby komórek na mililitr przy jednej gęstości optycznej, dodaj wymagane objętości obu haploidów do świeżej i sterylnej fiolki o pojemności 1,5 mililitra. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety. Ostateczna objętość tego zawieszenia wynosi zwykle około sześciu do ośmiu mikrolitrów.Następnie zaszczepij tę zawiesinę w środkowej siatce. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez siedem godzin, pozwalając haploidom na kojarzenie się. Po siedmiu godzinach inkubacji zeskrob komórki ze środkowego prostokąta za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety i rozcieńcz w dwóch mililitrach sterylnej wody.Przeprowadzić dalsze rozcieńczenia, a następnie rozprowadzić zawiesinę komórek na agarze YPD, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Po posiewie inkubuj płytki YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 36 do 48 godzin, aby rozwinąć pojedyncze kolonie. Upewnij się, że z każdego doświadczenia krytowego uzyskano kilkaset pojedynczych kolonii do badań przesiewowych, aby zapewnić statystyczną istotność danych.Aby zidentyfikować diploidalne kolonie na płytce, przenieś pojedyncze kolonie, umieszczając je pojedynczo na podwójnej płytce, bez aminokwasów, dla których szczepy są auksotroficzne. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin i obliczyć skuteczność krycia, nu. Solidność protokołu umożliwiła łatwe rozróżnienie skuteczności krycia między dwoma szczepami, SK1AM i ScAM.Podczas gdy szczepy SK1 łączyły się z bardzo wysoką wydajnością, szczepy ScAM łączyły się ze stosunkowo niższą wydajnością. Wydajność krycia szczepów ScAM znacznie spadła, gdy środowisko nie zawierało glukozy jako podstawowego źródła węgla, co wskazuje, że krycie jest procesem energetycznie kosztownym, a wzrost na alternatywnych źródłach węgla jakościowo zmniejsza efektywność krycia. Gdy pozwolono im łączyć się w pary przez różne okresy czasu, przez pierwsze cztery do pięciu godzin nie obserwowano krycia.Pierwsze diploidy pojawiły się dopiero po czterech do pięciu godzinach, co wskazuje, że jest to czas potrzebny na zakończenie procesu kojarzenia w danym środowisku. Po tym czasie wydajność krycia gwałtownie wzrosła. Po upływie siedmiu godzin na obliczenia efektywności krycia wpłynął fakt, że wzrost mitotyczny rozpoczął się na płytce.Upewnij się, że wymieszano równą liczbę obu haploidów. Odchylenia od tego doprowadziłyby do różnic w niezależnych powtórzeniach protokołu. To, w jaki sposób przepływ genów wpływa na adaptację i specjację, jest kwestią otwartą.Ponieważ markery auksotroficzne są umieszczane obok locus MAT w naszych szczepach, pomaga to odpowiedzieć na to ważne pytanie.

determination-mating-efficiency-haploids-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W celu oczyszczenia zygot S. cerevisiae, zmodyfikowano komórki haploidalne o przeciwnych typach matingowych tak, aby wykazywały ekspresję czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych, a następnie poddano je wspólnej inkubacji w celu umożliwienia tworzenia zygot i frakcjonowania zgodnie z protokołem opartym na cytometrii przepływowej. Wysoce wzbogacona frakcja umożliwia późniejsze badania „omiczne”, odzyskanie początkowego potomstwa oraz systematyczne badanie morfogenezy zygot.

Oczyszczanie zygot S. cerevisiae metodą cytometrii przepływowej

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Tutaj zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae odbywa się w formacie 96 wielodołkowym.

Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę oznaczania efektywności krycia haploidów Saccharomyces cerevisiae w badaniach specjacji. Protokół umożliwia pomiar krzyżowania szczepów SK1AM i ScAM oraz analizę wpływu glukozy na procesy ewolucyjne.

Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów