Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten jest prostą metodą ilościowego określania wydajności, z jaką różne szczepy i gatunki drożdży łączą się ze sobą. Proponowana metoda jest prosta, solidna i wydajna. Metodę można rozszerzyć na dowolny szczep drożdży.

Metoda opisana w tym badaniu może być wykorzystana do zrozumienia, w jaki sposób zachodzi specjacja w drożdżach. Co więcej, szczepy, które opisujemy, mogą być szczególnie przydatne do projektowania eksperymentów z przepływem genów. Mocną stroną tej metody jest to, że jest naprawdę prosta.

W zależności od użytego szczepu mogą być konieczne pewne korekty, takie jak czas inkubacji. Rozpocznij ożywianie haploidów A i Alfa z zamrożonych wywarów, nakładając inokulum drożdży na dekstrozę peptonu z ekstraktem drożdżowym lub płytkę agarową YPD. Pozwól im rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby uzyskać pojedyncze kolonie.

Po inkubacji zaszczepić pojedyncze kolonie z płytki YPD i pięciu mililitrów pożywki YPD i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Po tym okresie inkubacji komórki znajdują się w stacjonarnej fazie wzrostu. Na świeżej płytce YPD narysuj siatkę efektywności łączenia jako prostokąt o wymiarach 1 na 1,5 centymetra podzielony na trzy pola, z których każde ma wymiary 1 na 0,5 centymetra.

Zaszczepić pięć mikrolitrów kultury YPD dwóch typów krycia na skrajnym lewym i prawym prostokącie. Ta objętość odpowiada mniej więcej 5 razy 10 piątym komórkom haploidalnym w każdej sekcji. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Aby wymieszać równą liczbę komórek drożdży, usuń około 1/3 wzrostu drożdży powstałego w zewnętrznych pudełkach za pomocą sterylnej wykałaczki i ponownie zawieś usunięte komórki w 20 mikrolitrach wody w sterylnej fiolce o pojemności 1,5 mililitra. Postępuj zgodnie z tym dla każdego haploida. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów tej zawiesiny w dwóch mililitrach wody i zmierzyć gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru o długości 600 nanometrów.

Na podstawie wartości gęstości optycznej i liczby komórek na mililitr przy jednej gęstości optycznej, dodaj wymagane objętości obu haploidów do świeżej i sterylnej fiolki o pojemności 1,5 mililitra. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety. Ostateczna objętość tego zawieszenia wynosi zwykle około sześciu do ośmiu mikrolitrów.

Następnie zaszczepij tę zawiesinę w środkowej siatce. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez siedem godzin, pozwalając haploidom na kojarzenie się. Po siedmiu godzinach inkubacji zeskrob komórki ze środkowego prostokąta za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety i rozcieńcz w dwóch mililitrach sterylnej wody.

Przeprowadzić dalsze rozcieńczenia, a następnie rozprowadzić zawiesinę komórek na agarze YPD, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Po posiewie inkubuj płytki YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 36 do 48 godzin, aby rozwinąć pojedyncze kolonie. Upewnij się, że z każdego doświadczenia krytowego uzyskano kilkaset pojedynczych kolonii do badań przesiewowych, aby zapewnić statystyczną istotność danych.

Aby zidentyfikować diploidalne kolonie na płytce, przenieś pojedyncze kolonie, umieszczając je pojedynczo na podwójnej płytce, bez aminokwasów, dla których szczepy są auksotroficzne. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin i obliczyć skuteczność krycia, nu. Solidność protokołu umożliwiła łatwe rozróżnienie skuteczności krycia między dwoma szczepami, SK1AM i ScAM.

Podczas gdy szczepy SK1 łączyły się z bardzo wysoką wydajnością, szczepy ScAM łączyły się ze stosunkowo niższą wydajnością. Wydajność krycia szczepów ScAM znacznie spadła, gdy środowisko nie zawierało glukozy jako podstawowego źródła węgla, co wskazuje, że krycie jest procesem energetycznie kosztownym, a wzrost na alternatywnych źródłach węgla jakościowo zmniejsza efektywność krycia. Gdy pozwolono im łączyć się w pary przez różne okresy czasu, przez pierwsze cztery do pięciu godzin nie obserwowano krycia.

Pierwsze diploidy pojawiły się dopiero po czterech do pięciu godzinach, co wskazuje, że jest to czas potrzebny na zakończenie procesu kojarzenia w danym środowisku. Po tym czasie wydajność krycia gwałtownie wzrosła. Po upływie siedmiu godzin na obliczenia efektywności krycia wpłynął fakt, że wzrost mitotyczny rozpoczął się na płytce.

Upewnij się, że wymieszano równą liczbę obu haploidów. Odchylenia od tego doprowadziłyby do różnic w niezależnych powtórzeniach protokołu. To, w jaki sposób przepływ genów wpływa na adaptację i specjację, jest kwestią otwartą.

Ponieważ markery auksotroficzne są umieszczane obok locus MAT w naszych szczepach, pomaga to odpowiedzieć na to ważne pytanie.