Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Protokół ten pozwala na skuteczne i powtarzalne różnicowanie brązowych adipocytów, które wyrażają kluczowe adipogenne czynniki transkrypcyjne, markery dojrzałych adipocytów oraz mają potencjał termogeniczny i fenotyp morfologiczny dojrzałych brązowych adipocytów. Jest to prosta i powtarzalna dwufazowa procedura różnicowania w celu uzyskania komórek o cechach dojrzałych brązowych adipocytów z międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej nowonarodzonych myszy. Protokół ten pozwala na badanie mechanizmów aktywacji brunatnej tkanki tłuszczowej jako celu w leczeniu otyłości.

Jest to model do określania mechanizmów zaangażowanych w patofizjologię lipodystrofii. Oczekuje się, że wykonanie tej techniki po raz pierwszy będzie wyzwaniem. Aby uzyskać pomyślne wyniki, niezbędne jest posiadanie szczegółowego protokołu i podkreślenie krytycznych punktów.

Na początek umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry na środku grzbietu zwierzęcia za pomocą ostrych nożyczek. Ostrożnie usunąć skórę, chirurgicznie odłączyć iBAT od tuszy za pomocą małych nożyczek. Zbierz oba płaty iBAT za pomocą szczypiec z zakrzywionymi końcówkami, aby usunąć je niezależnie.

Umieść dwa płatki w plastikowej tubie z 1,5 mililitra sterylnego PBS w temperaturze pokojowej. Inkubować tkanki iBAT w buforze do wytrawiania kolagenazy typu drugiego przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągłe, delikatnie wstrząsając przy prędkości 800 obr./min. Mechanicznie rozbić zawiesinę tkankową w buforze do trawienia kolagenazy typu drugiego, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P1000 i końcówek filtrujących.

Użyj nowej końcówki dla każdej próbki. Przepuść zdesegregowane tkanki przez indywidualne sitka o średnicy 100 mikrometrów do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 500 mikrolitrów buforu ACK do przefiltrowanych próbek tkanek.

Odwróć probówki cztery do pięciu razy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie przepuścić zawiesiny przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra za pomocą mikropipety P1000 i przefiltrowanych końcówek. Centrifusion ponownie zawiesić osad zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Następnie wysiewaj każdą próbkę do sześciu dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej, dodając jeden mililitr zawiesiny do każdej studzienki. Niezróżnicowane preadipocyty wykazywały bardzo niskie lub niewykrywalne poziomy ppar-gamma, C/ebp-alfa, perylipiny 1 i CD36. W przeciwieństwie do tego, markery te były znacznie wyższe w siódmym dniu różnicowania.

Nagromadzenie wielu kropelek lipidów w brązowych preadipocytach było zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami. Zaobserwowano znaczny wzrost poziomu mitochondrialnego markera masy TOM 20 i białka kompleksu fosforylacji oksydacyjnej w siódmym dniu różnicowania. UCP1, prawdziwy marker tego typu komórek, nie został wykryty w niezróżnicowanych preadipocytach, podczas gdy był zasadniczo wyrażany w dojrzałych brązowych adipocytach w siódmym dniu różnicowania.

Mitochondria ewoluowały od wydłużonego kształtu rurki w dniu zero w kierunku zaokrąglonego lub przypominającego fasolę kształtu w siódmym dniu. Wewnętrzna struktura mitochondriów została również zmodyfikowana przez adipogenezę, co spowodowało większą gęstość równolegle upakowanych krystalików. Co ważne, mitochondria były ściśle związane z kropelkami lipidów w zróżnicowanych brązowych adipocytach, więc nie można było wykryć dostrzegalnej odległości między zewnętrzną błoną mitochondriów a powierzchniami kropelek lipidów, nawet przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości.

Chirurgiczne usunięcie tkanki tłuszczowej między łopatkami ma kluczowe znaczenie. Nieefektywna ilość tkanki ogranicza dostępność komórek, które będą się różnicować. Ta technika obrazowania pomaga scharakteryzować morfologię zróżnicowanych brązowych adipocytów in vitro.

Możliwe jest wykonanie testów funkcji mitochondriów, aktywacji beta androgennej i hamowania autofagicznego.