Name: Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj wermimetrię przepływową do analizy mikrobiomu jelitowego u Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia monitorowanie kolonizacji mikrobów w czasie rzeczywistym i korelację z fizjologią gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH DP2DK116645 (dla B.S.S.), nagrodę dla pilota Fundacji Dunna oraz grant NASA 80NSSC22K0250 (dla B.S.S.). Projekt ten był również wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine z finansowaniem z CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 i RR024574) oraz pomocy Joela M. Sederstroma, a także dotacji na oprzyrządowanie dla grantu LPS NIH (S10 OD025251). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li>
<li>Bäckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li>
<li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).</li>
<li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li>
<li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).</li>
<li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+need+microbes+too%3A+microbiota%2C+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Team+R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Core%22%5BJournal%5D)">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li>
<li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22tidyverse%22">tidyverse</a>. , (2019).</li>
<li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput%2C+high-content%2C+liquid-based+C.+elegans+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li>
<li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877(2018).</li>
<li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li>
<li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li>
<li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIP-MAP%3A+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Wermimetria przepływowa została wykorzystana do scharakteryzowania genów i szlaków C. elegans przeciwko kolonizacji patogenów i toksyczności w kilku badaniach21,22. W tym miejscu przedstawiono podejście o wysokiej przepustowości, które wykorzystuje C. elegans do zbadania, w jaki sposób mikrobiomy jelitowe modulują fizjologię gospodarza. W porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi jednostki tworzące kolonie (CFU) lub sekwencjonowanie am...

Ewolucja zwierząt jest pod ciągłym wpływem mikroorganizmów1. Z różnych mikroorganizmów żyjących w środowisku, żywiciele zwierząt pozyskują określonych partnerów2, którzy rozszerzają możliwości gospodarza i wpływają na jego fizjologię i podatność na choroby3. Na przykład analizy metagenomiczne mikrobiomu jelitowego ujawniły wzbogacone klasy metaboliczne genów drobnoustrojów, które mogą zapewniać większe pozyskiwanie i magazynowanie energii u otyłych myszy4, z których wiele znajduje się również w ludzkim mikrobiomie jelitowym5. Nadal istnieje ogromna potrzeba ustalenia związków przyczynowo-skutkowych i wskazania molekularnych determinantów wpływu mikrobiomu, chociaż postęp jest utrudniony ze względu na złożoność mikrobiomu i podatność systemów gospodarza na badania przesiewowe na dużą skalę.
Modelowy organizm C. elegans stanowi platformę do pogłębienia molekularnego zrozumienia powiązań między mikrobiomem a fizjologią gospodarza. C. elegans posiada 20 komórek jelitowych z warstwą błony śluzowej i strukturami kosmków. Komórki te są wyposażone w liczne geny chemoreceptorów, które wykrywają produkty drobnoustrojów i wytwarzają cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe, które potencjalnie regulują ich kolonizatory jelitowe6,7. Ta zachowana biologia C. elegans doprowadziła do ogromnej liczby odkryć w sygnalizacji gospodarza, która reguluje drobnoustroje jelitowe, w tym sygnalizację insuliny, TGF-beta i kinazę MAP8,9,10.
C. elegans wykorzystują mikroby zarówno jako dietę do wzrostu podczas rozwoju, jak i mikrobiom jako dorośli. Z wiekiem niektóre drobnoustroje mogą nadmiernie gromadzić się w świetle jelita, a relacja gospodarz-mikroorganizm zmienia się z symbiozy na patogenezę11. W swoim naturalnym środowisku C. elegans napotyka szeroki wachlarz gatunków bakterii12,13. Sekwencjonowanie 16S rDNA z reprezentatywnych próbek zebranych w naturalnych siedliskach (zgniłe owoce, łodygi roślin i wektory zwierzęce) ujawniło, że naturalny mikrobiom C. elegans jest zdominowany przez cztery typy bakterii: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes i Actinobacteria. W obrębie tych podziałów znajduje się duże zróżnicowanie w różnorodności i bogactwie bakterii w zależności od siedliska12,13,14,15. Ustanowiono kilka zdefiniowanych społeczności, w tym 63-osobowe (BIGbiome)16 i 12-osobowe (CeMbio) kolekcje reprezentujące najważniejsze rodzaje mikrobiomu stworzone dla społeczności badawczej C. elegans17. Zarówno mikrobiomy, jak i szczepy składowe mogą mieć różnorodny wpływ na fizjologię C. elegans, taki jak wielkość ciała, tempo wzrostu i reakcje na stres9,16,17. Badania te dostarczają zasobów i przykładów do ustalenia C. elegans jako modelu do badań nad mikrobiomem.
Tutaj prezentowany jest przepływ pracy oparty na sorterze dużych cząstek (LPS) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), który wykorzystuje system C. elegans do jednoczesnego pomiaru składu mikrobiomu i podstawowych pomiarów fizjologii gospodarza w skali populacji. Od strony mikrobiologicznej przepływ pracy można dostosować do tworzenia zdefiniowanego mikrobiomu lub pojedynczych drobnoustrojów w celu przetestowania wytrzymałości i plastyczności społeczności przy rosnących interakcjach mikrobiologicznych. Po stronie gospodarza przepływ pracy umożliwia testy o wysokiej przepustowości w celu pomiaru poziomu kolonizacji drobnoustrojów fluorescencyjnych w mikrobiomie oraz odczytu fizjologicznego gospodarza pod względem rozwoju, wielkości ciała i reprodukcji. Reasumując, model mikrobiomu C. elegans umożliwia przeprowadzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu określenia metabolicznych i genetycznych uwarunkowań modulujących fizjologię gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Stożkowe dolne probówki wirówkowe 15 ml</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>96 płytek głębinowych (1 ml)</td><td>Axygen</td><td>P-DW-11-C</td><td></td></tr><tr><td>96 płytek głębinowych (2 ml)</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka Costar</td><td>Corning</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>Standard agar bakteriologiczny jest również wystarczający</td></tr>.<tr><td>Kolektor zasysający</td><td>V& P naukowe</td><td>VP1171A</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wybielacza&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj wybielacz z 5M Podchloryn sodu 2:1 (v/v)</td></tr><tr><td>Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy</td><td>Biotek</td><td>Cytacja 5</td><td>Bakteryjny pomiar OD</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo naukowy&nbsp;</td><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Do 96-dołkowej płytki i stożkowych probówek</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>ggplot: Różne narzędzia do programowania R do wykreślania danych.</td><td>Pakiet R</td><td>Wersja 3.3.2</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler dużych cząstek</td><td>Próbnik Union Biometrica</td><td>LP Sortownik</td><td></td></tr><tr><td>dużych cząstek</td><td>Union Biometrica</td><td>COPAS Biosorter</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Fisher</td><td>AC187870100</td><td></td></tr><tr><td>Bulion lizogeniczny (LB)</td><td>RPI</td><td>L24066</td><td>Standardowe domowe przepisy LB wykorzystujące bakto-trypton, ekstrakt drożdżowy i NaCl są również dostateczny.</td></tr><tr><td>Rozwiązanie M9&nbsp;</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa nicieni</td><td>RPI</td><td>N81800-1000.0</td><td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 dodane po autoklawowaniu.</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>GNU</td><td>Wersja 1.3.1093</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5M</td></tr><tr><td>NaOH Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego o średnicy 10 cm</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki 12-dołkowe</td><td>VWR</td><td>10062-894</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki 24-dołkowe</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego o średnicy 6 cm</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego caenorhabditis elegans

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Skład mikrobiomu jelitowego może mieć ogromny wpływ na fizjologię gospodarza przez cały okres rozwoju i życia zwierzęcia. Pomiar zmian składu mikrobiomu ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji funkcjonalnych relacji między tymi zmianami fizjologicznymi. Caenorhabditis elegans stał się potężnym systemem gospodarza do badania molekularnych czynników wpływających na interakcje gospodarz-mikrobiom. Dzięki przezroczystemu planowi ciała i znakowanym fluorescencyjnie naturalnym mikroorganizmom, względne poziomy drobnoustrojów w mikrobiomie jelitowym pojedynczego zwierzęcia C. elegans można łatwo określić ilościowo za pomocą sortera dużych cząstek. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalnej konfiguracji mikrobiomu, zbierania i analizy populacji C. elegans na pożądanym etapie życia, obsługi i konserwacji sortera oraz analizy statystyczne uzyskanych zestawów danych. Omówiono również kwestie związane z optymalizacją ustawień sortownika w oparciu o interesujące mikroorganizmy, opracowanie skutecznych strategii bramkowania dla etapów życia C. elegans oraz sposoby wykorzystania możliwości sortera do wzbogacenia populacji zwierząt w oparciu o skład mikrobiomu jelitowego. W ramach protokołu zostaną przedstawione przykłady potencjalnych zastosowań, w tym potencjał skalowalności do aplikacji o wysokiej przepustowości.

Definiowanie bramek populacji osobników dorosłych i larw 
W tym przypadku zsynchronizowane larwy L1 C. elegans hodowano na płytkach NGM zaszczepionych E. coli OP50 (Eco), będącym standardową pożywką laboratoryjną. Populacje C. elegans zbierano do analizy LPS po 96 h lub 120 h wzrostu w temperaturze 20 °C (Rysunek 2A). Wykres kropkowy ekstynkcji (EXT, wskaźnik gęstości ciała) w funkcji czasu przelotu (TOF, wskaźnik długości ciała) tworzy dwie wiz...

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Mikrobiom jelitowy odgrywa ważną rolę w kształtowaniu fizjologii gospodarza. Protokół ten, w szczególności, pozwala na wysokoprzepustową ocenę poziomów kolonizacji fluorescencyjnych mikroorganizmów jelitowych u pojedynczych, komórkowych zwierząt na dużą skalę. Jedną z głównych zalet tej metody jest możliwość monitorowania mikrobiomu jelitowego żywych zwierząt w czasie rzeczywistym, co pozwala na identyfikację i korelację wszelkich zmian z fizjologią gospodarza.Procedurę zademonstruje Dana Blackburn, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Zacznij od zmycia robaków z trawnika bakteryjnego za pomocą jednego do dwóch mililitrów M9-TX. Przenieś robaki na wysterylizowaną płytkę o głębokości 2 mililitrów 96 dołków.Granulować je w 300 G przez jedną minutę i usunąć płyn za pomocą kolektora zasysającego. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 1,2 mililitra, dodaj 1,8 mililitra M9-TX do każdego dołka płytki głębokiej wymieszanej przez kilka razy pipetowanie i odwiruj przy 300 G przez jedną minutę. Po ostatnim umyciu doprowadzić objętość w każdym dołku do 100 mikrolitrów za pomocą kolektora zasysającego.Dodaj 100 mikrolitrów 10-milimolowego lewamizolu i M9-T do każdej studzienki i pozwól robakom sparaliżować się przez pięć minut. Następnie dodaj 4% roztwór wybielacza do każdej studzienki przez dwie minuty, aby zmniejszyć grudki bakteryjne. Po zabiegu wybielania dodaj M9-TX do każdego dołka płytki, aby umyć robaki.Odwirować płytkę i odessać do końcowej objętości 100 mikrolitrów po drugim praniu. Przenieś robaki na płaską płytkę 96-dołkową, zawierającą 150 mikrolitrów 10 milimoli lewamizolu i M9-TX. Utrzymuj gęstość robaków na poziomie od 50 do 100 robaków na studnię i podziel robaki na wiele dołków, jeśli populacja jest zbyt zatłoczona.Włącz sprężarkę powietrza, komputer i przyrząd LPS. Sprawdź i opróżnij zbiornik na odpady. Sprawdź i napełnij osłonę i zbiorniki na wodę, jeśli objętość jest niska.Upewnij się, że zespół rdzenia fluidycznego i optycznego o średnicy 250 mikrometrów jest na swoim miejscu. Podłącz i włącz automatyczny podajnik próbek. Otwórz oprogramowanie automatycznego podajnika przedmiotów, aby otworzyć autosampler i oprogramowanie LPS.W oknie oprogramowania LPS przejdź do pliku i kliknij nowy eksperyment, a następnie ponownie wybierz plik i kliknij przycisk Nowa próbka sprawdzania. Włącz lasery do włączania laserów 488 i 561 nanometrów, jeśli jeszcze tego nie zrobiono. Teraz utwórz szablony dla wykresów punktowych akwizycji, używając czasu przelotu, ekstynkcji i kanałów fluorescencyjnych w oknie oprogramowania LPS.Kliknij prawym przyciskiem myszy w treści wykresu, aby zmodyfikować skalowanie. Następnie załaduj próbki kontrolne. W oknie autosamplera wybierz prime, przejdź do pliku, kliknij otwórz skrypt, aby wybrać odpowiedni wbudowany skrypt i kliknij OK.Przejdź do szablonu płytki w menu oprogramowania próbnika, aby wybrać żądane dołki do analizy. Po załadowaniu i zabezpieczeniu płytki na stoliku automatycznego podajnika próbek naciśnij przycisk uruchom płytę w oknie automatycznego podajnika próbek i zapisz file po wyświetleniu monitu, a następnie kliknij przycisk zapisz bieżące dane na górnej wstążce w oknie oprogramowania LPS i ponownie zapisz dane. Otwórz oprogramowanie LPS.Przejdź do pliku i wybierz nowy eksperyment, a następnie wróć do pliku i kliknij nowy przykład. Utwórz wykres kropkowy z czasem przelotu na osi X i wygaszania na osi Y. Utwórz kolejny wykres punktowy z czasem przelotu na osi X i kolorem czerwonym na osi Y.Upewnij się, że zaznaczono opcję włącz lasery, aby aktywować lasery 488 i 561 nanometrów. Umieść probówkę z próbką kontrolną na porcie próbki, a następnie kliknij przycisk pobierz w oknie dialogowym pobierania i dozowania. Po wyświetleniu monitu upewnij się, że plik został zapisany.Po zmierzeniu wystarczającej liczby robaków, aby zróżnicować populacje, wybierz opcję przerwania na wykresie kropkowym pokazującym czas ucieczki w stosunku do wyginięcia. Narysuj bramę wokół obszaru reprezentującego dorosłą populację. Następnie przejdź do widoku, kliknij pozycję Hierarchia bramkowania i sprawdź, czy bramki fluorescencyjne są poprawnie wymienione w bramie populacji dorosłych.Na wykresie czasu lotu w porównaniu z czerwoną kropką utwórz bramki wokół obszarów o wysokiej i niskiej wartości czerwonej, aby podkreślić interesujące regiony pokazujące kolonizację mikrobiomu u dorosłych robaków. Po zoptymalizowaniu ustawień przejdź do pliku i kliknij Zapisz eksperyment, a następnie kliknij plik i wybierz zapisz próbkę. Aby załadować urządzenie do pobierania, wybierz płytkę obciążeniową A, aby umożliwić przejście etapu pobierania do pozycji przygotowanej do załadowania probówki zbiorczej lub płytki 96-dołkowej.Aby dozować na płytkę 96-dołkową, przejdź do sekcji ustawień i wybierz płytki, a następnie kliknij na skalibrowane płytki i wybierz płytkę 96-dołkową. Następnie wybierz dołki, do których zostaną posortowane robaki i wprowadź liczbę obiektów do posortowania do każdej studzienki. Pamiętaj, aby również określić bramkowane regiony zainteresowania.Jeśli istnieje wiele bramkowanych regionów sortowanych na tej samej płycie, upewnij się, że zaznaczyłeś pole oznaczone bramką w każdej studzience. Kliknij OK, aby zapisać zmiany. Po posortowaniu numerów i przypisaniu lokalizacji załaduj próbkę do portu próbki i kliknij przyciski płytki napełniającej w oknie dialogowym pobierania i dozowania, aby rozpocząć dozowanie do płytki 96-dołkowej.U dorosłych obserwuje się wyższe wartości wydłużenia i czasu lotu w porównaniu z larwami. Potomstwo od dwudniowych dorosłych było zdominowane przez stadia L1 i L2, podczas gdy większość potomstwa od trzydniowych dorosłych osiągnęła stadia L3 i L4. W przypadku uprawy na E. coli, czas lotu i wydłużenie wzrosły trzeciego dnia w porównaniu z drugim dniem.Uprawiane na ochrobaktrum, BH three i mieszanych, cenor abdidas allegands wykazywały różnice w czasie lotu i wartościach rozciągnięcia. Zwiększoną kolonizację ochrobactrum BH3 obserwowano w stanie mieszanym niż w samym ochrobactrum BH3. Natomiast zielone, fluorescencyjne wartości wskazywały na niższą kolonizację OP50 w stanie mieszanym niż w samym OP50.Robaki są mocno przekrzywione w kierunku osi Y, co sugeruje, że kolonizacja OP50 jest niska u większości robaków, podczas gdy poziomy ochrobaktrum, kolonizacji BH3 są równomiernie rozłożone w populacji. Zaobserwowano również związek między ochrobaktrum, poziomem kolonizacji BH3 a rozwojem gospodarza, takim jak gęstość ciała i różnice we wzorcach rozrodczych. Trzydniowe dorosłe osobniki wyhodowane na dwuskładnikowym mikrobiomie mieszankowym wykazywały szeroki zakres intensywności RFP, co wskazuje na indywidualne różnice w kolonizacji ochrobaktrum w grupie.Pokazano zdjęcia zapytania ofertowego studni zawierających 15 posortowanych i pojedynczych robaków z wysokich i niskich bramek zapytania ofertowego. Najważniejszą rzeczą jest pamiętanie o stosowaniu odpowiednich elementów sterujących na wszystkich etapach, aby upewnić się, że protokół i maszyna działają poprawnie. W czasie rzeczywistym zwierzęta o określonych cechach mogą być wykorzystywane do izolowania szczepów z puli zmutowanych gospodarzy lub mikroorganizmów w celu identyfikacji genów regulujących interakcje między drobnoustrojami.Izolowane zwierzęta mogą być również wykorzystywane do analiz na pojedynczym zwierzęciu lub wzbogaconych analiz opartych na puli fenotypowej, takich jak sekwencja RNA lub tym podobne. Naprawdę, możliwości są naprawdę nieograniczone.

application-flow-vermimetry-for-quantification-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film przedstawia metodę wizualizacji i pomiaru integralności światła jelita C. elegans poprzez karmienie robaków dekstranem znakowanym FITC. Przykładowy protokół pokazuje test wykonany na robakach 3,3'-diindolilometanu (DIM) i karmionych patogenami.

Karmienie FITC-dekstranem: metoda ilościowego określania przepuszczalności jelit u C. elegans

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Poznaj wermimetrię przepływową do analizy mikrobiomu jelitowego u Caenorhabditis elegans. Ta metoda umożliwia monitorowanie kolonizacji mikrobów w czasie rzeczywistym i korelację z fizjologią gospodarza.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów