Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans
March 31st, 2023
Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.
Mikrobiom jelitowy odgrywa ważną rolę w kształtowaniu fizjologii gospodarza. Protokół ten, w szczególności, pozwala na wysokoprzepustową ocenę poziomów kolonizacji fluorescencyjnych mikroorganizmów jelitowych u pojedynczych, komórkowych zwierząt na dużą skalę. Jedną z głównych zalet tej metody jest możliwość monitorowania mikrobiomu jelitowego żywych zwierząt w czasie rzeczywistym, co pozwala na identyfikację i korelację wszelkich zmian z fizjologią gospodarza.
Procedurę zademonstruje Dana Blackburn, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Zacznij od zmycia robaków z trawnika bakteryjnego za pomocą jednego do dwóch mililitrów M9-TX. Przenieś robaki na wysterylizowaną płytkę o głębokości 2 mililitrów 96 dołków.
Granulować je w 300 G przez jedną minutę i usunąć płyn za pomocą kolektora zasysającego. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 1,2 mililitra, dodaj 1,8 mililitra M9-TX do każdego dołka płytki głębokiej wymieszanej przez kilka razy pipetowanie i odwiruj przy 300 G przez jedną minutę. Po ostatnim umyciu doprowadzić objętość w każdym dołku do 100 mikrolitrów za pomocą kolektora zasysającego.
Dodaj 100 mikrolitrów 10-milimolowego lewamizolu i M9-T do każdej studzienki i pozwól robakom sparaliżować się przez pięć minut. Następnie dodaj 4% roztwór wybielacza do każdej studzienki przez dwie minuty, aby zmniejszyć grudki bakteryjne. Po zabiegu wybielania dodaj M9-TX do każdego dołka płytki, aby umyć robaki.
Odwirować płytkę i odessać do końcowej objętości 100 mikrolitrów po drugim praniu. Przenieś robaki na płaską płytkę 96-dołkową, zawierającą 150 mikrolitrów 10 milimoli lewamizolu i M9-TX. Utrzymuj gęstość robaków na poziomie od 50 do 100 robaków na studnię i podziel robaki na wiele dołków, jeśli populacja jest zbyt zatłoczona.
Włącz sprężarkę powietrza, komputer i przyrząd LPS. Sprawdź i opróżnij zbiornik na odpady. Sprawdź i napełnij osłonę i zbiorniki na wodę, jeśli objętość jest niska.
Upewnij się, że zespół rdzenia fluidycznego i optycznego o średnicy 250 mikrometrów jest na swoim miejscu. Podłącz i włącz automatyczny podajnik próbek. Otwórz oprogramowanie automatycznego podajnika przedmiotów, aby otworzyć autosampler i oprogramowanie LPS.
W oknie oprogramowania LPS przejdź do pliku i kliknij nowy eksperyment, a następnie ponownie wybierz plik i kliknij przycisk Nowa próbka sprawdzania. Włącz lasery do włączania laserów 488 i 561 nanometrów, jeśli jeszcze tego nie zrobiono. Teraz utwórz szablony dla wykresów punktowych akwizycji, używając czasu przelotu, ekstynkcji i kanałów fluorescencyjnych w oknie oprogramowania LPS.
Kliknij prawym przyciskiem myszy w treści wykresu, aby zmodyfikować skalowanie. Następnie załaduj próbki kontrolne. W oknie autosamplera wybierz prime, przejdź do pliku, kliknij otwórz skrypt, aby wybrać odpowiedni wbudowany skrypt i kliknij OK.
Przejdź do szablonu płytki w menu oprogramowania próbnika, aby wybrać żądane dołki do analizy. Po załadowaniu i zabezpieczeniu płytki na stoliku automatycznego podajnika próbek naciśnij przycisk uruchom płytę w oknie automatycznego podajnika próbek i zapisz file po wyświetleniu monitu, a następnie kliknij przycisk zapisz bieżące dane na górnej wstążce w oknie oprogramowania LPS i ponownie zapisz dane. Otwórz oprogramowanie LPS.
Przejdź do pliku i wybierz nowy eksperyment, a następnie wróć do pliku i kliknij nowy przykład. Utwórz wykres kropkowy z czasem przelotu na osi X i wygaszania na osi Y. Utwórz kolejny wykres punktowy z czasem przelotu na osi X i kolorem czerwonym na osi Y.
Upewnij się, że zaznaczono opcję włącz lasery, aby aktywować lasery 488 i 561 nanometrów. Umieść probówkę z próbką kontrolną na porcie próbki, a następnie kliknij przycisk pobierz w oknie dialogowym pobierania i dozowania. Po wyświetleniu monitu upewnij się, że plik został zapisany.
Po zmierzeniu wystarczającej liczby robaków, aby zróżnicować populacje, wybierz opcję przerwania na wykresie kropkowym pokazującym czas ucieczki w stosunku do wyginięcia. Narysuj bramę wokół obszaru reprezentującego dorosłą populację. Następnie przejdź do widoku, kliknij pozycję Hierarchia bramkowania i sprawdź, czy bramki fluorescencyjne są poprawnie wymienione w bramie populacji dorosłych.
Na wykresie czasu lotu w porównaniu z czerwoną kropką utwórz bramki wokół obszarów o wysokiej i niskiej wartości czerwonej, aby podkreślić interesujące regiony pokazujące kolonizację mikrobiomu u dorosłych robaków. Po zoptymalizowaniu ustawień przejdź do pliku i kliknij Zapisz eksperyment, a następnie kliknij plik i wybierz zapisz próbkę. Aby załadować urządzenie do pobierania, wybierz płytkę obciążeniową A, aby umożliwić przejście etapu pobierania do pozycji przygotowanej do załadowania probówki zbiorczej lub płytki 96-dołkowej.
Aby dozować na płytkę 96-dołkową, przejdź do sekcji ustawień i wybierz płytki, a następnie kliknij na skalibrowane płytki i wybierz płytkę 96-dołkową. Następnie wybierz dołki, do których zostaną posortowane robaki i wprowadź liczbę obiektów do posortowania do każdej studzienki. Pamiętaj, aby również określić bramkowane regiony zainteresowania.
Jeśli istnieje wiele bramkowanych regionów sortowanych na tej samej płycie, upewnij się, że zaznaczyłeś pole oznaczone bramką w każdej studzience. Kliknij OK, aby zapisać zmiany. Po posortowaniu numerów i przypisaniu lokalizacji załaduj próbkę do portu próbki i kliknij przyciski płytki napełniającej w oknie dialogowym pobierania i dozowania, aby rozpocząć dozowanie do płytki 96-dołkowej.
U dorosłych obserwuje się wyższe wartości wydłużenia i czasu lotu w porównaniu z larwami. Potomstwo od dwudniowych dorosłych było zdominowane przez stadia L1 i L2, podczas gdy większość potomstwa od trzydniowych dorosłych osiągnęła stadia L3 i L4. W przypadku uprawy na E. coli, czas lotu i wydłużenie wzrosły trzeciego dnia w porównaniu z drugim dniem.
Uprawiane na ochrobaktrum, BH three i mieszanych, cenor abdidas allegands wykazywały różnice w czasie lotu i wartościach rozciągnięcia. Zwiększoną kolonizację ochrobactrum BH3 obserwowano w stanie mieszanym niż w samym ochrobactrum BH3. Natomiast zielone, fluorescencyjne wartości wskazywały na niższą kolonizację OP50 w stanie mieszanym niż w samym OP50.
Robaki są mocno przekrzywione w kierunku osi Y, co sugeruje, że kolonizacja OP50 jest niska u większości robaków, podczas gdy poziomy ochrobaktrum, kolonizacji BH3 są równomiernie rozłożone w populacji. Zaobserwowano również związek między ochrobaktrum, poziomem kolonizacji BH3 a rozwojem gospodarza, takim jak gęstość ciała i różnice we wzorcach rozrodczych. Trzydniowe dorosłe osobniki wyhodowane na dwuskładnikowym mikrobiomie mieszankowym wykazywały szeroki zakres intensywności RFP, co wskazuje na indywidualne różnice w kolonizacji ochrobaktrum w grupie.
Pokazano zdjęcia zapytania ofertowego studni zawierających 15 posortowanych i pojedynczych robaków z wysokich i niskich bramek zapytania ofertowego. Najważniejszą rzeczą jest pamiętanie o stosowaniu odpowiednich elementów sterujących na wszystkich etapach, aby upewnić się, że protokół i maszyna działają poprawnie. W czasie rzeczywistym zwierzęta o określonych cechach mogą być wykorzystywane do izolowania szczepów z puli zmutowanych gospodarzy lub mikroorganizmów w celu identyfikacji genów regulujących interakcje między drobnoustrojami.
Izolowane zwierzęta mogą być również wykorzystywane do analiz na pojedynczym zwierzęciu lub wzbogaconych analiz opartych na puli fenotypowej, takich jak sekwencja RNA lub tym podobne. Naprawdę, możliwości są naprawdę nieograniczone.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada molekularne determinanty sterujące interakcjami gospodarz-mikrobiota przy użyciu organizmu modelowego Caenorhabditis elegans. Opracowano przepływ wysokowydajny do oceny poziomów kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych robaków, umożliwiając korelacje tych poziomów z fizjologicznymi stanami robaków.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Interakcje gospodarz-mikrobiota
- Wykorzystanie organizmu modelowego w mikrobiologii
- Wysokowydajne podejścia eksperymentalne
Tło
- Mikrobiom jelitowy odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu fizjologii gospodarza.
- Rozumienie tych interakcji może dostarczyć wglądu w zdrowie i choroby.
- C. elegans służy jako efektywny model do badania tych dynamiki.
Stosowane metody
- Wysokowydajna ocena kolonizacji mikrobiomu u żywych osobników C. elegans.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym interakcji za pomocą różnych technik wykrywania fluorescencji.
- Procedury izolacji i przetwarzania robaków do analizy.
Główne wyniki
- Wykazane różnice w poziomach kolonizacji w zależności od warunków mikrobiomu.
- Zaobserwowana korelacja między kolonizacją mikrobiomu a fizjologicznymi stanami gospodarza, takimi jak etapy rozwojowe.
- Zidentyfikowane specyficzne efekty mikrobiomu na cechach fizjologicznych C. elegans.
Wnioski
- To badanie podkreśla przydatność C. elegans jako modelu do badania interakcji gospodarz-mikrobiota.
- Wyniki mają zastosowanie do zrozumienia wpływu mikrobiomu na biologię gospodarza i potencjalne zastosowania w badaniach nad zdrowiem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative flow vermimetry enables high-throughput, real-time analysis of gut microbiome composition in live Caenorhabditis elegans, supporting mechanistic de-risking and target validation in host-microbe interaction studies. This approach provides predictive confidence for linking microbial colonization to host physiological outcomes, informing early discovery and translational research pipelines. The method's scalability and reproducibility position it as a reusable capability for portfolio-wide microbiome investigations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-microbiome functional relationships using quantitative, single-animal data.
- Supports biological de-risking by correlating microbial colonization with host developmental and physiological states.
- Facilitates functional target validation through isolation of animals with defined microbiome profiles.
- Provides predictive confidence for downstream mechanistic studies and genetic screens.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live animal systems for high-throughput screening of microbial or host genetic variants.
- Standardizes gating and sorting strategies for reproducible quantification of microbiome colonization.
- Enables scalable, plate-based workflows for compound or genetic library evaluation.
- Delivers quantitative outputs suitable for robust statistical analysis and cross-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and measurement of microbiome composition in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by isolating phenotypically defined animal cohorts.
- Provides a platform for downstream omics or phenotypic analyses linked to microbiome status.
- De-risks translational hypotheses by enabling real-time, live-animal readouts of microbiome effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, screening, and translational research in microbiome-focused pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative gating and sorting clarify host-microbe pathway relationships and enable mechanistic de-risking.
- Screening: High-throughput, reproducible workflows facilitate assay readiness and enable robust compound or genetic screens.
- Analytics: Fluorescent and morphological readouts provide quantitative, statistically analyzable data for condition comparison.
- Translational Research: Enables isolation of animal cohorts for downstream biomarker or omics studies aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols and instrumentation support broad adoption across discovery and translational teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-microbiome studies.
- Operational Value: Delivers scalable, reproducible, and standardized workflows for live-animal microbiome quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-related discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, microbiome biology, and C. elegans handling.
- Needs access to large particle sorters with fluorescence detection and compatible software.
- Demands rigorous control selection and cross-team standardization for gating and sorting strategies.
- Adaptation may be needed for different microbial strains or host genetic backgrounds.
- Throughput and sensitivity depend on instrument configuration and sample preparation quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Collecting Worm Population for Gut Microbiome Analyses
2:08
Setting Up the Large Particle Sorter and Autosampler
3:43
Sorting of Caenorhabditis elegans by Gut Microbiome Features
6:05
Results: Profiling Gut Microbiome Colonization
7:50
Conclusion
