Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Protokół ten określa generację myszy z ludzkim układem odpornościowym lub HIS do przedklinicznych badań immunoonkologicznych. Modele raka myszy mają ograniczoną różnorodność i słabo przekładają się na praktykę kliniczną. Technika ta służy jako model przedkliniczny dla badań immunoterapii poprzez ocenę leczenia nowotworów u ludzi u myszy z ludzkim układem odpornościowym.

Humanizowany model myszy może być wykorzystany do badania wielu aspektów ludzkiej immunologii, w tym odpowiedzi na wiele infekcji lub nowotworów ludzkiego układu odpornościowego. Uzyskanie wiarygodnego i solidnego źródła krwi pępowinowej i utrzymanie zdrowia kolonii myszy z niedoborem odporności może być wyzwaniem. Niezbędna jest wiedza specjalistyczna w zakresie cytometrii przepływowej i analizy immunologicznej.

Procedurę zademonstruje Kristina Larsen, specjalistka ds. usług badawczych z mojego laboratorium. Na początek ponownie zawieś CD34-dodatni osad komórkowy wyizolowany z krwi pępowinowej w 300 mikrolitrach bufora magnetycznego separatora komórek na jeden razy 10 do ósmych komórek. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FCR na jeden razy 10 do ósmych komórek, a następnie 100 mikrolitrów CD34-dodatnich kulek magnetycznych na jeden razy 10 do ósmych komórek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie dodaj pięć mililitrów bufora separatora magnetycznego na jeden raz 10 do ósmych komórek i wiruj z prędkością 360 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Powtórzyć etap płukania i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach na 100 milionów komórek bufora magnetycznego separatora komórek w 15-mililitrowej stożkowej probówce oznaczonej jako niefrakcjonowana. Oznacz dwie kolejne 15-mililitrowe probówki CD34-ujemne i CD34-dodatnie Umieść trzy probówki na stojaku chłodzącym.

Oddziel komórki za pomocą dwukolumnowego programu selekcji pozytywnej na automatycznym magnetycznym separatorze komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie, w celu ekspansji i zamrożenia ludzkich komórek macierzystych CD34-dodatnich, przygotuj krew pępowinową lub pożywkę CB, jak opisano w manuskrypcie, i przepuść przez filtr 0,22 mikrona. Ponownie zawiesić komórki CD34-dodatnie w temperaturze 100 000 na mililitr pożywki CB i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W trzecim dniu dodać do kolby równą objętość pożywki CB bez cytokin. Piątego dnia zbierz rozszerzone komórki CD34-dodatnie. Odpipetować zawiesinę komórek w górę iw dół i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Dodać tyle podłoża CB, aby pokryć dno kolby. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać całe dno kolby. Zbierz wszystkie podłoża do tej samej 50-mililitrowej probówki i odwiruj.

Ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach pożywki CB i odwirować. Zassać pożywkę do osadu i ponownie zawiesić osad w podłożu zamrażającym. Następnie rozpocznij przygotowanie komórek CD34-dodatnich trzy godziny po napromieniowaniu szczeniąt.

Podgrzej 10 mililitrów pożywki CB w 50-mililitrowej tubce. Pobrać jedną fiolkę z ekspandowanymi i zamrożonymi komórkami CD34-dodatnimi in vitro na każde cztery do sześciu szczeniąt do wstrzyknięcia. Szybko rozmrozić w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza, aż będzie widoczna tylko niewielka ilość lodu, a następnie dodaj komórki do podgrzanej pożywki CB.

Użyj jednego mililitra pożywki do przepłukania każdej fiolki i wiruj komórki w temperaturze 360 g przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać pożywkę. Ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki CB i policzyć komórki.

Ponownie odwirować komórki, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach sterylnego PBS na n plus jedno młode do wstrzyknięcia, co daje 250 000 do 450 000 komórek CD34-dodatnich na mysz. W celu izolacji PBMC od krwi myszy wymieszaj heparynę krwi, delikatnie pipetując w górę iw dół, a następnie powoli nakładaj na 500 mikrolitrów gradientu gęstości 1,077 grama na mililitr, uważając, aby nie zakłócić interfejsu. Odwirować probówkę o masie 1,220 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerw.

Usuń jak najwięcej komórek z kożucha za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i dodaj do nowej 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 750 mikrolitrów pożywki do pożywki. Wirować przy 360 g przez 11 minut. Zassać pożywkę do 50 mikrolitrów i ponownie zawiesić granulat w 750 mikrolitrach pożywki do zbioru.

Uzyskać dane dla 100 mikrolitrów każdej próbki na cytometrze przepływowym. Następnie zaimportuj plik fcs do oprogramowania do edycji danych przepływu i zastosuj bramkę wielokątną do wykresu FSC-A i SSC-A. Zmień osie na FSC-A lub FSC-H i zabramuj komórki na przekątnej liniowej, z wyłączeniem dubletów wystających z linii.

Zaznacz te komórki i zmień osie na hCD45 i mCD45. Zastosuj bramkę wielokątną do populacji hCD45-dodatniej i zastosuj nazwę człowiek. Zastosuj bramkę wielokątną do populacji mCD45-dodatniej i zastosuj nazwę mysz.

Utwórz statystykę zliczania dla populacji ludzi i myszy. Następnie wybierz populację ludzką i zmień osie na CD19 i CD3. Zastosuj bramkę wielokątną do komórek CD19-dodatnich i nazwij je komórkami B.

Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD3-dodatniej i nazwij ją limfocytami T. Następnie zastosuj bramkę wielokątną do populacji podwójnie ujemnej i nadaj jej nazwę non-TB. Wybierz populację limfocytów T i zmień osie na CD4 i CD3.

Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD4-dodatniej i nazwij ją CD4-dodatnią. Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD4-ujemnej i nadaj jej nazwę CD8. Wybierz populację inną niż gruźlica i zmień osie na CD56 i szpikową.

Zastosuj bramkę wielokątną do całkowitej populacji CD56-dodatniej i nazwij ją komórkami NK. Następnie zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD56-ujemnej i mieloidalnej i nazwij ją mieloidalną. Utwórz tabelę ze statystykami procentowymi i liczbowymi wszystkich populacji, a następnie wyeksportuj ją do arkusza kalkulacyjnego.

Oblicz procentowy chimeryzm hCD45 za pomocą wskazanego wzoru. Po wyhodowaniu komórek nowotworowych u myszy i podaniu leczenia farmakologicznego, należy pobrać tkanki. Umieść mysz na piankowej desce do wycinki z kołkami, aby utrzymać ją na miejscu, a ręce i nogi wyprostować pod kątem 45 stopni.

Wykonaj nacięcie na środku tułowia, zaczynając w pobliżu miednicy i rozciągając się do podbródka. Pociągnij skórę do krawędzi i przytrzymaj ją na miejscu za pomocą szpilek. Usuń węzły chłonne za pomocą cienkich kleszczy w kolejności pachowej, szyjnej, krezkowej, pachwinowej i rozworu przełykowego.

Umieść węzły chłonne po jednej stronie szkiełka z matowego szkła na szalce Petriego w ośmiu mililitrach pożywki do zbioru. Trzymając szkiełka pod prostopadłymi kątami z matowymi krawędziami do wewnątrz, delikatnie dociśnij tkanki, aż zawartość komórkowa zostanie uwolniona. Przepłucz szkiełko kilka razy, rozsuwając je i złączając razem, aby uwolnić maksymalną liczbę komórek.

Zbierz komórki za pomocą pięciocalowej szklanej pipety i przefiltruj je przez dziewięciocalową pipetę z bawełnianą zatyczką do oznaczonej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie wydobądź guz z otwartego boku, przytrzymując guz kleszczami, jednocześnie powoli tnąc brzegi guza nożyczkami preparacyjnymi. Zważ guz i usuń 1/4 guza w celu przetwarzania RNA i immunohistochemii.

Umieść pozostałe 3/4 guza w sześciocentymetrowym naczyniu i zmiel go na milimetrowe kawałki za pomocą ostrza skalpela. Przenieś kawałki guza do rurki dysocjacyjnej. Następnie opłucz naczynie niekompletnym podłożem TIL i dodaj je do probówki.

Dodaj preparat kolagenazy i dysocjuj tkankę za pomocą dysocjacji mechanicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny. Przełóż zawiesinę przez filtr 100 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i przepłucz filtr 10 mililitrami kompletnego podłoża TIL. Odwirować i ponownie zawiesić osad w wystarczającej ilości podłoża do zbioru z DNazą, aby zawiesina komórek mogła łatwo przejść przez końcówkę pipety P1000 i zarejestrować objętość do dalszej analizy.

W PDX CRC 307P leczenie skojarzone spowolniło wzrost guza, co określono na podstawie objętości wzrostu guza w czasie, masy guza i specyficznego tempa wzrostu. PDX CRC 307M testowany na innej kohorcie myszy był mniej dotknięty tym samym leczeniem skojarzonym u myszy HIS BRGS. Opierając się na ogólnym chimeryzmie ludzkim hCD45-dodatnim i ludzkim hCD3-dodatnim komórek T we krwi przed implantacją guza, oba parametry wzrosły w obwodowym układzie odpornościowym i TIL w połączeniu z leczonymi myszami z CRC 307P, ale nie w modelu CRC 307M.

Badanie ludzkich limfocytów T ujawniło więcej aktywowanych limfocytów T w guzach CRC 307P, ale nie limfę od myszy leczonych skojarzono. Ponadto było więcej komórek T CD8-dodatnich pamięci efektorowej i mniej limfocytów T TIM-3-dodatnich w skojarzonych guzach CRC 307P. Natomiast w modelu CRC 307M różnica ta nie została zauważona.

Ponadto nie zaobserwowano zmian w częstości występowania populacji cytotoksycznych komórek T wśród myszy leczonych skojarzonie, chociaż wyższe cytotoksyczne limfocyty T obserwowano u myszy nieleczonych. Leczenie skojarzone nie wpłynęło na częstość występowania limfocytów Treg ani w narządach limfatycznych CRC 307P, ani w guzach, chociaż dane dotyczące CRC 307M wykazały tendencję do zmniejszania się limfocytów Treg. Zmiany immunologiczne w komórkach nowotworowych zostały podwyższone za pomocą cytometrii przepływowej.

Zwiększoną ekspresję MHC klasy I i klasy II zaobserwowano na komórkach nowotworowych CRC 307P wyciętych z myszy HIS BRGS leczonych skojarzonie. W modelu CRC 307M to samo leczenie farmakologiczne indukowało ekspresję HLA klasy II na komórkach nowotworowych. Podobnie, leczenie skojarzone spowodowało zwiększoną ekspresję PD-L1 na komórkach nowotworowych CRC 307P z dodatnim wynikiem EpCAM.

Na koniec zbadano korelacje odpowiedzi immunologicznej ze wzrostem guza. Zwiększona liczba limfocytów T CD4-dodatnich wykazała istotną korelację z mniejszym wzrostem guza, a dokładniej z HLA-DR-dodatnimi aktywowanymi limfocytami T w skojarzonych myszach HIS. Sterylna technika podczas izolowania komórek CD34-dodatnich, ponieważ myszy mają skrajny niedobór odporności.

Wynikający z tego chimeryzm jest zmienny w obrębie dawców krwi pępowinowej i między nimi, a limfocyty T mają największą zmienność. Można wykonywać nieograniczone kombinacje immunoterapii, a także badania kinetyczne mechanistyczne i dawkowanie leków, na przykład delecję limfocytów T CD8 w celu potwierdzenia ich roli. Co ważne, można również badać toksyczność związaną z lekami.

W ramach projektu stworzono bardziej odpowiedni i dostępny model przedkliniczny do testowania immunoterapii stosowanych u ludzi w celu ich zastosowania w praktyce klinicznej. Obecnie prowadzonych jest kilka badań klinicznych opartych na tych danych.