Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Mówiąc o znaczeniu, generowanie komórek NK z rozszerzalnego źródła ma kluczowe znaczenie dla zastosowań takich jak immunoterapia nowotworów. Zaletą tej technologii jest to, że zamiast zwykłych komórek IP można stosować komórki macierzyste o zwiększonym potencjale i większej zdolności różnicowania. W celu wstępnego różnicowania hEPSC należy usunąć pożywkę hEPSC, w której utrzymywane były komórki, i dodać jeden mililitr pożywki DFK.

Inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby sprawdzić tworzenie się ciał zarodkowych, po usunięciu zużytej pożywki DFK, umyj komórki raz jednym mililitrem PBS. Dodaj 500 mikrolitrów 0,05% trypsyny i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy do siedmiu minut, w zależności od morfologii.

Po usunięciu trypsyny i dwóch mililitrach pożywki DFK do zebrania komórek. Wirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu dodać jeden mililitr pożywki DFK i jeden mikrolitr Y-27632 i ponownie zawiesić komórki przez trześnięcie.

Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek pożywką DFK i Y-27632, aby uzyskać 4 000 komórek na 25 mikrolitrów pożywki. Umieść od 30 do 40 kropli zawiesiny komórek na nasadce 10-centymetrowej szalki Petriego i wlej trochę PBS do dolnej szalki, aby zapobiec parowaniu kropel. Delikatnie odwróć nakrętkę, aby przykryć naczynie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni.

W celu zebrania ciał zarodków z kropelki, za pomocą jednomililitrowej pipety zawierającej PBS, należy wpompować niewielką ilość PBS do kropelki i odessać pożywkę, w tym ciała zarodków. Następnie przenieś te ciała embrionalne do 15-mililitrowej probówki i wiruj je w temperaturze 100 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu dodać jeden mililitr pożywki A. Przenieść zebrane ciała zarodków na nieprzylegającą 24-dołkową płytkę i uznać to za dzień zerowy.

Aby wykonać wzór mezodermy ciał zarodkowych, inkubuj płytkę przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Drugiego dnia zastąp 500 mikrolitrów zużytego podłoża A świeżą pożywką A o tej samej objętości. Aby wykonać specyfikację hematośródbłonka ciała zarodka, usuń 700 mikrolitrów pożywki A ze studzienki i dodaj taką samą objętość pożywki B.Kultura przez siedem dni, zmieniając półpożywkę co dwa dni.

Aby przenieść wzorzyste ciała zarodkowe na granicę powietrzno-cieczową, lekko przechyl płytkę, tak aby ciała zarodków agregowały się na dole, a następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra usuń jak najwięcej pożywki B. Teraz podnieś ciała zarodków za pomocą pipety, odsysając pozostałą pożywkę i przenieś je do trans-dołka na 24-dołkowej płytce, Aby wykonać ekspansję progenitorów limfoidalnych, dodaj 500 mikrolitrów pożywki NK-1 do dolnej komory trans-dołka, hoduj przez 14 dni i wykonuj zmianę pożywki co drugi dzień. Aby pokryć płytkę, rozcieńczyć materiał powlekający w PBS, dodać jeden mililitr rozcieńczonego roztworu powlekającego do każdego dołka 12-dołkowej płytki i przykryć otwór płytki folią do owijania.

Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do trans-studzienki i powoli pipetuj w górę iw dół około pięć do sześciu razy, aby zebrać komórki uwolnione z organoidów. Przenieś zawiesinę zebranych komórek do dwumililitrowej probówki i wiruj komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki NK-1. Usunąć cały roztwór powlekający ze studzienki i umyć każdą studzienkę 12-dołkowej płytki dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie podziel zebrane komórki w stosunku 1:2 i przenieś zawiesinę komórek na powlekaną płytkę 12-dołkową.

Dodaj jeden mililitr pożywki NK-1, aby każda studzienka miała 1,5 mililitra pożywki. Aby zmienić podłoże, pozwól komórkom opaść na dno na jedną do dwóch minut. Następnie ostrożnie odessać 750 mikrolitrów pożywki i odwirować, jak pokazano wcześniej.

Po odrzuceniu supernatantu, otrzymany osad należy ponownie zawiesić w 750 mikrolitrach pożywki NK-1 przez pipetowanie pięć do sześciu razy i przenieść do pierwotnej studzienki. W niniejszym badaniu przeanalizowano produkty pochodzące z hEPSC w punkcie końcowym. Około 15% komórek oddzielonych od systemu hodowli 3D z dwóch partii indukowanych w różnych punktach czasowych było CD3-ujemnych, CD56-dodatnich, a 16% komórek było CD45-dodatnich, CD-56-dodatnich, co jest zgodne z odsetkiem komórek CD3-ujemnych, CD56-dodatnich obserwowanych we wcześniejszych badaniach.

Odsetek komórek CD3-ujemnych, CD56-dodatnich w komórkach pobranych z systemu hodowli 2D wahał się od 30 do 6%Produkty pochodzące z hEPSC podczas hodowli w dniu 18 z systemu 2D wykazały ekspresję zarówno ektopowego CD56, jak i CD107a w 12% komórek po dwóch godzinach stymulacji przeciwciałami, a około 28% pobranych komórek było CD94-dodatnich, CD159a-dodatni. Produkty różnicowania in vitro przebadano pod kątem cytotoksyczności wobec ludzkich komórek erytroreukemii K562. Podczas kohodowli z celami nowotworowymi przez trzy godziny, zróżnicowane produkty wykazują łagodną cytotoksyczność w porównaniu z komórkami NK92mi z niezależnej od interleukiny 2 z trwałej linii komórkowej

Zgodnie z tą metodą można generować komórki, takie jak limfocyty T, limfocyty B i erytrocyty.