Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej
October 6th, 2022
Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.
Nasz protokół zapewnia delikatną metodę inokulacji i ekstrakcji roślin, która umożliwia odtworzenie populacji bakterii wyhodowanych w apoplastach liściowych, odpowiednich do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach, takiej jak cytometria przepływowa. Metoda ta pozwala na ekstrakcję znacznej ilości bakterii z apoplastu bez znacznego zanieczyszczenia próbek szczątkami komórkowymi roślin. Ta zoptymalizowana metoda odzyskiwania bakterii apoplastycznych może być stosowana bezpośrednio lub z niewielkimi modyfikacjami do wielu systemów bakteryjnych roślin zawierających bakterie chorobotwórcze roślin lub pożyteczne bakterie endocytarne.
Procedurę zademonstruje Nieves Lopez-Pagan, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek napełnij doniczkę o średnicy 10 centymetrów wcześniej podlaną mieszanką substratów roślinnych wermikulitu w proporcji 1:3. Przykryj doniczkę perforowaną metalową siatką i dopasuj metalową siatkę do mokrej gleby za pomocą gumki.
Następnie zasiej nasiona Arabidopsis w otworach metalowej siatki za pomocą mokrej wykałaczki. Umieść trzy do czterech nasion w odległych miejscach w doniczce. Przykryj doniczkę plastikową kopułą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną i inkubuj do rozwarstwienia w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny.
Przenieś doniczkę do komory wzrostu roślin w warunkach dnia krótkiego. Aby odsłonić garnek, zdejmij plastikową kopułę. Gdy nasiona wykiełkują, użyj pęsety, aby usunąć większość sadzonek, trzymając po jednej sadzonce w każdej z pozycji doniczki.
Następnie przygotuj rośliny fasoli Phaseolus vulgaris, przykrywając dno szalki Petriego mokrym kawałkiem ręcznika papierowego i umieszczając na niej nasiona fasoli. Uszczelnij szalkę Petriego taśmą chirurgiczną i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Przenieś kiełkujące nasiona do doniczki o średnicy 10 centymetrów wypełnionej mokrą mieszanką substratów roślinnych z wermikulitu w proporcji 1:3 i inkubuj w komorze wzrostu roślin w warunkach długiego dnia.
Umieść zapas glicerolu w interesującym nas szczepie Pseudomonas syringae z minus 80 stopni Celsjusza na płytkę LB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Zeskrob biomasę bakteryjną i zawieś ją ponownie w pięciu mililitrach 10-milimolowego chlorku magnezu.
Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach i dostosuj ją do 0,1, dodając 10-milimolowy chlorek magnezu. Wykonaj seryjne rozcieńczenia w 10-milimolowym chlorku magnezu, aby uzyskać końcowe stężenie inokulum pięć razy 10 do piątej CFU na mililitr. Następnie przygotuj 200 mililitrów inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 mililitrów dla roślin fasoli.
Przed inokulacją dodać środek powierzchniowo czynny Silwet L-77 do końcowego stężenia 0,02% w przypadku inokulacji fasoli i 0,01% w przypadku Arabidopsis. W celu infiltracji Arabidopsis umieść dwa drewniane patyczki tworzące X nad doniczką i umieść doniczkę skierowaną w dół na szalce Petriego o średnicy 14 centymetrów zawierającej 200 mililitrów inokulum. W przypadku inokulacji liści fasoli włóż rośliny i roztwór inokulum do komory próżniowej i wprowadź liść do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej zawierającej inokulum.
Daj impuls 500 milibarów przez 30 sekund, aby przeniknąć do liści. Odcedź nadmiar roztworu inokulum za pomocą kartki papieru i włóż plany z powrotem do odpowiedniej komory wzrostu. Cztery dni po zaszczepieniu odetnij nadziemną część rośliny Arabidopsis lub zaszczepiony liść z rośliny fasoli i umieść go w 20-mililitrowej strzykawce bez igły.
W przypadku liści fasoli zwiń liść na siebie, pozostawiając twarz odbytową na zewnątrz. Dodaj tyle wody destylowanej, aby przykryć tkankę. Następnie włożyć tłok przytrzymujący strzykawkę w pozycji pionowej i usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki, delikatnie stukając w cylinder, aż całe powietrze znajdzie się w pobliżu końcówki, a po usunięciu powietrza przykryć końcówkę cylindra strzykawki folią parafinową.
Teraz ostrożnie naciśnij tłok, aby wytworzyć nadciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza. Następnie pociągnij tłok, aby wytworzyć podciśnienie. Usunąć warstwę parafinową i tłok i zebrać płyn zawierający bakterie wyekstrahowane przez apoplast
.Do analizy pojedynczej komórki przygotuj 1,5% roztwór agarozy w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj wystarczającą objętość, aby wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i umieść kolejny szkiełko na wierzchu. Pozwól im jeździć przez 15 minut i ostrożnie zdejmij suwak umieszczony na górze.
Za pomocą ostrza pokrój podkładkę agarozową na kawałki o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów przed użyciem. Równolegle odwirować jeden milimetr bakterii wyekstrahowanych apoplastami. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody w celu zagęszczenia komórek.
Umieść dwumikrolitrową kroplę skoncentrowanych komórek na szkiełku nakrywkowym o średnicy 0,17 milimetra i przykryj kroplę kawałkiem wacika agarozy. Wizualizacja preparatu bakteryjnego pod mikroskopem konfokalnym w celu identyfikacji bakterii zielonej fluorescencji za pomocą specjalnych laserów. Zidentyfikuj wszystkie bakterie za pomocą jasnego pola i połącz oba pola.
Aby przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej, należy pobrać podwielokrotność zawiesin bakterii ekstrahowanych apoplastami. Analizuj za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj 100 000 zdarzeń. Ekspresja hrpL GFP jest monitorowana przez fluorescencję GFP.
Wykresy z wykresem kropkowym pokazują rozkład intensywności fluorescencji GFP w stosunku do wielkości komórek w populacji, podczas gdy histogramy pokazują intensywność fluorescencji GFP w funkcji liczby komórek. Procenty hrpL ON były wyższe niż odpowiadające im wartości procentowe hrpL OFF. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują niejednorodne poziomy GFP związane z ekspresją hrpL.
Obserwuje się bakterie wykazujące niską lub żadną fluorescencję GFP. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zachować ostrożność podczas etapów ekstrakcji bakterii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki roślinnej, a tym samym ograniczyć zanieczyszczenie zawartością komórkową roślin. Uzyskane próbki bakterii można wykorzystać do innych celów, w których zmniejszenie zanieczyszczenia roślin jest korzystne, takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych w celu późniejszej analizy genomowej lub transkryptomicznej bakterii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach populacji Pseudomonas syringae wewnątrz apoplastu roślinnego. Procedura optymalizuje odzyskiwanie populacji bakteryjnych, minimalizując jednocześnie zanieczyszczenie resztkami roślinnymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Interakcje roślina-patogen
- Ekologia mikroorganizmów w systemach roślinnych
- Techniki analizy w pojedynczych komórkach
Tło
- Znaczenie badania ekspresji genów bakteryjnych in planta.
- Wyzwania związane z izolacją bakterii z tkanek roślinnych.
- Potrzeba bezpiecznych metod ekstrakcji wolnych od zanieczyszczeń.
Stosowane metody
- Ekstrakcja bakterii z apoplastu przy użyciu metody opartej na strzykawce.
- Zastosowanie Pseudomonas syringae jako organizmu modelowego.
- Cytometria przepływowa do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach.
Główne wyniki
- Udane odzyskanie bakterii nadających się do analizy w pojedynczych komórkach.
- Identyfikacja poziomów ekspresji genów za pomocą fluorescencji GFP.
- Demonstracja zastosowania metody do innych układów roślinno-bakteryjnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowaną metodę badania ekspresji genów bakteryjnych u roślin.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia interakcji roślinno-bakteryjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Pseudomonas syringae gene expression within plant tissue enables precise interrogation of bacterial phenotypic heterogeneity during host colonization. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for plant-pathogen interaction studies, informing early discovery and translational research pipelines. The method's optimized extraction and analysis workflow enhances predictive confidence in functional genomics and microbial ecology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of bacterial gene expression heterogeneity in planta.
- Supports functional validation of virulence factors and stress response pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing subpopulation behaviors under host-induced stress.
- Improves predictive confidence for target prioritization in plant-microbe interaction studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated bacterial preparations suitable for quantitative flow cytometry and microscopy assays.
- Enables reproducible measurement of gene expression at the single-cell level.
- Supports assay standardization by minimizing plant-derived contamination in samples.
- Prepares biological systems for downstream screening of genetic or chemical perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling in situ analysis of bacterial gene expression.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in plant-microbe systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative single-cell data.
- Provides mechanistic insights relevant to disease-relevant plant models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation in plant-microbe research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of bacterial gene expression and pathway activity in host tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables robust statistical analysis of gene expression distributions and subpopulation dynamics.
- Translational Research: Connects single-cell bacterial phenotypes to plant disease outcomes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse plant-bacterial systems with minimal adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes extraction and analysis, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-microbe research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant handling, bacterial culture, and single-cell analysis techniques.
- Needs access to confocal microscopy and flow cytometry instrumentation for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of extraction and analysis protocols to ensure reproducibility.
- Adaptable to various plant and bacterial systems with empirical optimization of extraction steps.
- Sample integrity depends on gentle handling to minimize plant debris contamination, as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:54
Plant Preparation
2:14
Inoculation of Arabidopsis and Bean Plants
3:53
Extraction of Bacteria from the Apoplast
4:55
Single-Cell Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria
6:14
Results: Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria Obtained from Arabidopsis or Bean Leaves After Bacterial Inoculation
6:57
Conclusion
