Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Nasz protokół zapewnia delikatną metodę inokulacji i ekstrakcji roślin, która umożliwia odtworzenie populacji bakterii wyhodowanych w apoplastach liściowych, odpowiednich do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach, takiej jak cytometria przepływowa. Metoda ta pozwala na ekstrakcję znacznej ilości bakterii z apoplastu bez znacznego zanieczyszczenia próbek szczątkami komórkowymi roślin. Ta zoptymalizowana metoda odzyskiwania bakterii apoplastycznych może być stosowana bezpośrednio lub z niewielkimi modyfikacjami do wielu systemów bakteryjnych roślin zawierających bakterie chorobotwórcze roślin lub pożyteczne bakterie endocytarne.

Procedurę zademonstruje Nieves Lopez-Pagan, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek napełnij doniczkę o średnicy 10 centymetrów wcześniej podlaną mieszanką substratów roślinnych wermikulitu w proporcji 1:3. Przykryj doniczkę perforowaną metalową siatką i dopasuj metalową siatkę do mokrej gleby za pomocą gumki.

Następnie zasiej nasiona Arabidopsis w otworach metalowej siatki za pomocą mokrej wykałaczki. Umieść trzy do czterech nasion w odległych miejscach w doniczce. Przykryj doniczkę plastikową kopułą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną i inkubuj do rozwarstwienia w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny.

Przenieś doniczkę do komory wzrostu roślin w warunkach dnia krótkiego. Aby odsłonić garnek, zdejmij plastikową kopułę. Gdy nasiona wykiełkują, użyj pęsety, aby usunąć większość sadzonek, trzymając po jednej sadzonce w każdej z pozycji doniczki.

Następnie przygotuj rośliny fasoli Phaseolus vulgaris, przykrywając dno szalki Petriego mokrym kawałkiem ręcznika papierowego i umieszczając na niej nasiona fasoli. Uszczelnij szalkę Petriego taśmą chirurgiczną i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Przenieś kiełkujące nasiona do doniczki o średnicy 10 centymetrów wypełnionej mokrą mieszanką substratów roślinnych z wermikulitu w proporcji 1:3 i inkubuj w komorze wzrostu roślin w warunkach długiego dnia.

Umieść zapas glicerolu w interesującym nas szczepie Pseudomonas syringae z minus 80 stopni Celsjusza na płytkę LB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Zeskrob biomasę bakteryjną i zawieś ją ponownie w pięciu mililitrach 10-milimolowego chlorku magnezu.

Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach i dostosuj ją do 0,1, dodając 10-milimolowy chlorek magnezu. Wykonaj seryjne rozcieńczenia w 10-milimolowym chlorku magnezu, aby uzyskać końcowe stężenie inokulum pięć razy 10 do piątej CFU na mililitr. Następnie przygotuj 200 mililitrów inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 mililitrów dla roślin fasoli.

Przed inokulacją dodać środek powierzchniowo czynny Silwet L-77 do końcowego stężenia 0,02% w przypadku inokulacji fasoli i 0,01% w przypadku Arabidopsis. W celu infiltracji Arabidopsis umieść dwa drewniane patyczki tworzące X nad doniczką i umieść doniczkę skierowaną w dół na szalce Petriego o średnicy 14 centymetrów zawierającej 200 mililitrów inokulum. W przypadku inokulacji liści fasoli włóż rośliny i roztwór inokulum do komory próżniowej i wprowadź liść do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej zawierającej inokulum.

Daj impuls 500 milibarów przez 30 sekund, aby przeniknąć do liści. Odcedź nadmiar roztworu inokulum za pomocą kartki papieru i włóż plany z powrotem do odpowiedniej komory wzrostu. Cztery dni po zaszczepieniu odetnij nadziemną część rośliny Arabidopsis lub zaszczepiony liść z rośliny fasoli i umieść go w 20-mililitrowej strzykawce bez igły.

W przypadku liści fasoli zwiń liść na siebie, pozostawiając twarz odbytową na zewnątrz. Dodaj tyle wody destylowanej, aby przykryć tkankę. Następnie włożyć tłok przytrzymujący strzykawkę w pozycji pionowej i usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki, delikatnie stukając w cylinder, aż całe powietrze znajdzie się w pobliżu końcówki, a po usunięciu powietrza przykryć końcówkę cylindra strzykawki folią parafinową.

Teraz ostrożnie naciśnij tłok, aby wytworzyć nadciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza. Następnie pociągnij tłok, aby wytworzyć podciśnienie. Usunąć warstwę parafinową i tłok i zebrać płyn zawierający bakterie wyekstrahowane przez apoplast

Do analizy pojedynczej komórki przygotuj 1,5% roztwór agarozy w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj wystarczającą objętość, aby wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i umieść kolejny szkiełko na wierzchu. Pozwól im jeździć przez 15 minut i ostrożnie zdejmij suwak umieszczony na górze.

Za pomocą ostrza pokrój podkładkę agarozową na kawałki o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów przed użyciem. Równolegle odwirować jeden milimetr bakterii wyekstrahowanych apoplastami. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody w celu zagęszczenia komórek.

Umieść dwumikrolitrową kroplę skoncentrowanych komórek na szkiełku nakrywkowym o średnicy 0,17 milimetra i przykryj kroplę kawałkiem wacika agarozy. Wizualizacja preparatu bakteryjnego pod mikroskopem konfokalnym w celu identyfikacji bakterii zielonej fluorescencji za pomocą specjalnych laserów. Zidentyfikuj wszystkie bakterie za pomocą jasnego pola i połącz oba pola.

Aby przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej, należy pobrać podwielokrotność zawiesin bakterii ekstrahowanych apoplastami. Analizuj za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj 100 000 zdarzeń. Ekspresja hrpL GFP jest monitorowana przez fluorescencję GFP.

Wykresy z wykresem kropkowym pokazują rozkład intensywności fluorescencji GFP w stosunku do wielkości komórek w populacji, podczas gdy histogramy pokazują intensywność fluorescencji GFP w funkcji liczby komórek. Procenty hrpL ON były wyższe niż odpowiadające im wartości procentowe hrpL OFF. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują niejednorodne poziomy GFP związane z ekspresją hrpL.

Obserwuje się bakterie wykazujące niską lub żadną fluorescencję GFP. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zachować ostrożność podczas etapów ekstrakcji bakterii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki roślinnej, a tym samym ograniczyć zanieczyszczenie zawartością komórkową roślin. Uzyskane próbki bakterii można wykorzystać do innych celów, w których zmniejszenie zanieczyszczenia roślin jest korzystne, takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych w celu późniejszej analizy genomowej lub transkryptomicznej bakterii.