Name: Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę jednokomórkowej analizy ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej. Technika ta umożliwia odzyskanie bakterii z apoplastu z minimalnym zanieczyszczeniem pozostałościami roślinnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Project Grant RTI2018-095069-B-I00 finansowany przez MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ oraz przez "ERDP A way of making Europe". J.S.R. został sfinansowany przez Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. został sfinansowany z grantu projektu P18-RT-2398 od Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Przygotowanie roślin
<ol>
	<li>Przygotuj rośliny Arabidopsis Col-0, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Napełnij doniczkę o średnicy 10 cm mieszanką substratów wermikulitowo-roślinnych w proporcji 1:3 (patrz Tabela materiałów), uprzednio podlaną i przykryj doniczkę metalową siatką o wymiarach 15 cm x 15 cm z otworami 1,6 mm x 1,6 mm. Dopasuj metalową siatkę do mokrej gleby za pomocą gumki recepturki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Za pomocą mokrej wykałaczki zasiej nasiona Arabidopsis w otworach metalowej siatki. Umieść trzy do czterech nasion w odległych miejscach w doniczce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).</li>
		<li>Przykryj doniczki plastikową kopułą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną i inkubuj je przez 72 godziny w temperaturze 4 °C w celu rozwarstwienia. 
		UWAGA: Stratyfikacja (inkubacja przy wysokiej wilgotności i niskiej temperaturze, zgodnie z opisem) poprawia szybkość kiełkowania i synchronizację nasion.</li>
		<li>Przenieść doniczki do komory wzrostu roślin w warunkach dnia krótkiego (8 h światła/16 h ciemności w temperaturze 21 °C, natężenie światła: 100 μmol·m−2·s−1, wilgotność względna: 70%).</li>
		<li>Po wykiełkowaniu nasion (8-10 dni) użyj pęsety, aby usunąć większość sadzonek, trzymając po jednej sadzonce w każdej z pozycji doniczki (sześć sadzonek/doniczkę) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Zdejmij plastikową kopułę, aby odsłonić garnki. 
		UWAGA: Rośliny będą gotowe do użycia 4-5 tygodni po wykiełkowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj rośliny fasoli Phaseolus vulgaris (odmiana Canadian Wonder).
	<ol>
		<li>Przykryj spód szalki Petriego mokrym kawałkiem ręcznika i umieść na nim nasiona fasoli. Uszczelnij szalkę Petriego taśmą chirurgiczną i inkubuj w temperaturze 28 °C przez 3-4 dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Przenieś kiełkujące nasiona do doniczki o średnicy 10 cm wypełnionej mokrą mieszanką substratu wermikulitowego i roślinnego w stosunku 1:3.</li>
		<li>Inkubować w komorze wzrostu roślin w warunkach długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności w temperaturze 23 °C, natężenie światła: 100 μmol·m−2·s−1, wilgotność względna: 70%). 
		UWAGA: Rośliny będą gotowe do użycia 10 dni po wykiełkowaniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inokulacja rzodkiewnika i roślin fasoli
UWAGA: W tym badaniu użyto szczepów P. syringae pv. tomato DC3000 i P. syringae pv. phaseolicola 1448A.
<ol>
	<li>Przygotować inokulum P. syringae.
	<ol>
		<li>Szczep P. syringae będący przedmiotem zainteresowania należy rozsiać po wywarze glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l NaCl, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 16 g/l agaru bakteriologicznego, patrz tabela materiałów) uzupełniony odpowiednimi antybiotykami. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 40-48 h. 
		UWAGA: Stosowanie antybiotyków jest zalecane, jeśli badany szczep jest nosicielem plazmidu lub genu oporności genomowej. Zalecane stężenia antybiotyków dla P. syringae są następujące: kanamycyna (15 μg/ml), gentamycyna (10 μg/ml), ampicylina (300 μg/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zeskrobać biomasę bakteryjną i ponownie zawiesić w 5 ml 10 mM MgCl2. Zmierz OD600 i dostosuj do 0,1, dodając 10 mM MgCl2, 
		UWAGA: OD600 0,1 kultury P. syringae odpowiada 5 x 107 CFU·mL−1.</li>
		<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia do 10 mM MgCl2, aby osiągnąć końcowe stężenie inokulum 5 x 105 CFU·mL−1. Przygotuj 200 ml inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 ml dla roślin fasoli.</li>
		<li>Tuż przed inokulacją dodać środek powierzchniowo czynny Silwett L-77 (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 0,02% dla inokulacji fasoli i 0,01% dla Arabidopsis. Należy zauważyć, że Silwett jest nieco szkodliwy dla tkanki Arabidopsis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj infiltrację próżniową.
	<ol>
		<li>W celu infiltracji rzodkiewnika umieść dwa drewniane patyczki tworzące X nad doniczką (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1E) i umieść doniczkę skierowaną w dół na szalce Petriego o średnicy 14 cm zawierającej 200 ml inokulum (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1F).</li>
		<li>W przypadku inokulacji liści fasoli, wprowadź liść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej inokulum (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
		<li>Włóż rośliny zanurzone w roztworze inokulum do komory próżniowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) i daj impuls 500 mbar przez 30 s, aby naciekać liście. Powtórz impuls podciśnienia 2-3 razy, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H i <silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
		<li>Odcedź nadmiar roztworu inokulum za pomocą kawałka papieru i włóż rośliny z powrotem do odpowiedniej komory wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja bakterii z apoplastu
<ol>
	<li>Cztery dni po zaszczepieniu odetnij nadziemną część rośliny Arabidopsis lub zaszczepiony liść z rośliny fasoli i umieść go w strzykawce o pojemności 20 ml bez igły (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2G). W przypadku liści fasoli zwiń liść na siebie, pozostawiając aosijalną powierzchnię na zewnątrz, jak pokazano w Rysunek 2F.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość wody destylowanej, aby przykryć tkankę (zwykle 10-15 ml).</li>
	<li>Włożyć tłok i trzymając strzykawkę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną do góry, usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza wewnątrz strzykawki, delikatnie stukając w cylinder, aż całe powietrze znajdzie się w pobliżu końcówki. Następnie przesuń tłok, aby usunąć powietrze. Gdy wewnątrz strzykawki będzie jak najmniej powietrza, przykryj końcówkę cylindra strzykawki folią parafinową.</li>
	<li>Ostrożnie naciśnij tłok, aby wytworzyć nadciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I i <silna klasa="xfig">Rysunek 2H). Następnie pociągnij za tłok, aby wytworzyć podciśnienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J i <silna klasa="xfig">Rysunek 2I). Powtórz ten krok 3-5 razy.</li>
	<li>Usuń folię parafinową i tłok i zbierz płyn zawierający bakterie wyekstrahowane przez apoplast, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 2J.</li>
</ol>
4. Analiza jednokomórkowa bakterii wyekstrahowanych przez apoplasty
<ol>
	<li>Wizualizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1,5% roztwór agarozy w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj wystarczającą objętość, aby wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i umieść na nim kolejny szkiełko (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Pozostaw je do wyschnięcia na 15 minut i ostrożnie zdejmij szkiełko umieszczone na górze. Za pomocą ostrza pokrój wabikę agarozową na kawałki o wymiarach 5 mm x 5 mm tuż przed użyciem.</li>
		<li>Równolegle odwirować 1 ml bakterii wyekstrahowanych apoplastami w stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 20 μl wody w celu zagęszczenia komórek. Umieścić kroplę 2 μl skoncentrowanych komórek na szkiełku nakrywkowym o średnicy 0,17 mm i przykryć kroplę kawałkiem wacika agarozowego o wymiarach 5 mm x 5 mm, uzyskanym wcześniej w kroku 1, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		<li>Zobrazuj preparat bakteryjny pod mikroskopem konfokalnym (patrz Tabela materiałów). Do identyfikacji bakterii zielonofluorescencyjnych należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego o długości fali od 500 nm do 550 nm. Aby zidentyfikować wszystkie bakterie, użyj jasnego pola i połącz oba pola.</li>
		<li>Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą Fidżi (patrz tabela materiałów). Aby to zrobić, użyj wtyczki MicrobeJ, aby zidentyfikować kontur komórki bakteryjnej i zmierzyć intensywność fluorescencji w obrębie. 
		UWAGA: Do tej analizy zaleca się pozyskiwanie obrazu z izolowanych bakterii (nie zgrupowanych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Pobrać podwielokrotność zawiesin bakterii ekstrahowanych apoplastami do analizy za pomocą cytometru przepływowego. Zdobądź 100 000 wydarzeń.</li>
		<li>Aby odróżnić bakterie od szczątków roślinnych, przeanalizuj apoplast wyekstrahowany z niezaszczepionej rośliny i porównaj wykres punktowy pokazujący rozmiar komórki rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z wielkością komórki rozproszenia bocznego (SSC) z zawiesiną bakteryjną ekstrahowaną apoplastem. Aby zidentyfikować bakterie niefluorescencyjne, należy użyć apoplastów wyekstrahowanych z roślin zaszczepionych niefluorescencyjnymi bakteriami izogenicznymi i porównać ich emisje fluorescencyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
<li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors%3A+Beyond+suppression+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li>
<li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).</li>
<li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li>
<li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+PJ+%22Robust+Statistics%22">Robust Statistics</a>. , Wiley. New York, NY. (1981).</li>
<li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).</li>
<li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen%2C+ice+nucleus%2C+and+epiphyte%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li>
<li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae%3A+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
<li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda opisuje nieinwazyjną procedurę, która umożliwia infiltrację bakterii do tkanki liściowej rośliny, umożliwiając szybkie zaszczepienie dużych objętości przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozerwania tkanek. Jedną z cech kompleksu gatunkowego P. syringae jest zdolność do przetrwania i namnażania się wewnątrz rośliny apoplastowej i na powierzchni rośliny jako epifit14. W związku z tym nie można wykluczyć możliwości, że bakterie wyekstrahowane przy użyciu niniejszego ...

Bakterie chorobotwórcze wykazują różnice w różnych fenotypach, co prowadzi do powstawania subpopulacji w obrębie genetycznie identycznych populacji. Zjawisko to znane jest jako heterogeniczność fenotypowa i zostało zaproponowane jako strategia adaptacyjna podczas interakcji bakteria-gospodarz1. Ostatnie postępy w rozdzielczości optycznej mikroskopów konfokalnych, cytometrii przepływowej i mikrofluidyki, w połączeniu z białkami fluorescencyjnymi, sprzyjały analizom pojedynczych komórek populacji bakterii2.
Gram-ujemny Pseudomonas syringae jest archetypem bakterii chorobotwórczej dla roślin, zarówno ze względu na jego znaczenie akademickie, jak i ekonomiczne3. Cykl życiowy P. syringae jest związany z obiegiem wody4. P. syringae dostaje się do przestrzeni międzykomórkowych między komórkami mezofilu, apoplastem liści roślin, przez naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe lub rany5. Po dostaniu się do apoplastu P. syringae opiera się na systemie wydzielania typu III (T3SS) i efektorach translokowanych typu III (T3E) w celu tłumienia odporności roślin i manipulowania funkcjami komórkowymi roślin z korzyścią dla patogenu6. Ekspresja T3SS i T3E zależy od głównego regulatora HrpL, alternatywnego czynnika sigma, który wiąże się z motywami hrp-box w regionie promotorowym docelowych genów7. 
Poprzez generowanie zlokalizowanych chromosomów fuzji transkrypcyjnych z fluorescencyjnymi genami białkowymi poniżej interesującego genu, można monitorować ekspresję genów na podstawie poziomów fluorescencji emitowanych na poziomie pojedynczej komórki8. Za pomocą tej metody ustalono, że ekspresja hrpL jest niejednorodna zarówno w kulturach bakteryjnych wyhodowanych w laboratorium, jak i w populacjach bakterii odzyskanych z roślinnego apoplast8,9. Chociaż analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki jest zwykle wykonywana w kulturach bakteryjnych hodowanych w pożywkach laboratoryjnych, takie analizy można również przeprowadzić na populacjach bakterii rosnących w roślinie, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat tworzenia subpopulacji w kontekście naturalnym. Potencjalnym ograniczeniem dla analizy populacji bakterii wyekstrahowanych z rośliny jest to, że klasyczne metody inokulacji polegające na infiltracji strzykawki do apoplastu, a następnie ekstrakcji bakteryjnej przez macerację tkanki liścia, zazwyczaj generują dużą ilość resztek komórkowych roślin, które zakłócają dalszą analizę10. Większość szczątków komórkowych składa się z autofluorescencyjnych fragmentów chloroplastów, które nakładają się na fluorescencję GFP, co skutkuje mylącymi wynikami. 
Obecny protokół opisuje proces analizy niejednorodności ekspresji genów pojedynczej komórki w dwóch patosystemach modelowych: jednym utworzonym przez szczep pomidora P. syringae pv. DC3000 i Arabidopsis thaliana (Col-0), a drugim przez P. syringae pv. phaseolicola szczep 1448A i rośliny fasoli (Phaseolus vulgaris odmiana Canadian Wonder). Zaproponowano metodę inokulacji opartą na infiltracji próżniowej za pomocą komory próżniowej i pompy, co daje szybką i wolną od uszkodzeń metodę infiltracji całych liści. Ponadto, jako ulepszenie konwencjonalnych protokołów, stosuje się łagodniejszą metodę ekstrakcji populacji bakterii z apoplastu, która znacznie zmniejsza rozerwanie tkanek, opartą na ekstrakcji płynu apoplastycznego poprzez zastosowanie cykli dodatniego i ujemnego ciśnienia przy użyciu niewielkiej objętości w strzykawce.

<table><tbody><tr>Szkiełko <td></td><td></td><td>nakrywkowe 0,17 mm</td><td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Siatka metalowa 1,6 x 1,6 mm</td><td>Buzifu</td><td></td><td>Siatka z włókna szklanego</td></tr><tr><td>Doniczki</td><td></td><td></td> o średnicy 10 cm <td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Szalki</td><td></td><td></td> Petriego 140 mm <td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td></td><td></td> 20 ml <td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Stellaris</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSPrzedstaw analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Monosiarczan kanamycyny</td><td>Fitotechnologia</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Opakowania</td><td></td><td></td>z tworzywa</tr><tr><td>sztucznego Podłoże</td><td></td><td></td> roślinne <td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cromton Europe Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr> Brak specjalnych wymagań <tr><td>Komora próżniowa o średnicy 25 cm</td><td>Kartell</td><td>554</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>GAST</td><td>DOA-P504-BN</td><td></td></tr><tr><td>Wermikulit</td><td></td><td></td><td>Brak specjalnych wymagań</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednokomórkowa analiza ekspresji genów pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Mnóstwo chorobotwórczych mikroorganizmów nieustannie atakuje rośliny. Kompleks gatunkowy Pseudomonas syringae obejmuje Gram-ujemne bakterie chorobotwórcze roślin o szczególnym znaczeniu dla wielu żywicieli. P. syringae dostaje się do rośliny z powierzchni liścia i szybko namnaża się w apoplastach, tworząc mikrokolonie zajmujące przestrzeń międzykomórkową. Konstytutywna ekspresja białek fluorescencyjnych przez bakterie pozwala na wizualizację mikrokolonii i monitorowanie rozwoju infekcji na poziomie mikroskopowym. Ostatnie postępy w analizie pojedynczych komórek ujawniły dużą złożoność, jaką osiągają klonalne populacje bakterii izogenicznych. Ta złożoność, określana jako heterogeniczność fenotypowa, jest konsekwencją różnic między komórkami w ekspresji genów (niezwiązanych z różnicami genetycznymi) w społeczności bakteryjnej. Aby przeanalizować ekspresję poszczególnych loci na poziomie pojedynczej komórki, szeroko stosuje się fuzje transkrypcyjne z białkami fluorescencyjnymi. W warunkach stresowych, takich jak te występujące podczas kolonizacji apoplastu roślinnego, P. syringae różnicuje się w odrębne subpopulacje w oparciu o niejednorodną ekspresję kluczowych genów wirulencji (tj. systemu wydzielania Hrp typu III). Jednak analiza pojedynczych komórek dowolnej populacji P. syringae odzyskanej z tkanki roślinnej jest trudna ze względu na szczątki komórkowe uwalniane podczas mechanicznego zakłócenia nieodłącznie związanego z procesami inokulacji i ekstrakcji bakteryjnej. Niniejszy raport szczegółowo opisuje metodę opracowaną w celu monitorowania ekspresji genów P. syringae na poziomie pojedynczej komórki podczas kolonizacji rzodkiewnika i roślin fasoli. Opisano przygotowanie roślin i zawiesin bakteryjnych stosowanych do inokulacji przy użyciu komory próżniowej. Odzyskiwanie bakterii endofitycznych z zakażonych liści przez ekstrakcję płynu apoplastycznego jest również wyjaśnione tutaj. Zarówno metody inokulacji bakteryjnej, jak i ekstrakcji bakteryjnej są empirycznie zoptymalizowane w celu zminimalizowania uszkodzeń komórek roślinnych i bakteryjnych, w wyniku czego powstają preparaty bakteryjne optymalne do analizy mikroskopowej i cytometrii przepływowej.

Ekspresja systemu sekrecji typu III jest niezbędna dla wzrostu bakterii wewnątrz rośliny. Terminowa ekspresja genów T3SS jest osiągana dzięki złożonej regulacji, w centrum której znajduje się czynnik sigma HrpL z grupy funkcji zewnątrzcytoplazmatycznych (ECF), będący kluczowym aktywatorem ekspresji genów powiązanych z T3SS.11Analiza ekspresji hrpL było wcześniej przeprowadzane z wykorzystaniem zlokalizowanej w chromosomie fuzji transkrypcyjnej do położonego w dół promotora bezpromotoroweg...

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Nasz protokół zapewnia delikatną metodę inokulacji i ekstrakcji roślin, która umożliwia odtworzenie populacji bakterii wyhodowanych w apoplastach liściowych, odpowiednich do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach, takiej jak cytometria przepływowa. Metoda ta pozwala na ekstrakcję znacznej ilości bakterii z apoplastu bez znacznego zanieczyszczenia próbek szczątkami komórkowymi roślin. Ta zoptymalizowana metoda odzyskiwania bakterii apoplastycznych może być stosowana bezpośrednio lub z niewielkimi modyfikacjami do wielu systemów bakteryjnych roślin zawierających bakterie chorobotwórcze roślin lub pożyteczne bakterie endocytarne.Procedurę zademonstruje Nieves Lopez-Pagan, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek napełnij doniczkę o średnicy 10 centymetrów wcześniej podlaną mieszanką substratów roślinnych wermikulitu w proporcji 1:3. Przykryj doniczkę perforowaną metalową siatką i dopasuj metalową siatkę do mokrej gleby za pomocą gumki.Następnie zasiej nasiona Arabidopsis w otworach metalowej siatki za pomocą mokrej wykałaczki. Umieść trzy do czterech nasion w odległych miejscach w doniczce. Przykryj doniczkę plastikową kopułą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną i inkubuj do rozwarstwienia w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny.Przenieś doniczkę do komory wzrostu roślin w warunkach dnia krótkiego. Aby odsłonić garnek, zdejmij plastikową kopułę. Gdy nasiona wykiełkują, użyj pęsety, aby usunąć większość sadzonek, trzymając po jednej sadzonce w każdej z pozycji doniczki.Następnie przygotuj rośliny fasoli Phaseolus vulgaris, przykrywając dno szalki Petriego mokrym kawałkiem ręcznika papierowego i umieszczając na niej nasiona fasoli. Uszczelnij szalkę Petriego taśmą chirurgiczną i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Przenieś kiełkujące nasiona do doniczki o średnicy 10 centymetrów wypełnionej mokrą mieszanką substratów roślinnych z wermikulitu w proporcji 1:3 i inkubuj w komorze wzrostu roślin w warunkach długiego dnia.Umieść zapas glicerolu w interesującym nas szczepie Pseudomonas syringae z minus 80 stopni Celsjusza na płytkę LB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami. Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Zeskrob biomasę bakteryjną i zawieś ją ponownie w pięciu mililitrach 10-milimolowego chlorku magnezu.Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach i dostosuj ją do 0,1, dodając 10-milimolowy chlorek magnezu. Wykonaj seryjne rozcieńczenia w 10-milimolowym chlorku magnezu, aby uzyskać końcowe stężenie inokulum pięć razy 10 do piątej CFU na mililitr. Następnie przygotuj 200 mililitrów inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 mililitrów dla roślin fasoli.Przed inokulacją dodać środek powierzchniowo czynny Silwet L-77 do końcowego stężenia 0,02% w przypadku inokulacji fasoli i 0,01% w przypadku Arabidopsis. W celu infiltracji Arabidopsis umieść dwa drewniane patyczki tworzące X nad doniczką i umieść doniczkę skierowaną w dół na szalce Petriego o średnicy 14 centymetrów zawierającej 200 mililitrów inokulum. W przypadku inokulacji liści fasoli włóż rośliny i roztwór inokulum do komory próżniowej i wprowadź liść do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej zawierającej inokulum.Daj impuls 500 milibarów przez 30 sekund, aby przeniknąć do liści. Odcedź nadmiar roztworu inokulum za pomocą kartki papieru i włóż plany z powrotem do odpowiedniej komory wzrostu. Cztery dni po zaszczepieniu odetnij nadziemną część rośliny Arabidopsis lub zaszczepiony liść z rośliny fasoli i umieść go w 20-mililitrowej strzykawce bez igły.W przypadku liści fasoli zwiń liść na siebie, pozostawiając twarz odbytową na zewnątrz. Dodaj tyle wody destylowanej, aby przykryć tkankę. Następnie włożyć tłok przytrzymujący strzykawkę w pozycji pionowej i usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki, delikatnie stukając w cylinder, aż całe powietrze znajdzie się w pobliżu końcówki, a po usunięciu powietrza przykryć końcówkę cylindra strzykawki folią parafinową.Teraz ostrożnie naciśnij tłok, aby wytworzyć nadciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza. Następnie pociągnij tłok, aby wytworzyć podciśnienie. Usunąć warstwę parafinową i tłok i zebrać płyn zawierający bakterie wyekstrahowane przez apoplast.Do analizy pojedynczej komórki przygotuj 1,5% roztwór agarozy w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj wystarczającą objętość, aby wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i umieść kolejny szkiełko na wierzchu. Pozwól im jeździć przez 15 minut i ostrożnie zdejmij suwak umieszczony na górze.Za pomocą ostrza pokrój podkładkę agarozową na kawałki o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów przed użyciem. Równolegle odwirować jeden milimetr bakterii wyekstrahowanych apoplastami. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody w celu zagęszczenia komórek.Umieść dwumikrolitrową kroplę skoncentrowanych komórek na szkiełku nakrywkowym o średnicy 0,17 milimetra i przykryj kroplę kawałkiem wacika agarozy. Wizualizacja preparatu bakteryjnego pod mikroskopem konfokalnym w celu identyfikacji bakterii zielonej fluorescencji za pomocą specjalnych laserów. Zidentyfikuj wszystkie bakterie za pomocą jasnego pola i połącz oba pola.Aby przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej, należy pobrać podwielokrotność zawiesin bakterii ekstrahowanych apoplastami. Analizuj za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj 100 000 zdarzeń. Ekspresja hrpL GFP jest monitorowana przez fluorescencję GFP.Wykresy z wykresem kropkowym pokazują rozkład intensywności fluorescencji GFP w stosunku do wielkości komórek w populacji, podczas gdy histogramy pokazują intensywność fluorescencji GFP w funkcji liczby komórek. Procenty hrpL ON były wyższe niż odpowiadające im wartości procentowe hrpL OFF. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują niejednorodne poziomy GFP związane z ekspresją hrpL.Obserwuje się bakterie wykazujące niską lub żadną fluorescencję GFP. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zachować ostrożność podczas etapów ekstrakcji bakterii, aby uniknąć uszkodzenia tkanki roślinnej, a tym samym ograniczyć zanieczyszczenie zawartością komórkową roślin. Uzyskane próbki bakterii można wykorzystać do innych celów, w których zmniejszenie zanieczyszczenia roślin jest korzystne, takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych w celu późniejszej analizy genomowej lub transkryptomicznej bakterii.

single-cell-analysis-expression-pseudomonas-syringae-genes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Źródło: Rufián, J. S. i in., Analiza pojedynczych komórek ekspresji genów Pseudomonas Syringae w tkance roślinnej. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje metodę ciśnienia opartą na strzykawkach do ekstrakcji bakterii apoplastycznych, które rozmnażają się i tworzą mikrokolonie w apoplastyce, czyli przestrzeni międzykomórkowej między komórkami roślinnymi. Metoda ta daje próbki bakteryjne wolne od zanieczynków odpowiednie do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie.

Ekstrakcja bakterii apoplastycznych za pomocą metody ciśnieniowej opartej na strzykawkach

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Poznaj metodę jednokomórkowej analizy ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej. Technika ta umożliwia odzyskanie bakterii z apoplastu z minimalnym zanieczyszczeniem pozostałościami roślinnymi.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Przeglądaj więcej filmów