Name: Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Naucz się standaryzowanej metody homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych dla modelu EAE, stosowanej w badaniach nad stwardnieniem rozsianym. Ta technika zapewnia powtarzalność wyników eksperymentalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować jednostkom trzymania zwierząt na Uniwersytecie w Lund, Camilli Björklöv i Agnieszce Czopek, za ich wsparcie, oraz Richardowi Williamsowi, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, za konstruktywną krytykę i wsparcie językowe przy tworzeniu tego manuskryptu.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z praktykami Szwedzkiej Rady Badań nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt, Lund-Malmö, Szwecja (numer zezwolenia: M126-16).
UWAGA: Schematyczny przebieg metody jest opisany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie materiału
UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki aseptycznie w sterylnym kapturze, a następnie podziel je i przechowuj we wskazanej temperaturze. Odczynniki mogą być przechowywane do 2 lat bez utraty ich działania.
<ol>
	<li>Przygotować CFA zawierające 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Dodać 100 mg liofilizowanego M. tuberculosis H37RA (patrz tabela materiałów) i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 mm do probówki o pojemności 7 ml (patrz tabela materiałów). Potrząsaj probówką w homogenizatorze (patrz tabela materiałów) przez 60 s przy najwyższym ustawieniu prędkości (5 000 obr./min).</li>
		<li>Dodać 5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda (IFA) do probówki i ponownie wstrząsać przez 60 s z najwyższą prędkością. Przenieść zawiesinę homogenizowanego M. tuberculosis z IFA (obecnie pod nazwą CFA) do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do liofilizowanego proszku peptydu MOG35-55 (patrz tabela materiałów) dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcowe stężenie peptydu 10 mg/ml. Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przygotować 60 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Peptyd MOG35-55 użyty w tym eksperymencie ma czystość ImmunoGrade (~70%), jest rozszczepiony TFA, łatwo rozpuszcza się w wodzie i zawiera C-końcowy amid (-NH2) w celu zwiększenia stabilności in vivo14. Podwielokrotności peptydów nigdy nie były rozmrażane i ponownie zamrażane więcej niż dwa razy i były przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml buforu toksyny krztuścowej: Rozpuść 2,9 g NaCl w 80 ml 1x Ca2+/Mg2+ wolnego PBS i dodaj 100 μl 10% Triton X-100. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą PBS i wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przygotować 10 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie emulsji CFA/peptydowych
<ol>
	<li>Obliczyć ilość emulsji potrzebną do immunizacji. W tym standardowym protokole każda mysz otrzymuje 50 μg peptydu MOG35-55 i 300 μg M. tuberculosis rozproszone w adiuwantzie Freunda (CFA). Ilość każdego odczynnika (peptyd MOG35-55, PBS, CFA i IFA) wymagana do przygotowania emulsji może być obliczona za pomocą pliku uzupełniającego 1. Dodatkowe 20% wszystkich odczynników, aby zrekompensować niewielki ubytek emulsji, jest uwzględniane w obliczeniach. 
	UWAGA: Dostępny w handlu zestaw emulsji (patrz Tabela materiałów) używany w tym badaniu składa się z tubki, nakrętki i tłoka w wysterylizowanej torebce. Każda tubka zestawu emulsji mieści maksymalnie 9,6 ml, co umożliwia przygotowanie 8 strzykawek o pojemności 1 ml wystarczających do zaszczepienia 40 myszy (lub 80 myszy w przypadku użycia 100 μl emulsji na zwierzę).</li>
	<li>Umieść zakręcaną rurkę (z dostępnego w handlu zestawu emulsji) i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie.</li>
	<li>Dodać składniki emulsji w następującej kolejności w objętościach obliczonych w kroku 2.1: PBS, następnie peptyd, następnie M. tuberculosis w CFA, a na końcu IFA.</li>
	<li>Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5-10 s, aby wstępnie wymieszać odczynniki.</li>
	<li>Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 s. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na 3 minuty. Powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję.</li>
	<li>Zdjąć nakrętkę z tubki, włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji. Zdejmij zatrzaskiwane zamknięcie na dole tuby, przekręcając je.</li>
	<li>Wyjąć tłok ze strzykawki do wstrzykiwań (1 ml; patrz Tabela materiałów). Dodać igłę (najlepiej 25-27 G) do strzykawki do wstrzykiwań.</li>
	<li>Przymocować tylny koniec strzykawki do przeznaczonego do tego celu zamka w dolnej części rurki i zablokować go krótkim przekręceniem.</li>
	<li>Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Przerwać, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 ml strzykawki do wstrzykiwań.</li>
	<li>Oddzielić strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby do strzykawki nie dostało się powietrze. Naciskać tłok tak długo, aż emulsja wyjdzie z igły. 
	UWAGA: W tym momencie część emulsji można wykorzystać do kontroli jakości (patrz krok 3).</li>
	<li>Powtórz kroki 2.8-2.11 dla reszty emulsji obecnej w probówce. 
	UWAGA: Aby zminimalizować marnotrawstwo drogich emulsji CFA/antygenowych, należy używać strzykawek o pojemności 1 ml. Można użyć innych strzykawek, które pasują do dedykowanego zamka na dnie tuby; Jednak może być konieczne przygotowanie większej objętości emulsji. Emulsja peptydowa CFA/MOG35-55 może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 15 tygodni bez utraty zdolności indukowania EAE.</li>
</ol>
3. Kontrola jakości emulsji
<ol>
	<li>Test kroplowy: Dodaj małą kroplę emulsji do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml zimnej wody. Zamknij tubkę i potrząsaj nią ręcznie przez kilka sekund. Pojawienie się maleńkich, wyraźnych kropelek potwierdza tworzenie się emulsji typu woda w oleju.</li>
	<li>Zbadaj emulsję za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować wielkość cząstek wody w oleju, dodaj niewielką kroplę (2-3 μl) emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję.</li>
		<li>Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym (patrz tabela materiałów) z 400-krotnym powiększeniem i skoncentruj się na polu z monowarstwą emulsji. Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite szaro-białe cząstki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wielkości cząstek emulsji za pomocą dyfrakcji laserowej. 
	UWAGA: Dyfrakcja laserowa mierzy rozkład wielkości cząstek za pomocą wiązki laserowej. Jest to ostateczny test kontroli jakości emulsji. Reprezentatywny wynik rozkładu wielkości cząstek przy użyciu opisanej tutaj metody jest pokazany na Rysunek 2B (szczegółowy opis znajduje się w Topping et al.6). Niemniej jednak próba upuszczenia i badanie mikroskopowe są wystarczające, aby sprawdzić, czy powstała zadowalająca emulsja.
	<ol>
		<li>Ustaw współczynniki załamania światła zarówno dla lasera czerwonego, jak i niebieskiego dla dyspergatora (patrz tabela materiałów) na 1,456, a dla próbki na 1,33 w analizatorze wielkości cząstek (patrz tabela materiałów). Ustaw absorbancję współczynnika załamania światła na 0,02.</li>
		<li>Dodać jedną kroplę ze strzykawki zawierającej emulsję peptydową do jednostki dyspersyjnej zawierającej lekki olej mineralny. Akwizycję danych należy rozpocząć natychmiast po dyspersji emulsji. 
		UWAGA: Zastosowano model ogólnego przeznaczenia i założono cząstki sferyczne w celu oszacowania rozkładu wielkości cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Indukcja EAE przy użyciu emulsji peptydowej MOG 35-55 u myszy C57BL6/J
UWAGA: We wszystkich eksperymentach użyto pięciu 8-12-tygodniowych samic myszy C57BL6/J.
<ol>
	<li>Przed szczepieniem znieczulij myszy za pomocą 2,5% odparowanego izofluranu i potwierdź, mocno szczypiąc palec u nogi.</li>
	<li>Wstrzyknąć każdej myszy podskórnie za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml w dwa różne miejsca, po prawej i lewej stronie tylnej flanki, 200 μl emulsji zawierającej 50 μg peptydu MOG35-55 w stosunku 1:1 (v/v) peptydu/CFA.</li>
	<li>Co najmniej 1,5 godziny po immunizacji emulsją, a następnie ponownie po 24 godzinach, podać łącznie 80 ng toksyny Bordetella pertussis w 200 μl buforu toksyny krztuścowej każdej myszy poprzez wstrzyknięcia dootrzewnowe (100 μl po lewej stronie i 100 μl po prawej stronie brzucha). 
	UWAGA: Wykazano, że precyzyjna lokalizacja iniekcji dootrzewnowej z toksyną krztuśca jest niezbędna do aktywacji limfocytów T w drenującym węźle chłonnym15.</li>
	<li>Opcjonalnie: Wstrzyknij peptyd MOG35-55 ponownie w 7 dniu (zgodnie z niektórymi protokołami16), powtarzając krok 4.2. 
	UWAGA: Przede wszystkim należy upewnić się, że strzykawki i igły używane do immunizacji zawierające MOG/CFA lub toksynę krztuścową są odpowiednio utylizowane w workach/pojemnikach stanowiących zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Oceniaj wynik kliniczny codziennie, używając skali od 0 do 6, jak opisano wcześniej6.</li>
</ol>

<ol><li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide%3A+Insights+from+the+Atlas+of+MS%2C+third+edition%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li>
<li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis%3A+identity%2C+mechanisms+and+potential+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).</li>
<li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+No+One%2C+and+One+Hundred+Thousand%3A+T+Regulatory+Cells%27+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).</li>
<li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li>
<li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li>
<li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).</li>
<li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen%2Fadjuvant+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li>
<li>Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li>
<li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li>
<li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+neuritis%3A+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li>
<li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+%28H-2%29+type%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).</li>
<li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li>
<li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1%2827-35%29+peptide%3A+implications+for+peptide+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li>
<li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li>
<li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li>
<li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778(2012).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603(2022).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612(2022).</li>
<li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li>
</ol>

BTB Emulsions AB złożyła wniosek patentowy na zastosowanie urządzenia i metody przygotowania emulsji do immunizacji zwierząt i ludzi (numer europejskiego zgłoszenia patentowego: EP3836884A1). BTB jest dyrektorem generalnym i założycielem firmy oraz udziałowcem BTB Emulsions. Firma Bertin-Instruments zajmuje się dystrybucją zestawów emulsji użytych w tej publikacji na całym świecie.

Emulsje typu woda w oleju, takie jak antygen/adiuwant Freunda, są używane od ponad pół wieku do indukcji EAE17. Obecnie nie ma ustandaryzowanej metody przygotowania emulsji antygenowych, która byłaby niezależna od wpływu człowieka. Ręczne mieszanie za pomocą strzykawek jest standardem w większości laboratoriów, jednak metoda ta jest czasochłonna, często skutkuje nadmierną utratą materiału, a jakość różni się w zależności od naukowca go przygotowującego.
Metoda przedstaw...

Załamanie tolerancji immunologicznej może prowadzić do powstania zaburzeń autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Szacuje się, że na całym świecie żyje 2,8 miliona ludzi ze stwardnieniem rozsianym1. Chociaż dokładna przyczyna stwardnienia rozsianego jest nadal w dużej mierze nieznana, rozregulowanie autoreaktywnych limfocytów T i B, a także defekty funkcji limfocytów Treg, odgrywają ważną rolę w patogenezie choroby2,3.
Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych są niezbędnymi narzędziami do badania potencjalnych metod terapeutycznych. Eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest używany od prawie stu lat przez badaczy zainteresowanych MS4. We wczesnych eksperymentach częstość występowania choroby była stosunkowo niska. Wprowadzenie kompletnego adiuwanta Freunda (CFA), zawierającego Mycobacterium i toksynę krztuścową, umożliwiło konsekwentną indukcję EAE u myszy4. Co najważniejsze, konieczne jest zmieszanie CFA z antygenem specyficznym dla ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w celu wytworzenia jednorodnej emulsji typu woda w oleju do indukcji EAE. Najpowszechniejsze obecnie dostępne modele EAE opierają się na aktywnym uodparnianiu myszy peptydami encefalitogennymi. Tło genetyczne myszy odgrywa ważną rolę w podatności na choroby, z peptydami glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) i białka proteolipidowego mieliny (PLP139-151) stosowanych do indukcji EAE u myszy C57BL / 6J i SJL, odpowiednio5. Można jednak również stosować inne szczepy myszy i peptydy pochodzące z OUN.
Jakość emulsji CFA/peptydu jest krytycznym czynnikiem, który decyduje o penetracji choroby w modelu aktywnej immunizacji EAE6. Jednorodną emulsję typu woda w oleju należy przygotować przez zmieszanie peptydów encefalitogennych rozpuszczonych w buforze wodnym z CFA, w przeciwnym razie u zwierząt nie rozwinie się choroba. Opublikowano liczne protokoły dotyczące przygotowania emulsji CFA/peptydowych. Przykłady obejmują użycie vortex7, sonication8, strzykawek i trójdrożnego łącznika T9, lub tylko jednej strzykawki5. Jednak wszystkie te metody są trudne do standaryzacji i często wiążą się z długimi i skomplikowanymi protokołami.
W porównaniu do wszystkich powyższych metod, opisana tutaj prosta metoda przygotowania emulsji oferuje zalety braku różnic między osobami i jest stosunkowo szybka. Emulsja jest generowana przez homogenizator wytrząsający odczynniki z ustaloną prędkością, czasem i temperaturą, zapewniając szybkie i spójne wyniki. Oprócz wywoływania choroby w modelu EAE, metoda ta może być również stosowana do badania innych modeli chorób autoimmunologicznych, takich jak zapalenie stawów wywołane kolagenem (CIA) i zapalenie stawów wywołane antygenem (AIA)6. W związku z tym przewiduje się, że metoda ta może być stosowana do konsekwentnego wywoływania choroby w innych modelach zwierzęcych, które zależą od emulsji typu woda w oleju z autoantygenami, takich jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwów (EAN)10, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (EAT)11, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU)12 i miastenia (MG)13. Metoda ta indukuje również ogólne reakcje immunologiczne, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH) konsekwentnie6, a zatem może być stosowana do dostarczania szczepionek przeciwko rakowi i malarii (patrz dyskusja).
Tak więc, szybka (całkowity czas przygotowania ~30 min), prosta (wszystkie odczynniki mogą być przygotowane wcześniej i przechowywane) i ustandaryzowana (emulsja jest realizowana za pomocą homogenizatora wstrząsającego) metoda została opracowana i jest tutaj prezentowana. Emulsje CFA/antygenowe przygotowane przy użyciu tego protokołu konsekwentnie indukują chorobę w autoimmunologicznych modelach zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>1 ml Strzykawka iniekcyjna</td><td>B. Braun</td><td>9166017V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka iniekcyjna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683531</td><td></td></tr><tr><td>7 ml puste probówki z nakrętkami</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000944LYSK0A.0</td><td>Probówka 7 ml</td></tr><tr><td>50 ml sterylna probówka wirówkowa&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 10788561</td><td></td><td>50 ml probówka</td></tr><tr><td>Bordetella pertussis toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2980</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Dyspergator, lekki olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Zestaw emulsji</td><td>Bertin-Instruments</td><td>D34200.10 ea</td><td>Zawiera rurkę, nasadkę i tłok</td></tr><tr><td>Niekompletny adiuwant Freunda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; F5506</td><td>Sklep pod adresem +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF3114-33-8</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mastersizer 2000&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td>Analizator wielkości cząstek</td></tr><tr><td>Minilys-Personal Homogenizator</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td>Homogenizator wstrząsający</td></tr><tr><td>MOG 35-55 Peptyd&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Innovagen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Montanide ISA 51 VG</td><td>Seppic</td><td>36362Z</td><td>zatwierdzony przez FDA adiuwant olejowy</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc Filtry strzykawkowe 0,2 i mu; </td><td>m Fisher Scientific</td><td>17124381</td><td>Filtr Sterlie</td></tr><tr><td>PBS, wolny od Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Mikroskop fazowo-konstrastowy</td><td>Olympus</td><td>BX40-B</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki stalowe 3,2 mm</td><td>Autoklaw Fisher Scientific</td><td>NC0445832</td><td>i przechowuj w RT</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648463</td><td>Sklep w RT</td></tr></tbody></table>

szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) ma podobne cechy immunologiczne i kliniczne jak stwardnienie rozsiane (SM), dlatego jest szeroko stosowane jako model do identyfikacji nowych celów leków dla lepszego leczenia pacjentów. Stwardnienie rozsiane charakteryzuje się kilkoma różnymi przebiegami choroby: rzutowo-remisyjnym SM (RRMS), pierwotnie postępującym SM (PPMS), wtórnie postępującym SM (SPMS) i rzadką postępująco-rzutową postacią SM (PRMS). Chociaż modele zwierzęce nie naśladują dokładnie wszystkich tych kontrastujących ze sobą fenotypów chorób ludzkich, istnieją modele EAE, które odzwierciedlają niektóre z różnych objawów klinicznych stwardnienia rozsianego. Na przykład EAE indukowane glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) u myszy C57BL / 6J naśladuje ludzkie PPMS, podczas gdy EAE indukowane białkiem proteolipidowym mieliny (PLP) u myszy SJL / J przypomina RRMS. Inne autoantygeny, takie jak podstawowe białko mieliny (MBP) i wiele różnych szczepów myszy są również wykorzystywane do badania EAE. Aby wywołać chorobę w tych modelach EAE immunizacji autoantygenowej, przygotowuje się emulsję typu woda w oleju i wstrzykuje się ją podskórnie. Większość modeli EAE wymaga również wstrzyknięcia toksyny krztuścowej, aby choroba się rozwinęła. W celu spójnej i powtarzalnej indukcji EAE niezbędny jest szczegółowy protokół przygotowania odczynników do wytworzenia emulsji antygenowych/adiuwantowych. Opisana tutaj metoda wykorzystuje znormalizowaną metodę wytwarzania emulsji typu woda w oleju. Jest prosty i szybki, a do przygotowania emulsji o kontrolowanej jakości wykorzystuje homogenizator wstrząsający zamiast strzykawek.

Szybki, prosty i zestandaryzowany protokół przygotowania emulsji CFA/MOG przedstawiono na Ryc. 1. Metoda ta została niedawno opisana w innym opracowaniu6. Emulsje CFA/MOG można przygotować również innymi metodami, takimi jak tradycyjna metoda strzykawki lub mieszanie w wibratorze laboratoryjnym (vortexowaniu). Metody te porównano tutaj poprzez ocenę jakości otrzymanych emulsji. Wszystkie metody pozwoliły na otrzymanie emulsji typu woda w oleju; jednorodność i jakość t...

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego lub EAE to model zwierzęcy wykorzystywany do opracowywania nowych i ulepszonych metod leczenia pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Wywołanie choroby w EAE wymaga doskonałej emulsji olejowo-wodnej, aby osiągnąć spójne wyniki. Przedstawiona tutaj metoda przygotowania emulsji jest wolna od wpływu człowieka, co ogranicza niespójności między eksperymentami.Mimo że metoda została zoptymalizowana pod kątem EAE, może być również stosowana w innych modelach chorób autoimmunologicznych, a także do testowania szczepionek przeciwnowotworowych. Aby przygotować gnojowicę CFA, należy dodać 100 miligramów liofilizowanej gruźlicy M tuberculosis H37 RA i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 milimetra do siedmiomililitrowej probówki. Potrząsaj probówką w homogenizatorze przez 60 sekund z najwyższą prędkością.Dodaj pięć mililitrów adiuwantu IFA do probówki i ponownie wstrząsaj przez 60 sekund z najwyższą prędkością. Następnie przenieś gnojowicę do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować emulsję CFA/peptyd, pobierz plik uzupełniający, aby obliczyć ilość potrzebną dla każdego odczynnika.Następnie umieść zakręconą rurkę i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie. Następnie dodaj składniki emulsji. Najpierw PBS, potem peptyd, zawiesina CFA.I wreszcie targi IFA. Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5 do 10 sekund, aby wstępnie wymieszać odczynniki.Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 sekund. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na trzy minuty i powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.Odwirować probówkę o stężeniu 300 G po jednej minucie, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję. Zdejmij nakrętkę z tubki. Włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji.Zdejmij odklejaną obudowę na dole rurki, przekręcając ją. Następnie należy usunąć tłok ze wszystkich strzykawek do wstrzykiwań i dodać igłę do strzykawek iniekcyjnych. Następnie przymocować tylną część strzykawki do dedykowanego zamka w dolnej części rurki i zablokować ją krótkim przekręceniem.Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Zatrzymaj się, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 mililitra strzykawki do wstrzykiwań. Odłączyć strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby powietrze nie dostało się do tej strzykawki.Naciskać tłok, aż emulsja wyjdzie z igły i powtórzyć proces dla reszty emulsji znajdującej się w probówce. Aby przeanalizować wielkość cząstek wody i oleju, dodaj niewielką kroplę emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję. Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym o 400-krotnym powiększeniu i skup się na polu z monowarstwą emulsji.Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite, szare lub białe cząstki. Emulsje wytworzone metodą homogenizacji wykazywały szare lub białe cząstki w kształcie fasoli reprezentujące drobne kropelki emulsji wodnych i olejowych. Natomiast kropelki emulsji wytwarzane metodą strzykawkową były większe i szersze.W metodzie wirowej obserwowano duże szare lub czarne cząstki odpowiadające pęcherzykom powietrza uwięzionym w emulsji. Zmiany w rozkładzie wielkości cząstek w czasie, mierzone za pomocą laserowego analizatora wielkości cząstek do defrakcji dla emulsji wodnych i olejowych, nie wykazały żadnych zmian w wielkości cząstek w okresie sześciu tygodni. Świeże 3-tygodniowe i 15-tygodniowe emulsje wywołały podobne choroby EAE u wszystkich zwierząt badanych podczas eksperymentu.Myszy rozwinęły podobny wzorzec chorobowy we wszystkich eksperymentach, ujawniając, że przedstawiona tutaj metoda homogenizacji wytwarzała emulsje, które indukowały EAE w spójny i powtarzalny sposób. Przed przygotowaniem emulsji do eksperymentu pobierz plik uzupełniający numer jeden, aby obliczyć ilość każdego składnika potrzebną do zminimalizowania odpadów. Przedstawiona tu metoda mogłaby zostać wykorzystana do standaryzacji przygotowania emulsji nie tylko do badań przedklinicznych, ale także w przyszłości do przygotowania szczepionek przeciwnowotworowych w klinice.

a-rapid-simple-standardized-homogenization-method-to-prepare

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zaprezentowano indukcję oraz ocenę kliniczną modelu zwierzęcego stwardnienia rozsianego: przewlekłego nawracającego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów linii DA. Choroba, wywołana immunizacją szczurów emulsją zawierającą cały rdzeń kręgowy szczura i pełny adiuwant Freunda, wykazuje objawy kliniczne przypominające przebieg choroby u ludzi.

Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki mysiej.

Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.

Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6

Opisujemy prosty protokół wykorzystujący tylko podstawowy sprzęt laboratoryjny do generowania i oczyszczania dużych ilości białka fuzyjnego, które zawiera glikoproteinę oligodendrocytów mieliny myszy. Białko to może być wykorzystane do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wywołanego zarówno przez limfocyty T, jak i B.

Prosta i wydajna produkcja i oczyszczanie glikoproteiny oligodendrocytów mieliny myszy do eksperymentalnych badań nad autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Naucz się standaryzowanej metody homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych dla modelu EAE, stosowanej w badaniach nad stwardnieniem rozsianym. Ta technika zapewnia powtarzalność wyników eksperymentalnych.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Przeglądaj więcej filmów