Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia
December 9th, 2022
Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego lub EAE to model zwierzęcy wykorzystywany do opracowywania nowych i ulepszonych metod leczenia pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Wywołanie choroby w EAE wymaga doskonałej emulsji olejowo-wodnej, aby osiągnąć spójne wyniki. Przedstawiona tutaj metoda przygotowania emulsji jest wolna od wpływu człowieka, co ogranicza niespójności między eksperymentami.
Mimo że metoda została zoptymalizowana pod kątem EAE, może być również stosowana w innych modelach chorób autoimmunologicznych, a także do testowania szczepionek przeciwnowotworowych. Aby przygotować gnojowicę CFA, należy dodać 100 miligramów liofilizowanej gruźlicy M tuberculosis H37 RA i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 milimetra do siedmiomililitrowej probówki. Potrząsaj probówką w homogenizatorze przez 60 sekund z najwyższą prędkością.
Dodaj pięć mililitrów adiuwantu IFA do probówki i ponownie wstrząsaj przez 60 sekund z najwyższą prędkością. Następnie przenieś gnojowicę do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować emulsję CFA/peptyd, pobierz plik uzupełniający, aby obliczyć ilość potrzebną dla każdego odczynnika.
Następnie umieść zakręconą rurkę i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie. Następnie dodaj składniki emulsji. Najpierw PBS, potem peptyd, zawiesina CFA.
I wreszcie targi IFA. Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5 do 10 sekund, aby wstępnie wymieszać odczynniki.
Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 sekund. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na trzy minuty i powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.
Odwirować probówkę o stężeniu 300 G po jednej minucie, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję. Zdejmij nakrętkę z tubki. Włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji.
Zdejmij odklejaną obudowę na dole rurki, przekręcając ją. Następnie należy usunąć tłok ze wszystkich strzykawek do wstrzykiwań i dodać igłę do strzykawek iniekcyjnych. Następnie przymocować tylną część strzykawki do dedykowanego zamka w dolnej części rurki i zablokować ją krótkim przekręceniem.
Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Zatrzymaj się, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 mililitra strzykawki do wstrzykiwań. Odłączyć strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby powietrze nie dostało się do tej strzykawki.
Naciskać tłok, aż emulsja wyjdzie z igły i powtórzyć proces dla reszty emulsji znajdującej się w probówce. Aby przeanalizować wielkość cząstek wody i oleju, dodaj niewielką kroplę emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję. Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym o 400-krotnym powiększeniu i skup się na polu z monowarstwą emulsji.
Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite, szare lub białe cząstki. Emulsje wytworzone metodą homogenizacji wykazywały szare lub białe cząstki w kształcie fasoli reprezentujące drobne kropelki emulsji wodnych i olejowych. Natomiast kropelki emulsji wytwarzane metodą strzykawkową były większe i szersze.
W metodzie wirowej obserwowano duże szare lub czarne cząstki odpowiadające pęcherzykom powietrza uwięzionym w emulsji. Zmiany w rozkładzie wielkości cząstek w czasie, mierzone za pomocą laserowego analizatora wielkości cząstek do defrakcji dla emulsji wodnych i olejowych, nie wykazały żadnych zmian w wielkości cząstek w okresie sześciu tygodni. Świeże 3-tygodniowe i 15-tygodniowe emulsje wywołały podobne choroby EAE u wszystkich zwierząt badanych podczas eksperymentu.
Myszy rozwinęły podobny wzorzec chorobowy we wszystkich eksperymentach, ujawniając, że przedstawiona tutaj metoda homogenizacji wytwarzała emulsje, które indukowały EAE w spójny i powtarzalny sposób. Przed przygotowaniem emulsji do eksperymentu pobierz plik uzupełniający numer jeden, aby obliczyć ilość każdego składnika potrzebną do zminimalizowania odpadów. Przedstawiona tu metoda mogłaby zostać wykorzystana do standaryzacji przygotowania emulsji nie tylko do badań przedklinicznych, ale także w przyszłości do przygotowania szczepionek przeciwnowotworowych w klinice.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia standaryzowaną metodę przygotowania emulsji woda-w-oleju do indukowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), zwierzęcego modelu stwardnienia rozsianego. Metoda ma na celu zmniejszenie zmienności wyników poprzez minimalizowanie wpływu człowieka podczas przygotowania emulsji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Badania nad chorobami autoimmunologicznymi
Tło
- Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest wykorzystywane do badania stwardnienia rozsianego.
- Konsekwentna przygotowanie emulsji jest kluczowe dla wiarygodnych wyników eksperymentów.
- Obecne metody mogą znacznie się różnić, wpływając na reprodukowalność.
- To badanie wprowadza szybki i prosty protokół homogenizacji.
Cel badania
- Prezentacja standaryzowanej metody przygotowania emulsji.
- Zmniejszenie zmienności w indukcji EAE.
- Dostarczenie protokołu stosowanego w innych modelach autoimmunologicznych i testach szczepionek przeciwnowotworowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny CFA z użyciem liofilizowanego M tuberculosis H37 RA.
- Zastosowanie stalowych kul i homogenizatora do przygotowania emulsji.
- Optymalizacja czasu i prędkości mieszania dla spójności.
- Zastosowanie metody do EAE i innych modeli.
Główne wyniki
- Metoda wytworzyła stabilną emulsję nadającą się do indukcji EAE.
- Zmniejszenie wpływu człowieka doprowadziło do bardziej spójnych wyników eksperymentów.
- Zadokumentowano zastosowanie do innych modeli chorób autoimmunologicznych.
- Zwrócono uwagę na potencjalne zastosowanie w testowaniu szczepionek przeciwnowotworowych.
Wnioski
- Standaryzowana metoda przygotowania emulsji poprawia reprodukowalność w badaniach EAE.
- To podejście może być zaadaptowane do różnych zastosowań badawczych.
- Przyszłe badania mogą skorzystać z tego protokołu, aby poprawić wyniki eksperymentów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
