Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia
9 grudnia 2022
Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego lub EAE to model zwierzęcy wykorzystywany do opracowywania nowych i ulepszonych metod leczenia pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Wywołanie choroby w EAE wymaga doskonałej emulsji olejowo-wodnej, aby osiągnąć spójne wyniki. Przedstawiona tutaj metoda przygotowania emulsji jest wolna od wpływu człowieka, co ogranicza niespójności między eksperymentami.
Mimo że metoda została zoptymalizowana pod kątem EAE, może być również stosowana w innych modelach chorób autoimmunologicznych, a także do testowania szczepionek przeciwnowotworowych. Aby przygotować gnojowicę CFA, należy dodać 100 miligramów liofilizowanej gruźlicy M tuberculosis H37 RA i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 milimetra do siedmiomililitrowej probówki. Potrząsaj probówką w homogenizatorze przez 60 sekund z najwyższą prędkością.
Dodaj pięć mililitrów adiuwantu IFA do probówki i ponownie wstrząsaj przez 60 sekund z najwyższą prędkością. Następnie przenieś gnojowicę do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować emulsję CFA/peptyd, pobierz plik uzupełniający, aby obliczyć ilość potrzebną dla każdego odczynnika.
Następnie umieść zakręconą rurkę i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie. Następnie dodaj składniki emulsji. Najpierw PBS, potem peptyd, zawiesina CFA.
I wreszcie targi IFA. Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5 do 10 sekund, aby wstępnie wymieszać odczynniki.
Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 sekund. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na trzy minuty i powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.
Odwirować probówkę o stężeniu 300 G po jednej minucie, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję. Zdejmij nakrętkę z tubki. Włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji.
Zdejmij odklejaną obudowę na dole rurki, przekręcając ją. Następnie należy usunąć tłok ze wszystkich strzykawek do wstrzykiwań i dodać igłę do strzykawek iniekcyjnych. Następnie przymocować tylną część strzykawki do dedykowanego zamka w dolnej części rurki i zablokować ją krótkim przekręceniem.
Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Zatrzymaj się, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 mililitra strzykawki do wstrzykiwań. Odłączyć strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby powietrze nie dostało się do tej strzykawki.
Naciskać tłok, aż emulsja wyjdzie z igły i powtórzyć proces dla reszty emulsji znajdującej się w probówce. Aby przeanalizować wielkość cząstek wody i oleju, dodaj niewielką kroplę emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję. Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym o 400-krotnym powiększeniu i skup się na polu z monowarstwą emulsji.
Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite, szare lub białe cząstki. Emulsje wytworzone metodą homogenizacji wykazywały szare lub białe cząstki w kształcie fasoli reprezentujące drobne kropelki emulsji wodnych i olejowych. Natomiast kropelki emulsji wytwarzane metodą strzykawkową były większe i szersze.
W metodzie wirowej obserwowano duże szare lub czarne cząstki odpowiadające pęcherzykom powietrza uwięzionym w emulsji. Zmiany w rozkładzie wielkości cząstek w czasie, mierzone za pomocą laserowego analizatora wielkości cząstek do defrakcji dla emulsji wodnych i olejowych, nie wykazały żadnych zmian w wielkości cząstek w okresie sześciu tygodni. Świeże 3-tygodniowe i 15-tygodniowe emulsje wywołały podobne choroby EAE u wszystkich zwierząt badanych podczas eksperymentu.
Myszy rozwinęły podobny wzorzec chorobowy we wszystkich eksperymentach, ujawniając, że przedstawiona tutaj metoda homogenizacji wytwarzała emulsje, które indukowały EAE w spójny i powtarzalny sposób. Przed przygotowaniem emulsji do eksperymentu pobierz plik uzupełniający numer jeden, aby obliczyć ilość każdego składnika potrzebną do zminimalizowania odpadów. Przedstawiona tu metoda mogłaby zostać wykorzystana do standaryzacji przygotowania emulsji nie tylko do badań przedklinicznych, ale także w przyszłości do przygotowania szczepionek przeciwnowotworowych w klinice.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowaną metodę przygotowania emulsji woda w oleju w celu indukowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), będącego modelem zwierzęcym stwardnienia rozsianego. Metoda ta ma na celu zmniejszenie zmienności wyników poprzez zminimalizowanie wpływu czynnika ludzkiego podczas przygotowywania emulsji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Badania nad chorobami autoimmunologicznymi
Wstęp
- Do badania stwardnienia rozsianego wykorzystuje się eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE).
- Spójne przygotowanie emulsji jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
- Obecne metody mogą znacznie się różnić, co wpływa na powtarzalność badań.
- Niniejsze badanie wprowadza szybki i prosty protokół homogenizacji.
Cel badania
- Przedstawienie ustandaryzowanej metody przygotowywania emulsji.
- Ograniczenie zmienności w indukcji EAE.
- Dostarczenie protokołu możliwego do zastosowania w innych modelach autoimmunologicznych oraz w testowaniu szczepionek przeciwnowotworowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny CFA z liofilizowanych bakterii M tuberculosis H37 RA.
- Zastosowanie stalowych kulek i homogenizatora do przygotowania emulsji.
- Optymalizacja czasu i prędkości wytrząsania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Zastosowanie metody w EAE i innych modelach.
Główne wyniki
- Metoda pozwoliła na otrzymanie stabilnej emulsji odpowiedniej do indukcji EAE.
- Ograniczenie wpływu człowieka doprowadziło do uzyskania bardziej spójnych wyników eksperymentalnych.
- Wykazano możliwość zastosowania metody w innych modelach chorób autoimmunizacyjnych.
- Zwrócono uwagę na potencjalne wykorzystanie metody w testowaniu szczepionek przeciwnowotworowych.
Wnioski
- Znormalizowana metoda przygotowania emulsji zwiększa powtarzalność w badaniach nad EAE.
- Podejście to można dostosować do różnych zastosowań badawczych.
- Przyszłe badania mogą skorzystać z tego protokołu w celu poprawy wyników eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Standaryzowane przygotowanie emulsji antygen/adiuwant jest kluczowe dla powtarzalnej indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), który stanowi podstawowy model przedkliniczny w poszukiwaniu leków na stwardnienie rozsiane. Ta metoda oparta na homogenizacji minimalizuje zmienność zależną od operatora, wspierając rzetelną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Niezawodna jakość emulsji bezpośrednio wpływa na pewność predykcyjną i selekcję projektów w ramach programów badań nad autoimmunoterapią i immunoterapią.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia spójną indukcję EAE w celu funkcjonalnej walidacji celów w neuroimmunologii.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez standaryzację dostarczania antygenu i aktywacji immunologicznej.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną w modelach przedklinicznych istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia selekcję portfolio poprzez zapewnienie reprodukowalnych wyników biologicznych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane emulsje do późniejszych etapów procesów immunizacji.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analiz w ramach poszczególnych badań.
- Umożliwia ilościową ocenę wielkości cząstek i stabilności emulsji.
- Wspiera skalowalne i transferowalne protokoły dla badań prowadzonych w wielu ośrodkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica indukcję modelu EAE z translacyjnymi punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację zmienności między partiami.
- Zmniejsza ryzyko decyzji dotyczących rozwoju projektu dzięki dostarczeniu solidnych i powtarzalnych modeli choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda homogenizacji znajduje zastosowanie na styku wczesnej fazy odkrywania i rozwoju modeli przedklinicznych, wspierając procesy badawcze od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Standaryzuje podawanie antygenu/adiuwantu w badaniach nad aktywacją odpornościową opartych na hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne emulsje do wiarygodnej oceny związków lub preparatów biologicznych w modelach EAE.
- Analityka: Umożliwia ilościową analizę wielkości cząstek i monitorowanie stabilności w celu kontroli jakości.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność modelu choroby w badaniach nad biomarkerami i skutecznością.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, niezależny od operatora protokół, który można dostosować do innych modeli autoimmunologicznych i immunoterapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niepewność mechanistyczną w badaniach nad modelami autoimmunologicznymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne przygotowanie emulsji w obrębie zespołów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację zmienności eksperymentalnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze immunologii i neurostanów zapalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza techniczna w zakresie obsługi homogenizatora i oceny jakości emulsji.
- Niezbędny jest dostęp do homogenizatorów wstrząsowych, mikroskopii kontrastowej oraz analizatorów wielkości cząstek do kontroli jakości.
- Wymagana jest standaryzacja obliczeń reagentów i protokołów postępowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych antygenów i adiuwantów dla różnych modeli autoimmunologicznych lub immunoterapii.
- Ograniczenia praktyczne obejmują początkowe inwestycje w sprzęt oraz przestrzeganie protokołu w celu zapewnienia powtarzalności.
