Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki

Protokół ten obejmuje testowanie w czasie rzeczywistym skuteczności przeciwbakteryjnej antybiotyków eluowanych z urządzenia polimerowego, co może pomóc w dokładnym określeniu skutecznych preparatów zwiększających ich wartość translacyjną. Metoda ta umożliwia testowanie skuteczności przeciwbakteryjnej w czasie rzeczywistym w celu monitorowania aktywności podłużnej materiałów uwalniających leki oraz zrozumienia zakresu aktywności przeciwbakteryjnej dla danej formuły implantu. Ten polimerowy materiał jest stosowany w ponad 90% wszystkich endoprotez stawów jako powierzchnia nośna.

A te preparaty uwalniające antybiotyki są opracowywane jako możliwe metody leczenia infekcji stawów okołoprotezowych. Metoda ta może być stosowana z dowolnym urządzeniem uwalniającym leki, takim jak porowate metale, degradowalne i niedegradowalne polimery, żele i ewentualnie materiały w postaci cząstek stałych z modyfikacjami protokołu specyficznymi dla materiału. Na początek hoduj bakterie przez noc w jednym mililitrze tryptycznego bulionu sojowego.

Następnie rozcieńczyć zawiesinę bakterii wyhodowanych przez noc w sterylnym bulionie Muellera Hintona lub MHB i zweryfikować liczbę żywotnych bakterii za pomocą jednostek luminescencji przed rozpoczęciem eksperymentu, jak opisano w manuskrypcie. Umieść paski UHMWPE z pierwszego tłoczenia i zawierające lek w trzymililitrowej strzykawce. Następnie wciągnąć zawiesinę bakteryjną zawierającą MHB do strzykawki przez dołączoną igłę do oznaczenia 1,5 mililitra.

Umieścić zestaw strzykawki w inkubatorze z wytrząsaniem do wskazanego punktu czasowego wynoszącego sześć godzin, a następnie codziennie do siódmego dnia. Po każdym wskazanym punkcie czasowym wyjmij zestaw strzykawki i dozuj pożywkę do dwumililitrowej probówki. Wykonaj test żywotności mikrobiologicznej w czasie rzeczywistym, jak opisano w manuskrypcie, używając 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej.

Po określeniu liczby żywotnych bakterii oblicz jednostki tworzące kolonie na mililitr z jednostek luminescencji, używając odpowiedniej krzywej standardowej. Aby zweryfikować brak żywych bakterii w próbkach, które wykazały wartości luminescencji poniżej granicy wykrywalności, rozprowadź kulturę na tryptycznych płytkach sojowych. Inkubuj płytki w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie następnego dnia sprawdź obecność kolonii. Pozostałą zawiesinę bakteryjną odwirować. Delikatnie zassać zużytą pożywkę.

Pozostaw 100 mikrolitrów supernatantu w probówkach z niewidocznymi granulkami. Zawiesić granulowane bakterie w świeżym MHB. Wirować przez 10 sekund, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie.

Następnie pobrać zawiesinę bakteryjną do tej samej strzykawki przez dołączoną igłę. Rozpocznij od pobrania pierwotnych i obciążonych lekiem powierzchni UHMWPE ze strzykawki po zakończeniu badania w siódmym dniu. Następnie przenieś powierzchnie do 1,5-mililitrowych probówek i spłucz trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego PBS.

Sonikować powierzchnię przez 40 minut w jednym mililitrze sterylnego PBS. Określić żywotność bakterii przylegających, wykonując test luminescencji na 100 mikrolitrach próbki poddanej sonikacji. Uwalnianie leku z wankomycyny i UHMWPE obciążonego gentamycyną wykazało gwałtowne uwalnianie po sześciu godzinach, po którym następowała stała szybkość uwalniania o stężeniu większym niż minimalne stężenie hamujące przez siedem dni.

UHMWPE z wankomycyną i gentamycyną wykazało ponad trzy logarytmiczne zmniejszenie podatnego ATCC 12600 począwszy od sześciu godzin, a całkowite wyeliminowanie zaobserwowano w trzecim dniu. W przypadku szczepu L1163 wrażliwego na gentamycynę i pośredniego wankomycyny, oba materiały uwalniające leki spowodowały redukcję o więcej niż trzy log po sześciu godzinach i nie zaobserwowano wzrostu kolonii w pierwszym dniu. Elucja gentamycyny z UHMWPE nie wpłynęła na żywotność bakterii szczepu L1101 opornego na gentamycynę i pośredniego wankomycynę.

Wręcz przeciwnie, wymycie wankomycyny z UHMWPE znacznie zmniejszyło żywotność bakterii po sześciu godzinach. Powierzchnie zarówno gentamycyny, jak i UHMWPE uwalniającego wankomycynę nie wykazały żadnych żywotnych bakterii przylegających po wystawieniu na wrażliwe i średnio odporne szczepy po siódmym dniu. Jednak niektóre żywe bakterie były obecne na uwalniającym gentamycynę UHMWPE wystawionym na działanie opornego na gentamycynę L1101.

Powierzchnia kontrolnego pierwotnego polietylenu wykazała żywotne bakterie przylegające po wystawieniu na działanie każdego szczepu. Oddzielenie zużytych pożywek w każdym punkcie czasowym, ułatwiające przenoszenie populacji drobnoustrojów, ma kluczowe znaczenie dla symulacji długotrwałego narażenia na antybiotyki. Chociaż jest to ulepszenie metod statycznych, ta półstatyczna metoda symulacyjna może być kontynuowana przez ciągłą konfigurację w celu lepszego zrozumienia kinetyki działania nowych preparatów leków przeciwko infekcjom.

Protokół umożliwił nam uchwycenie wpływu elucji leku na dynamikę bakterii zależną od szczepu. Wzbogaca ona narzędzia do oceny skuteczności urządzeń do długotrwałego podawania antybiotyków.