Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Sieci NET przyciągnęły ostatnio uwagę, ale ilościowe określenie sieci NET in vivo okazało się wyzwaniem. Protokół ten zapewnia pożądaną, wysoce czułą i cenną metodę badania charakterystyki NET w warunkach klinicznych. Technika ta powinna zostać rozszerzona w celu oceny nasilenia sepsy lub septycznego ARDS, zespołu ostrej niewydolności oddechowej.

Powszechnie przyjmuje się, że regulacja wysypisk lub wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniami jest kluczem do poprawy stanu klinicznego sepsy. Największą zaletą tej metody jest dokładne określenie ilościowe krążących pozostałości NET, takich jak DNA mieloperoksydazy i DNA elastazy neutrofilowej, w krótkim czasie. Zaleca się wirowanie próbek przed oznaczeniem i unikanie wielokrotnego rozmrażania.

Ważne jest, aby przestrzegać czasów inkubacji podanych w protokole. Zacznij od rozcieńczenia świeżo wyizolowanych wielojądrzastych neutrofili do 10 000 komórek na mililitr w wolnym od czerwieni fenolu RPMI 1640. Przesiej je w 35-milimetrowych naczyniach hodowlanych.

Aby indukować zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET, najpierw stymuluj wielojądrzaste neutrofile za pomocą 25 nanomolowych PMA. Następnie częściowo strawić pułapki zewnątrzkomórkowe, dodając 0,6 mikrograma na mililitr DNazy I i inkubować mieszaninę przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj pięciomilimolowy EDTA, aby zatrzymać aktywność DNazy i zbierz pożywkę zawierającą zsyntetyzowane NET.

Odwirować, aby usunąć resztki komórek. Zbierz supernatanty z czterech zdrowych grup kontrolnych. Mieszać, przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania.

Odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonej antymieloperoksydazy zawierającej 0,05 mikrograma przeciwciała na płytkę ELISA. Teraz przykryj płytkę samoprzylepną plastikową osłoną, aby zapobiec parowaniu próbki, i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wiązanie przeciwciał wychwytujących. Następnego dnia wyrzuć rozcieńczony roztwór przeciwciała z dołków i odpipetuj 300 mikrolitrów roztworu do płukania do każdej studzienki.

Osusz talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar PBS. Zablokuj każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami buforu blokującego. Przykryj go samoprzylepną plastikową osłoną i zatkaj studzienki, inkubując go.

Po wyrzuceniu roztworu blokującego ze studzienek i umyciu płytki trzy do czterech razy, osusz ją ręcznikiem papierowym. Następnie odpipetuj 25 mikrolitrów osocza do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby. I rozcieńczyć go 75 mikrolitrami PBS, dzięki czemu końcowa objętość studzienki wynosi 100 mikrolitrów.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do ślepej próby. Wymieszać próbki, umieszczając płytkę na wytrząsarce na 10 sekund z prędkością 250 obr./min w temperaturze pokojowej. Dodać dwa mikrolitry 100 całkowicie rozcieńczonej DNazy I do wszystkich studzienek i umieścić szczelnie zamkniętą płytkę na wytrząsarce na 10 sekund, aby dokładnie wymieszać próbki.

Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję DNazy. Następnie umieść szczelnie zamkniętą płytkę na wytrząsarce na 15 sekund, aby dokładnie wymieszać próbki.

Na koniec inkubować płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić składnikom białkowym NET przyłączenie się do przeciwciał wychwytujących. Następnego dnia wyrzuć roztwór ze studzienek. Po wielokrotnym płukaniu studzienek należy odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała anty-DNA sprzężonego z peroksydazą do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę przez 1 1/2 godziny, a następnie wyrzuć roztwór do studzienek. Po trzykrotnym umyciu studzienek, należy odpipetować 100 mikrolitrów roztworu substratu ABTS do każdej studzienki i inkubować zapieczętowaną płytkę na wytrząsarce w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 50 mikrolitrów dwumolowego kwasu siarkowego.

Wymieszaj zawartość studzienki, ostrożnie stukając w boki talerza. Następnie podłącz czytnik mikropłytek do komputera i uruchom aplikację. Na pasku stanu utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę.

Następnie ustaw parametry odczytu płytki, wybierając Absorbancja jako typ odczytu, Punkt końcowy jako tryb odczytu i dwie jako długości fal. Następnie ustaw lambda jeden na 405 nanometrów, lambda dwa na 490 nanometrów. Teraz wybierz stan Wyłączony zarówno dla Automiksu, jak i Wygaszania, pozostawiając Autokalibrację jako Włączoną.Następnie wybierz opcję Przeczytaj całą płytę w obszarze Paski.

Na koniec ustaw priorytet długości fali kolumny z Normalna jako prędkość kareki, a następnie wybierz opcję Wyłącz w obszarze Autoread. Umieść talerz w szufladzie na instrumenty i zamknij ją. Kliknij na Odczyt, aby tabliczka została natychmiast odczytana.

Odczytać absorbancję każdego dołka przy 405 nanometrach i przeprowadzić automatyczne odejmowanie absorbancji pożywki testowej od wszystkich nieznanych próbek. Wiarygodne wzorcowe krzywe kalibracyjne uzyskano zarówno dla MPO-DNA, jak i NE-DNA, gdy wartości absorbancji nie przekraczały odpowiednio 0,93 i 0,9. Najwyższy OD uzyskano po zastosowaniu 0,6 mikrograma na mililitr DNazy I.

Współczynniki zmienności między testami dla kompleksów w zdrowych osobach kontrolnych wynosiły odpowiednio 1,871 i 0,987, podczas gdy pacjenci z COVID-19 wykazywali współczynniki zmienności odpowiednio 2,532 i 2,010. Średnie współczynniki zmienności między testami dla MPO-DNA i NE-DNA wynosiły odpowiednio 6,524 i 4,389. Swoistość przeciwciał wychwytujących wobec kompleksów MPO-DNA i NE-DNA wykazała, że przeciwciała kontrolne typu ISO w niewielkim stopniu reagowały na kompleksy.

Odsetek obu kompleksów był wyższy w osoczu pacjentów z COVID-19 w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Czas trawienia DNazy powinien być zoptymalizowany, w przeciwnym razie nadmierne trawienie zmniejszy wchłanianie.