Name: Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę ELISA typu kanapkowego do kwantyfikacji kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z pułapek neutrofili. Ta metoda umożliwia dokładne badanie NETs w kontekście sepsy i ostrej niewydolności oddechowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Huq Muhammadowi Aminulowi za pomoc w recenzowaniu manuskryptu.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez instytucjonalne komisje rewizyjne Uniwersytetu Medycznego w Aichi (2017-H341, 2019-H137). Od każdego uczestnika uzyskano pisemną świadomą zgodę.
1. Przygotowanie odczynnika
UWAGA: Aby przeprowadzić test ELISA typu sandwich, odczynniki są przygotowywane w sposób opisany poniżej.
<ol>
	<li>Bufor do powlekania:
	<ol>
		<li>Aby uzyskać bufor węglanowo-wodorowęglanowy o stężeniu 0,1 mol/l, należy odważyć 10,6 g bezwodnego węglanu sodu (masa cząsteczkowa 106 g/mol) i 8,4 g wodorowęglanu sodu (masa cząsteczkowa 84 g/mol).</li>
		<li>Dodaj go do około 900 ml wody destylowanej w zlewce.</li>
		<li>Dostosować pH buforu do 9,6, dodając wymaganą ilość rozcieńczonego kwasu solnego lub wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Sprawdź pH za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Następnie dodaj wymaganą objętość wody destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 1,000 ml.</li>
		<li>Przechowywać bufor węglanowo-wodorowęglanowy o stężeniu 0,1 mol/l w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor blokujący:
	<ol>
		<li>Dodać około 250 μl 20% azydku sodu i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 70 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) złożonej ze 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na2HPO4, 2,68 mmol/L KCl i 1,47 mol/L KH2PO4 (pH 7,4) i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Dodaj wodę destylowaną, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml. Końcowe stężenia albuminy surowicy bydlęcej i azydku sodu wynoszą odpowiednio 1% i 0,05%. Odczekaj 10 minut, a następnie roztwór jest gotowy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór myjący: Przygotować 0,5% eteru tert-oktylofenoksyetoksyetanolu t-oktylofenylowego glikolu polietylenowego (Triton X-100) w wodzie destylowanej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100% Triton X-100 do 10% wodą destylowaną i odstawić 10% roztwór na 1 dzień przed użyciem.</li>
		<li>Następnie ponownie rozcieńczyć 10% roztwór Triton X-100 20-krotnie wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie 0,5%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenie przeciwciał:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące (przeciwciało anty-MPO [1 mg/ml] lub przeciwciało anty-NE [1 mg/ml]) w stosunku 1:2 000 w buforze otoczkowym (pH 9,6) przed użyciem w 1. dniu testu (patrz poniżej), a przeciwciało wykrywające (przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą) do 1:40 z PBS przed użyciem w 3. dniu testu (patrz poniżej). 
		UWAGA: W eksperymencie wstępnym rozcieńczyć przeciwciała typu izo (królik IgG [5 mg/ml] i mysi klon IgG1 Ci4 [0,5 mg/ml]) do 1:10 000 i 1:1 000 w buforze powlekającym (pH 9,6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór substratu ABTS: W zależności od liczby próbek rozpuścić jedną, dwie lub trzy tabletki kwasu 2,2'-azyno-bis(3 etylobenzotiazolino-6-sulfonowego (ABTS) w 5 ml, 10 ml lub 15 ml buforu ABTS (zawierającego nadboran sodu, kwas cytrynowy i wodorofosforan disodowy); na próbkę potrzeba 100 μl. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 2-8 °C, chronić przed światłem. Roztwór jest stabilny do 3 miesięcy.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Izolacja plazmy:
	<ol>
		<li>Pobrać 4 ml próbek krwi obwodowej do probówki do pobierania krwi z heparyną litową przez nakłucie żyły strzykawką 22 G i odwirować przy 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do probówki z bezpiecznym zamkiem o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Ponownie odwirować supernatant przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek.</li>
		<li>Zebrać supernatant do nowej probówki z bezpiecznym zamknięciem, nie naruszając osadu znajdującego się na dnie probówki.</li>
		<li>Otrzymane osocze należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
		UWAGA: Aby uzyskać wyniki o wysokiej przepustowości za pomocą tego testu, wymagane są próbki dobrej jakości. Jeśli używane są próbki osocza, należy przeprowadzić drugie wirowanie w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek. Należy unikać wielokrotnego rozmrażania próbek. Użyj heparyny jako antykoagulantu, ponieważ EDTA wpływa na aktywność DNazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja wielojądrzastych neutrofili
	<ol>
		<li>Pobrać próbki krwi obwodowej do probówki do pobierania krwi z heparyną litową przez nakłucie dożylne strzykawką 22 G.</li>
		<li>Warstwę 6 ml krwi na 6 ml jednoetapowych polimorfów i odwirować probówki o sile 1000 x g przez 45 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Zbierz trzecią warstwę kożucha zawierającą neutrofile i umyj ją trzykrotnie w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić neutrofile w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 zawierającym 2 mM L-glutaminę uzupełnioną 6% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i policzyć komórki w polu mikroskopu za pomocą hemocytometru. 
		UWAGA: Ta metoda daje czystość od 96% do 98% przy żywotności większej niż 95%, co oceniano przez wykluczenie barwnika błękitu trypanowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja wielojądrzastych neutrofili i NETozy in vitro
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć świeżo wyizolowane neutrofile wielojądrzaste do 1 × 105 komórek/ml w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 zawierającym 2 mM L-glutaminę uzupełnioną 6% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i wysiewać je w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Aby indukować NET, stymulować wielojądrzaste neutrofile za pomocą 25 nM PMA przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2/95% powietrzu.</li>
		<li>Po 4 godzinach inkubacji częściowo roztrawić NET, dodając 0,6 μg/ml DNazy I bezpośrednio do szalek hodowlanych przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymać aktywność DNazy I, dodając 5 mM EDTA.</li>
		<li>Zebrać pożywkę zawierającą zsyntetyzowane sieci NET i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.</li>
		<li>Otrzymać supernatanty z czterech zdrowych prób kontrolnych, wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Neutrofile stymulowane PMA trawione przez DNazę uzyskane z czterech zdrowych grup kontrolnych są używane jako standard NET1,14,15. Wygeneruj krzywą kalibracyjną z seryjnie rozcieńczonego wzorca NET za pomocą PBS i przypisz wartości gęstości optycznej (OD) uzyskane z nierozcieńczonego wzorca NET jako 100% NET.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda oznaczania
UWAGA: Kroki do przeprowadzenia testu są szczegółowo opisane poniżej.
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Nałożyć łącznie 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-MPO lub anty-NE zawierającego 0,05 μg przeciwciała do każdego dołka płytki, w tym do studzienki ślepej. 
		UWAGA: Bufor powlekający nie może zawierać żadnego rodzaju detergentu, ponieważ w przeciwnym razie przeciwciała mogą nie wiązać się równomiernie i płynnie ze ściankami każdej studzienki. Aby zapobiec efektowi haczyka, stężenie białka otoczki nie może przekraczać 20 μg/ml, ponieważ stężenia powyżej tego poziomu nasycą większość dostępnych miejsc na płytce do mikromiareczkowania. Typowy zakres stężeń roztworów do powlekania białek wynosi 2-10 μg/ml. Do wstępnego eksperymentu należy użyć rozcieńczonego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG królika do powlekania zamiast specyficznych przeciwciał monoklonalnych przeciwko MPO. Do powlekania należy użyć rozcieńczonego mysiego przeciwciała kontrolnego IgG1 przeciwko swoistemu przeciwciału monoklonalnemu przeciwko NE.</li>
		<li>Przykryć płytkę przylepną osłoną z tworzywa sztucznego, aby zapobiec parowaniu próbki, i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić związanie przeciwciał wychwytujących.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Wyrzuć rozcieńczony roztwór przeciwciała ze studzienek, a następnie odpipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.</li>
		<li>Usuń nadmiar PBS, stukając płytką do sucha o ręcznik papierowy.</li>
		<li>Zablokować każdą studzienkę płytki ELISA 200 μl buforu blokującego.</li>
		<li>Przykryj płytkę szczelnie samoprzylepną plastikową osłoną i inkubuj ją przez 1,5-2 godziny w temperaturze pokojowej, aby zatkać studzienki.</li>
		<li>Całkowicie wyrzuć roztwór blokujący ze studzienek, a następnie odpipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.</li>
		<li>Usuń nadmiar PBS, stukając płytką do sucha o ręcznik papierowy.</li>
		<li>Nałożyć łącznie 25 μl osocza lub pożywki na każdą studzienkę z wyjątkiem studzienki ślepej i dodać 75 μl PBS jako rozcieńczalnik, aby uzyskać końcową objętość 100 μl; dodać 100 μl PBS do studzienki ślepej próby.</li>
		<li>Następnie mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 10 s, umieszczając płytkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Nałożyć 2 μl 100-krotnie rozcieńczonej DNazy I (0,03 mg/ml) do każdej studzienki, w tym do studzienki ślepej (końcowe stężenie DNazy I w mieszaninie reakcyjnej: 0,6 μg/ml).</li>
		<li>Uszczelnić płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i dokładnie mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 10 s, umieszczając płytkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min. 
		UWAGA: Aby ocenić optymalne warunki trawienia DNA, podczas opracowywania testu, inkubowaliśmy próbki zawierające DNA związane z MPO od pacjentów z COVID-19 z 0-0,9 μg/ml DNazy I przez 15 minut w RT i użyliśmy płytek pokrytych specyficznym przeciwciałem wychwytującym dla MPO lub dopasowanym gatunkowo przeciwciałem kontrolnym ISO.</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zdejmij samoprzylepną plastikową osłonę i nałóż 1 μl 0,5 M EDTA do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję DNazy.</li>
		<li>Ponownie uszczelnij płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i potrząsaj nią z prędkością 15 sekund w temperaturze pokojowej, umieszczając ją na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić składnikom białkowym NET przyłączenie się do przeciwciał wychwytujących.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Zdejmij samoprzylepną plastikową osłonę i wylej roztwór z dołków.</li>
		<li>Całkowicie wylać roztwór ze studzienek, a następnie odpipetować 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórzyć tę procedurę mycia trzy do czterech razy.</li>
		<li>Do każdej studzienki należy nałożyć łącznie 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-DNA sprzężonego z peroksydazą.</li>
		<li>Szczelnie uszczelnić płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i inkubować ją przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Całkowicie wyrzuć roztwór ze studzienek, a następnie pipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.</li>
		<li>Ostrożnie usuń pozostały roztwór.</li>
		<li>Nałóż łącznie 100 μl roztworu podłoża ABTS na każdą studzienkę i przykryj płytkę samoprzylepną plastikową osłoną.</li>
		<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min. 
		UWAGA: Monitoruj płytkę w odstępach 5-minutowych, aż do uzyskania żądanych odczytów OD.</li>
		<li>Dodaj w sumie 50 μl 2 M kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję.</li>
		<li>Wymieszaj płynną zawartość studzienek, ostrożnie stukając w bok talerza.</li>
		<li>Włącz czytnik mikropłytek i podłącz go do komputera.</li>
		<li>Otwórz aplikację na komputerze.</li>
		<li>Na pasku stanu utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę.</li>
		<li>Ustaw wszystkie następujące parametry do odczytu płyty: Typ odczytu, Absorbancja; Tryb odczytu, punkt końcowy; Długości fal, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatyczne mieszanie i wygaszanie przed, wyłączone; Płyta wstępnie odczytana, wyłączona; Automatyczna kalibracja, włączona; Paski, Przeczytaj całą płytę; Priorytet długości fali kolumny, priorytet kolumny; Prędkość przewozu, normalna; i Odczyt automatyczny, Wył.</li>
		<li>Następnie włóż 96-dołkową płytkę zawierającą próbki do szuflady i zamknij ją.</li>
		<li>Na koniec wybierz przycisk Odczyt, aby płyta została natychmiast odczytana.</li>
		<li>Odczytać absorbancję każdej studzienki przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek (na tym etapie należy użyć długości fali 490 nm jako odniesienia).</li>
		<li>Wykonaj automatyczne odejmowanie wartości absorbancji samego podłoża testowego od wszystkich nieznanych próbek i zapisz dane. 
		UWAGA: Użyj krzywej wzorcowej uzyskanej z seryjnie rozcieńczonego wzorca NET, aby obliczyć względne stężenie NET w próbce1,14,15. Tutaj końcowe wyniki są przedstawione jako "Kompleksy MPO lub NE-DNA (% standardu NET)". Granicę wykrywalności (LOD) obliczono na podstawie odchylenia standardowego (SD) i nachylenia krzywej kalibracyjnej (S) w następujący sposób: LOD = 3,3(SD/S).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Statystyki
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej. Tutaj użyto SigmaPlot v14.5. Wartości procentowe i zmienne ciągłe są wyświetlane jako mediana z przedziałem międzykwartylowym ze względu na skośny rozkład większości parametrów.</li>
	<li>Porównaj poziomy MPO-DNA i NE-DNA w osoczu między pacjentami z COVID-19 a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej za pomocą testu sumy rang Wilcoxona. Użyj analizy korelacji, aby zbadać związek między gęstością optyczną a procentem standardu NET.</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li>
<li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes%3A+Friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Sørensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li>
<li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196(2016).</li>
<li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497(2022).</li>
<li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+extracellular+trap+%28NET%29+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587(2017).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424(2020).</li>
<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999(2020).</li>
<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Wszystkie dane wygenerowane i/lub przeanalizowane podczas tego badania są zawarte w tym opublikowanym artykule. Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opisaliśmy metodę sandwich ELISA, w której MPO lub NE wiąże się z jednym miejscem wychwytu przeciwciała podczas początkowej inkubacji próbek zawierających kompleksy MPO-DNA lub NE-DNA. Po umyciu "kanapkę" uzupełnia się inkubacją próbek z przeciwciałem monoklonalnym anty-DNA związanym z peroksydazą. Po usunięciu niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego, związany koniugat peroksydazy jest wykrywany przez dodanie chromogennego substratu peroksydazy ABTS, który daje rozpuszczalny produkt końcowy, który można odczytać spektr...

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego określania powstawania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w płynach biologicznych za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich (ELISA) do wykrywania kompleksów mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE) za pomocą DNA1,2. NET składają się ze szkieletu DNA ozdobionego proteazami przeciwdrobnoustrojowymi pochodzącymi z granulek neutrofili3,4. Zarówno kompleksy MPO-DNA, jak i NE-DNA są ważnymi i specyficznymi składnikami NET i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej jako produkty rozpadu NETs3,4. 
Oprócz ich ważnej fizjologicznej roli w obronie przeciwdrobnoustrojowej3, NET mają również różne patologiczne skutki4,5, w tym promowanie trombogenezy6 i pogorszenie sepsy7. W związku z tym ostatnio coraz większą uwagę zyskują sieci NET. Niemniej jednak kwantyfikacja in vivo NET okazała się trudna ze względu na brak czułej, wiarygodnej metody oznaczania ilościowego. 
Dostępnych jest kilka metod, w tym bezpośredni pomiar NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej8,9 i cytometria przepływowa10 oraz pośredni pomiar krążącego bezkomórkowego DNA, nukleosomów i cytrulinowanego histonu H3, ale każda metoda ma swoje zalety i ograniczenia11. Chociaż mikroskopowa metoda immunofluorescencyjna jest specyficzna dla NET i wyraźnie pokazuje lokalizację i stopień powstawania NET, próbki są ograniczone do tkanek biopsyjnych i wydzielanych materiałów. Co więcej, metoda ta musi być wykonywana przez wykwalifikowanych badaczy i wymaga długiego czasu na uzyskanie wyników. Pomiar poziomów krążących składników związanych z NET za pomocą cytometrii przepływowej jest łatwy i szybko dostarcza wyników; jednak metoda nie jest specyficzna dla NETs12.
My13 i inni1,2 opracowali wysoce czuły i niezawodny test do pomiaru krążących składników NET, DNA sprzężonego MPO lub NE, w ludzkim osoczu za pomocą zmodyfikowanej techniki ELISA, która wykorzystuje specyficzne przeciwciała dla MPO lub NE jako przeciwciała wychwytujące i przeciwciało wykrywające specyficzne dla DNA. Test ten może być również stosowany ex vivo do identyfikacji składników NET w supernatantach hodowli komórkowych uwalnianych przez aktywowane neutrofile w odpowiedzi na stymulację 12-mirystynianianem forbolu 13-octanu (PMA).

<table><tbody><tr><td>1-etapowe polimorfy</td><td>Dokładna korporacja chemiczna i naukowa</td><td>AN221725</td><td>izolacji PMN z ludzkiej krwi.</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td>płaski denny</td></tr><tr><td>roztwór buforowy ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Zawiera nadboran sodu, kwas cytrynowy i wodorofosforan disodowy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tabletki ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Każda tabletka zawiera 5 mg substratu ABTS i 60 mg substancji nośnikowych.</td></tr><tr><td>Samoprzylepna osłona z tworzywa sztucznego, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MPO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I Przechowywać</td><td>w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza przez 1 rok. Gatunkiem żywiciela jest królik.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NE, klon AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza. stabilny przez 1 rok. Gatunkiem żywiciela jest mysz.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Nauki biomedyczne</td><td>BR-220700081</td><td>Albumina z frakcji bydlęcej V. Przechowywać pod adresem 2&ndash; 8 & st. C. stabilny przez 2 lata.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Sklep przy -20 & deg; C</td></tr><tr><td>IgG, królik, Kontrola izotypu</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Przechowywać w postaci stężonego roztworu w temperaturze 2&ndash; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>IgG1, kontrola izotypu myszy, klon Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>Przechowywać w postaci stężonego roztworu w temperaturze 2&ndash; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi z heparyną litową</td> Mikser mikropłytek <td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jako jedna korporacja</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Dowolny czytnik płytek mikropłytkowych zdolny do odczytu długości fal od 405&ndash; Można użyć 490 nm.</td></tr><tr><td>Aplikacja czytnika mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą, Wykrywanie śmierci komórki ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; Butelka 2. Przechowuj pod adresem 2&ndash; 8 & st. C. stabilny przez 1 rok.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Aktywacja PMN z ludzkiej krwi.</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Stabilny przez 6 miesięcy.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>t-oktylofenoksypolietylen t-oktylofetylowy, eter tert-oktylofenylowy glikolu</td><td>polietylenowego Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-dna i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu elisa typu kanapkowego

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Niektóre bodźce, takie jak mikroorganizmy, powodują, że neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET), które są zasadniczo strukturami przypominającymi sieć, składającymi się z DNA z ziarnistymi białkami, takimi jak mieloperoksydaza (MPO) i elastaza neutrofilowa (NE) oraz białka cytoplazmatyczne i cytoszkieletowe. Chociaż zainteresowanie NET ostatnio wzrosło, nie jest dostępna żadna czuła, wiarygodna metoda testowa do pomiaru NET w warunkach klinicznych. W artykule opisano zmodyfikowany test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymami kanapkowymi do ilościowego pomiaru dwóch składników krążących NET, kompleksów MPO-DNA i NE-DNA, które są specyficznymi składnikami NET i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej jako produkty rozpadu NET. W teście wykorzystuje się specyficzne przeciwciała monoklonalne dla MPO lub NE jako przeciwciała wychwytujące i przeciwciało wykrywające specyficzne dla DNA. MPO lub NE wiąże się z jednym miejscem wychwytywania przeciwciała podczas początkowej inkubacji próbek zawierających kompleksy MPO-DNA lub NE-DNA. Test ten wykazuje dobrą liniowość i wysoką precyzję między testami i wewnątrz testów. Zastosowaliśmy go u 16 pacjentów z COVID-19 z towarzyszącym zespołem ostrej niewydolności oddechowej i stwierdziliśmy, że stężenia MPO-DNA i NE-DNA w osoczu były znacznie wyższe niż w osoczu uzyskanym od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Ten test detekcyjny jest wiarygodną, wysoce czułą i użyteczną metodą badania charakterystyki NET w ludzkim osoczu i supernatantach hodowlanych.

W tej metodzie zastosowano kanapkowy test ELISA z przeciwciałami monoklonalnymi anty-MPO, anty-NE i anty-DNA w celu pomiaru ilości DNA powiązanego z MPO oraz DNA powiązanego z NE (Rysunek 1). W tej metodzie do studzienek płytki mikrotytrazcyjnej naniesiono przeciwciała monoklonalne specyficzne dla MPO lub NE, aby wychwycić MPO i NE powiązane z DNA, a także MPO i NE niepowiązane z DNA. Aby obliczyć wewnątrztestowy współczynnik zmienności (CV), wykonano pomiary powtórzone na tej samej płytce d...

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Sieci NET przyciągnęły ostatnio uwagę, ale ilościowe określenie sieci NET in vivo okazało się wyzwaniem. Protokół ten zapewnia pożądaną, wysoce czułą i cenną metodę badania charakterystyki NET w warunkach klinicznych. Technika ta powinna zostać rozszerzona w celu oceny nasilenia sepsy lub septycznego ARDS, zespołu ostrej niewydolności oddechowej.Powszechnie przyjmuje się, że regulacja wysypisk lub wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniami jest kluczem do poprawy stanu klinicznego sepsy. Największą zaletą tej metody jest dokładne określenie ilościowe krążących pozostałości NET, takich jak DNA mieloperoksydazy i DNA elastazy neutrofilowej, w krótkim czasie. Zaleca się wirowanie próbek przed oznaczeniem i unikanie wielokrotnego rozmrażania.Ważne jest, aby przestrzegać czasów inkubacji podanych w protokole. Zacznij od rozcieńczenia świeżo wyizolowanych wielojądrzastych neutrofili do 10 000 komórek na mililitr w wolnym od czerwieni fenolu RPMI 1640. Przesiej je w 35-milimetrowych naczyniach hodowlanych.Aby indukować zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET, najpierw stymuluj wielojądrzaste neutrofile za pomocą 25 nanomolowych PMA. Następnie częściowo strawić pułapki zewnątrzkomórkowe, dodając 0,6 mikrograma na mililitr DNazy I i inkubować mieszaninę przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj pięciomilimolowy EDTA, aby zatrzymać aktywność DNazy i zbierz pożywkę zawierającą zsyntetyzowane NET.Odwirować, aby usunąć resztki komórek. Zbierz supernatanty z czterech zdrowych grup kontrolnych. Mieszać, przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania.Odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonej antymieloperoksydazy zawierającej 0,05 mikrograma przeciwciała na płytkę ELISA. Teraz przykryj płytkę samoprzylepną plastikową osłoną, aby zapobiec parowaniu próbki, i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wiązanie przeciwciał wychwytujących. Następnego dnia wyrzuć rozcieńczony roztwór przeciwciała z dołków i odpipetuj 300 mikrolitrów roztworu do płukania do każdej studzienki.Osusz talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar PBS. Zablokuj każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami buforu blokującego. Przykryj go samoprzylepną plastikową osłoną i zatkaj studzienki, inkubując go.Po wyrzuceniu roztworu blokującego ze studzienek i umyciu płytki trzy do czterech razy, osusz ją ręcznikiem papierowym. Następnie odpipetuj 25 mikrolitrów osocza do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby. I rozcieńczyć go 75 mikrolitrami PBS, dzięki czemu końcowa objętość studzienki wynosi 100 mikrolitrów.Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS do ślepej próby. Wymieszać próbki, umieszczając płytkę na wytrząsarce na 10 sekund z prędkością 250 obr./min w temperaturze pokojowej. Dodać dwa mikrolitry 100 całkowicie rozcieńczonej DNazy I do wszystkich studzienek i umieścić szczelnie zamkniętą płytkę na wytrząsarce na 10 sekund, aby dokładnie wymieszać próbki.Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję DNazy. Następnie umieść szczelnie zamkniętą płytkę na wytrząsarce na 15 sekund, aby dokładnie wymieszać próbki.Na koniec inkubować płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić składnikom białkowym NET przyłączenie się do przeciwciał wychwytujących. Następnego dnia wyrzuć roztwór ze studzienek. Po wielokrotnym płukaniu studzienek należy odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała anty-DNA sprzężonego z peroksydazą do każdej studzienki.Inkubuj płytkę przez 1 1/2 godziny, a następnie wyrzuć roztwór do studzienek. Po trzykrotnym umyciu studzienek, należy odpipetować 100 mikrolitrów roztworu substratu ABTS do każdej studzienki i inkubować zapieczętowaną płytkę na wytrząsarce w ciemności. Zatrzymaj reakcję, dodając 50 mikrolitrów dwumolowego kwasu siarkowego.Wymieszaj zawartość studzienki, ostrożnie stukając w boki talerza. Następnie podłącz czytnik mikropłytek do komputera i uruchom aplikację. Na pasku stanu utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę.Następnie ustaw parametry odczytu płytki, wybierając Absorbancja jako typ odczytu, Punkt końcowy jako tryb odczytu i dwie jako długości fal. Następnie ustaw lambda jeden na 405 nanometrów, lambda dwa na 490 nanometrów. Teraz wybierz stan Wyłączony zarówno dla Automiksu, jak i Wygaszania, pozostawiając Autokalibrację jako Włączoną.Następnie wybierz opcję Przeczytaj całą płytę w obszarze Paski.Na koniec ustaw priorytet długości fali kolumny z Normalna jako prędkość kareki, a następnie wybierz opcję Wyłącz w obszarze Autoread. Umieść talerz w szufladzie na instrumenty i zamknij ją. Kliknij na Odczyt, aby tabliczka została natychmiast odczytana.Odczytać absorbancję każdego dołka przy 405 nanometrach i przeprowadzić automatyczne odejmowanie absorbancji pożywki testowej od wszystkich nieznanych próbek. Wiarygodne wzorcowe krzywe kalibracyjne uzyskano zarówno dla MPO-DNA, jak i NE-DNA, gdy wartości absorbancji nie przekraczały odpowiednio 0,93 i 0,9. Najwyższy OD uzyskano po zastosowaniu 0,6 mikrograma na mililitr DNazy I.Współczynniki zmienności między testami dla kompleksów w zdrowych osobach kontrolnych wynosiły odpowiednio 1,871 i 0,987, podczas gdy pacjenci z COVID-19 wykazywali współczynniki zmienności odpowiednio 2,532 i 2,010. Średnie współczynniki zmienności między testami dla MPO-DNA i NE-DNA wynosiły odpowiednio 6,524 i 4,389. Swoistość przeciwciał wychwytujących wobec kompleksów MPO-DNA i NE-DNA wykazała, że przeciwciała kontrolne typu ISO w niewielkim stopniu reagowały na kompleksy.Odsetek obu kompleksów był wyższy w osoczu pacjentów z COVID-19 w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Czas trawienia DNazy powinien być zoptymalizowany, w przeciwnym razie nadmierne trawienie zmniejszy wchłanianie.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Poznaj zmodyfikowaną technikę ELISA typu kanapkowego do kwantyfikacji kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z pułapek neutrofili. Ta metoda umożliwia dokładne badanie NETs w kontekście sepsy i ostrej niewydolności oddechowej.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Przeglądaj więcej filmów