Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Podobnie jak w przypadku wszystkich pacjentów z mykoplazmą, ich rozpoznanie Mycoplasm pneumoniae jest trudne ze względu na reakcje krzyżowe. Proponowany przez nas test ELISA opiera się na selektywnym zubożaniu nieswoistych antygenów Mycoplasm pneumoniae przy użyciu techniki adsorpcji. Opisany w tym filmie test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość przestrzenną.

I rzeczywiście, okazało się, że jest to wiarygodny test przesiewowy do dokładnej diagnozy infekcji Mycoplasm pneumoniae. Kroki poprzedzające test ELISA zademonstruje Imen Chniba, doktorant. A etapem ELISA będzie Nadine Khadraoui, technik z naszego laboratorium.

Aby rozpocząć procedurę adsorpcji antygenu, należy pobrać 12 heterologicznych antygenów bakteryjnych do probówki mikrowirówkowej i dostosować stężenie białka odpowiadające połowie surowicy, która ma być zaadsorbowana. Następnie odwirować mieszaninę antygenu w temperaturze 14 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać osad. Następnie ponownie zawiesić osad z oczyszczonym poliklonalnym anty-Mycoplasma pneumoniae IgG i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z powolnym mieszaniem.

Pod koniec inkubacji ponownie odwirować zawiesinę w stężeniu 14 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odzyskać supernatant odpowiadający specyficznej surowicy poliklonalnej Mycoplasma pneumoniae. Aby pokryć 96-dołkową płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym, rozcieńczyć przeciwciało do 10 mikrogramów na mililitr i 0,1 molowego buforu wodorowęglanu węglanowego o pH 9,6. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała do każdej studzienki mikropłytki i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia usuń roztwór powlekający i umyj płytkę pięć razy buforem myjącym. Następnie zablokuj niezwiązane powierzchnie powlekanych studzienek, dodając 100 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki. Po jednogodzinnej inkubacji płytki w temperaturze pokojowej, należy usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety i umyć płytkę, jak pokazano wcześniej.

Dodać równą ilość całych białek Mycoplasma pneumoniae o stężeniu 10 nanogramów na studzienkę i pozostawić reakcję antygen-przeciwciało na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć nadmiar antygenu i umyć płytkę, jak pokazano. Następnie rozcieńczyć próbki testowe surowicy ludzkiej i odwołać się do dodatnich i ujemnych kontroli surowicy.

Następnie dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonych próbek testowych i kontrolnych do odpowiednich studzienek i duplikatów. Oznaczyć studzienki niezawierające ani antygenu, ani surowic jako puste. Po inkubacji płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej usunąć roztwór surowicy i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.

Pobrać pipetę 100 mikrolitrów odpowiednich rozcieńczonych przeciwciał detekcyjnych sprzężonych z enzymami do każdego dołka i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po usunięciu niezwiązanych ciał detekcyjnych i umyciu płytki, dodaj 100 mikrolitrów roztworu TMB Chromogen, aby uwidocznić wiązanie antygen-przeciwciało. Pozwól talerzowi rozwijać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów 7,5% kwasu siarkowego. Na koniec odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek i posortuj wyniki na podstawie obliczenia wskaźnika pozytywności. Analiza immunoblot między niezaadsorbowaną surowicą poliklonalną Mycoplasma pneumoniae a heterologicznymi antygenami bakteryjnymi wykazała reaktywność krzyżową, ale z różną intensywnością.

Na przykład antygeny Mycoplasma gallisepticum i Mycoplasma imitans wykazywały najsilniejszą reaktywność, mimo że były to mykoplazmy ptaków. W przeciwieństwie do tego, żaden z dwóch ludzkich izolatów klinicznych Ureaplasma urealyticum nie wykazał żadnej reakcji. Jednak antygeny pozostałych gatunków mykoplazm ludzkich narządów płciowych i inne antygeny bakteryjne powodowały znaczne reakcje krzyżowe z surowicą.

Analiza immunoblot potwierdziła skuteczność adsorpcji surowicy poliklonalnej przeciwciał Mycoplasma pneumoniae przeciwko heterologicznym antygenom bakteryjnym. Procedura adsorpcji wyeliminowała wszystkie reakcje krzyżowe, dzięki czemu surowica odpornościowa Mycoplasma pneumoniae stała się specyficzna dla wszystkich kolejnych testów serologicznych i immunoblottingowych. Co więcej, zestaw surowic ludzkich testowanych przy użyciu testu ELISA wychwytywania antygenu opracowany w tym badaniu okazał się dodatni dla Mycoplasma pneumoniae IgG z dobrą swoistością.

Specyficzność tego testu ELISA jest zapewniona głównie przez technikę adsorpcji, ponieważ podstawowe jest staranne wykonanie tego krytycznego kroku i powtórzenie go co najmniej dwa lub trzy razy. Zasada tej techniki może być stosowana do diagnozowania innych gatunków mykoplazmy lub ogólnie innych bakterii. Jednak wybór antygenów bakteryjnych do adsorpcji powinien być nieistotny i odpowiedni.