Name: Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj metodę ELISA wychwytującą antygen do diagnostyki Mycoplasma pneumoniae z zastosowaniem techniki adsorpcji eliminującej reakcje krzyżowe. Ta niezawodna metoda zapewnia wysoką specyficzność w badaniach serologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez tunezyjskie Ministerstwo Zdrowia oraz tunezyjskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych.

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z etycznymi aspektami ustalonymi przez komisję etyczną Instytutu Pasteura w Tunisie.
1. Etapy pre-ELISA: Wymagania wstępne i wstępne przetwarzanie
<ol>
	<li>Szczepy bakteryjne i pożywki wzrostowe 
	UWAGA: Gatunki Mollicutes i bakterie o ściankach użyte w niniejszym badaniu oraz ich podłoża wzrostowe są wymienione w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Wzrost gatunków Mollicutes
		<ol>
			<li>Zaszczepić 200 μl z zapasu glicerolu każdego gatunku w 1 800 μl pożywki.</li>
			<li>Gatunki Mollicutes należy uprawiać statycznie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2-4 dni, aż do zaobserwowania zmiany pH (wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa).</li>
			<li>Zwiększ rozcieńczenie kultur do 10 ml, dodając 1/10 rozcieńczenia kultury do pożywki i pozwól im ponownie rosnąć w tych samych warunkach. 
			UWAGA: W zależności od metabolizmu, niektóre ludzkie gatunki Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium i M. fermentans) zakwaszają pożywkę w wyniku fermentacji glukozy, a inne (M. hominis i Ureaplasma) alkalizują pożywkę odpowiednio przez hydrolizę argininy lub hydrolizę mocznika. Jeśli chodzi o ptasie mykoplazmy, zakwaszenie pożywki Freya wskazuje na obecność M. gallisepticum, podczas gdy jego alkalizacja dowodzi wzrostu M. imitans.</li>
			<li>Rozprowadź 50 μl kultur na płytkach agarowych, aby potwierdzić wzrost bakterii. Utrzymywać płytki agarowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i regularnie obserwować je pod mikroskopem pod kątem pojawienia się typowych kolonii jaj sadzonych (Mycoplasmas) i ciemnych kolonii jeżowców (Ureaplasmas).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wzrost gatunków innych niż Mollicutes
		<ol>
			<li>Wyhodować bakterie inne niż Mollicutes w 3 ml pożywki w temperaturze 37 °C przez noc (wstrząsając z prędkością 200 obr./min).</li>
			<li>Porównaj zmętnienie kultur z pożywką kontrolną, aby potwierdzić wzrost.</li>
			<li>Zwiększ rozcieńczenie kultur do 10 ml, dodając 1/100 rozcieńczenia kultury do pożywki i pozwól im ponownie rosnąć w tych samych warunkach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie antygenu
	<ol>
		<li>Preparat antygenowy z gatunków Mollicutes
		<ol>
			<li>Zebrać całe białka (obecne w potwierdzonych kulturach M. pneumoniae i innych gatunków Mollicutes) przez odwirowanie w temperaturze 40 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Odrzucić supernatant i przemyć granulki trzykrotnie 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) przez serię trzech wirowań w tych samych warunkach.</li>
			<li>Zawiesić każdy antygen w 500 μl PBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparat antygenowy z gatunków innych niż Mollicutes
		<ol>
			<li>Odwirować wyhodowane przez noc kultury bakterii innych niż Mollicutes w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut.</li>
			<li>Zawiesić każdą osadkę bakteryjną w 500 μl PBS. 
			UWAGA: Stężenie białka określa się przy użyciu klasycznej metody kwantyfikacji Bradforda z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem21. Stężenie białka w gatunkach Mollicutes zwykle waha się między 0,7-4,8 mg/ml. W przypadku innych gatunków bakterii stężenie białka może osiągnąć 20 mg/ml. Wszystkie antygeny są przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu ich późniejszego użycia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe reaktywności krzyżowej za pomocą immunoblottingu
	<ol>
		<li>Denaturować białka bakteryjne przez zmieszanie 8 μl każdego antygenu z równą objętością buforu próbki (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glicerolu [v/v], 10% SDS [w/v] i 0,2% błękitu bromofenolowego), inkubować mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Denaturację przeprowadza się w celu pokrycia białek ładunkiem ujemnym i rozbicia ich struktur drugorzędowych, co pozwala im przepłynąć przez żel poliakrylamidowy i rozdzielić je zgodnie z ich masą cząsteczkową.</li>
		<li>Poddaj zdenaturowane białka (100 μg białka/studzienkę) elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE) metodą Laemmliego22 z 12% żelem rozdzielającym i 5% żelem do układania. Następnie przenieś białka elektroforetycznie do membrany nitrocelulozowej za pomocą metody Towbina i wsp.23.</li>
		<li>Zanurz membranę nitrocelulozową w 5% odtłuszczonym mleku w PBS na 30 minut, aby zablokować wolne powierzchnie. Inkubować bloty białkowe w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z poliklonalną surowicą króliczą M. pneumoniae (wyprodukowaną w Instytucie Pasteura w Tunisie) rozcieńczoną do 1/200 w PBS-Tween 20, a następnie z anty-króliczą IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczoną do 1/2000 w PBS-Tween 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmyć niezwiązane przeciwciała PBS i uzyskać wyniki, wystawiając arkusz nitrocelulozy na działanie roztworu substratu (4-chloro-1-naftol,H2O2). Zatrzymaj reakcję, dodając wodę po 5-15 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura adsorpcji 
	UWAGA: W celu wyeliminowania reakcji krzyżowych między poliklonalną surowicą odporności M. pneumoniae a antygenami bakterii heterologicznych, stosuje się procedurę adsorpcji opisaną wcześniej przez Bena Abdelmoumena i Roya24.
	<ol>
		<li>Przygotuj pulę antygenów 12 heterologicznych bakterii (podejrzewa się, że dzielą antygeny z M. pneumoniae), wymieszaj ją w probówce do mikrowirówki i dostosuj stężenie białka odpowiadające połowie surowicy, która ma być zaadsorbowana w doświadczeniu. 
		UWAGA: Objętość i stężenie różnią się w zależności od różnych testów. Ten etap zależy głównie od stężenia przeciwciała, które ma być adsorbowane. Na przykład, jeśli stężenie przeciwciał = 3,56 mg/ml, stężenie puli antygenów (składającej się z 12 bakterii heterologicznych) powinno wynosić 1,78 mg/ml (a więc około 0,148 mg każdego antygenu).</li>
		<li>Odwirować mieszaninę antygenu przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zebrać zebrany osad i inkubować go z oczyszczonym poliklonalnym anty-M. pneumoniae IgG przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z powolnym mieszaniem.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować zawiesinę o stężeniu 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant (który odpowiada specyficznej poliklonalnej surowicy odpornościowej M. pneumoniae). 
		UWAGA: Aby zapewnić swoistość poliklonalnej surowicy przeciw M. pneumoniae, należy powtórzyć procedurę adsorpcji trzy razy. Przed zastosowaniem w teście ELISA, zaadsorbowana poliklonalna surowica odpornościowa M. pneumoniae powinna zostać przetestowana przez immunoblotting pod kątem braku reakcji krzyżowych przeciwko dołączonemu zestawowi bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etapy ELISA: Sam test
<ol>
	<li>Powlekanie mikropłytką przeciwciałem wychwytującym
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące (wstępnie zaadsorbowaną surowicę poliklonalną M. pneumoniae) do stężenia 10 μg/ml w 0,1 M buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6).</li>
		<li>Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA, dodając 100 μl rozcieńczonego przeciwciała wychwytującego do każdej studzienki.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji w temperaturze 4 °C usunąć roztwór powlekający i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem płuczącym (skład [na l]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g tiomersalu i 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Zablokować pozostałe powierzchnie wiążące powlekanych studzienek, dodając 100 μl roztworu blokującego (0,5% kazeiny w PBS) do każdego dołka.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety i umyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie antygenu
	<ol>
		<li>Dodać równą ilość całych białek M. pneumoniae do wszystkich powlekanych studzienek (10 ng/basenik).</li>
		<li>Pozostawić reakcję na 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć nadmiar roztworu antygenu i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem myjącym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosowanie badanych próbek i kontroli
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki testowe (surowice ludzkie) i kontrolne (surowice referencyjne dodatnie i ujemne) do 1/200, 1/400 i 1/800 w PBS-Tween 20.</li>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczonych próbek i próbek kontrolnych do odpowiednich studzienek. Każdą reakcję należy przeprowadzić w dwóch egzemplarzach. Oznaczyć studzienki niezawierające ani antygenu, ani surowic jako puste.</li>
		<li>Po inkubacji płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej usunąć roztwory surowicy i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie przeciwciała detekcji sprzężonego z enzymem
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała detekcyjne sprzężone z enzymami, przeciwciała anty-królicze sprzężone z HRP i anty-ludzkie IgG do 1/10 000 w PBS-Tween 20.</li>
		<li>Do każdej studzienki należy pobrać pipetą 100 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała wykrywającego.</li>
		<li>Po inkubacji płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, usunąć niezwiązane przeciwciała wykrywające i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie i analiza danych
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu chromogenu 3,3', 5,5' tetrametylobenzydyny (TMB), aby uwidocznić wiązanie antygen-przeciwciało.</li>
		<li>Pozostawić płytkę do rozwinięcia się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (7,5%H2SO4), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
		<li>Odczytaj absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i posortuj wyniki na podstawie obliczenia wskaźnika dodatniości (IP). 
		IP = Absorbancja badanej surowicy / Absorbancja punktu odcięcia 
		IP < 0,7: Wynik negatywny 
		IP = 0,7: Test należy powtórzyć w ciągu 2 tygodni 
		IP > 0,7: Wynik pozytywny 
		UWAGA: Wzór IP jest opracowywany w laboratorium, a wartość 0,7 jest ustalana po optymalizacji. Dla powtarzających się reakcji oblicza się średnią wartość absorbancji. Optymalne rozcieńczenie surowicy i stężenie antygenu ustala się metodą miareczkowania ELISA w szachownicę (dane nie są pokazane). Wartość graniczna = OD (gęstość optyczna) dodatniej surowicy referencyjnej (rozcieńczonej w tym samym rozcieńczeniu co próbka). Ten OD powinien być co najmniej trzy razy wyższy niż wartość OD kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Etapy po teście ELISA: ocena wyników i walidacja testu
<ol>
	<li>Zdolność wewnętrznego testu ELISA do specyficznego diagnozowania zakażenia M. pneumoniae u badanych pacjentów jest oceniana za pomocą dodatkowych immunoblotów przy użyciu antygenów M. pneumoniae i bakterii heterologicznych w celu potwierdzenia dodatniości badanych surowic ludzkich w przeciwciałach M. pneumoniae i ich negatywności w innych podejrzanych bakteriach (dane nie pokazane).</li>
</ol>

<ol><li>Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+and+pathogenicity+of+mycoplasmas%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).</li>
<li>Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infections+of+man%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infections of man.</a> The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).</li>
<li>Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae%3A+Usual+suspect+and+unsecured+diagnosis+in+the+acute+setting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting.</a> The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).</li>
<li>Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cytadhesion+of+Mycoplasma+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).</li>
<li>Waldo, R. H., Krause, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+stability%2C+and+function+of+cytadhesin+P1+and+accessory+protein+B%2FC+complex+of+Mycoplasma+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).</li>
<li>Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+and+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections.</a> Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).</li>
<li>Narita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+extrapulmonary+manifestations+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+with+special+reference+to+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).</li>
<li>Kashyap, S., Sarkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumonia%3A+Clinical+features+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+India%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management.</a> Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+versus+serology+for+diagnosing+Mycoplasma+pneumoniae+infection%3A+A+systematic+review+%26+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis.</a> Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).</li>
<li>Saraya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection%3A+Basics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Family+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection: Basics.</a> Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).</li>
<li>Jacobs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections%3A+a+critical+review+of+current+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).</li>
<li>Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection%3A+3.+Detection+of+IgM+antibodies+to+M.+pneumoniae+by+a+modified+indirect+haemagglutination+test%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test.</a> Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).</li>
<li>Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infections%3A+diagnosis+based+on+immunofluorescence+titer+of+IgG+and+IgM+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).</li>
<li>Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).</li>
<li>Van Griethuysen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+early+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.</a> European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).</li>
<li>Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay.</a> Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).</li>
<li>Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+cross-reactive+antibodies+to+mycoplasmas+in+human+sera+by+ELISA+and+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting.</a> Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).</li>
<li>Brunner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpectedly+high+frequency+of+antibody+to+Mycoplasma+pneumoniae+in+human+sera+as+measured+by+sensitive+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques.</a> Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).</li>
<li>Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+analysis+of+Mycoplasma+pneumoniae%3A+3.+Separation+and+chemical+identification+of+serological+active+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Experimental+Biology+and+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).</li>
<li>Ponka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+and+clinical+picture+of+serologically+verified+Mycoplasma+pneumoniae+infections+with+emphasis+on+central+nervous+system%2C+cardiac+and+joint+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations.</a> Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets.+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications.</a> Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+avian+mycoplasmas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Diseases%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture.</a> Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).</li>
<li>Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adsorption+procedure+to+increase+the+specificity+of+enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+lyme+disease+without+decreasing+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity.</a> Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).</li>
<li>Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+and+treatment+of+mycoplasmal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobics+and+Infectious+Disease+Newsletter%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections.</a> Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).</li>
<li>Meyer, R. D., Clough, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extragenital+Mycoplasma+hominis+infections+in+adults%3A+emphasis+on+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).</li>
<li>Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+host+specificity%3A+Fact+or+fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma host specificity: Fact or fiction.</a> Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).</li>
<li>Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+lipofaciens+transmission+to+veterinarian%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).</li>
<li>Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mycoplasma+species+from+a+patient+with+seal+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger.</a> Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).</li>
<li>Slack, M., P, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+role+of+Haemophilus+influenzae+in+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pneumonia%22%5BJournal%5D)">A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia.</a> Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).</li>
<li>Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Streptococcus+pyogenes%3A+public+health+risk+factors%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control.</a> Pathogens. 10 (2), 248(2021).</li>
<li>Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf">https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf</a> (2022).</li>
<li>Steinitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+the+blocking+effect+of+Tween+20+and+bovine+serum+albumin+in+ELISA+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells.</a> Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).</li>
<li>Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+mycoplasmas%3A+cultivation+and+vertebrate+pathogenicity+of+a+new+spiroplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma.</a> Science. 195 (4281), 892-894 (1977).</li>
<li>Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+medium+for+the+isolation+of+avian+mycoplasmas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">A medium for the isolation of avian mycoplasmas.</a> American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.

W artykule przedstawiono ogólny opis wewnętrznego testu ELISA, opracowanego głównie w celu zapewnienia specyficznych badań przesiewowych w kierunku zakażenia M. pneumoniae. Podano szczegółowe informacje na temat protokołu samego testu ELISA, a także niektórych etapów przetwarzania wstępnego i końcowego. Specyficzność tego testu zapewnia technika adsorpcji. Procedura ta została wcześniej opisana w testach ELISA opracowanych do diagnozowania mykoplazm ludzi i ptaków 17,24</sup...

Mykoplazmy należą do najmniejszych i najprostszych znanych prokariontów. Od innych bakterii odróżnia je przede wszystkim brak struktury ściany komórkowej. W związku z tym Mykoplazmy zostały sklasyfikowane w osobnej klasie o nazwie Mollicutes1. Niedobór ściany komórkowej nadaje tym mikroorganizmom wewnętrzną odporność na niektóre środki przeciwdrobnoustrojowe i jest w dużej mierze odpowiedzialny za ich polimorfizm. Mykoplazmy mają mały genom i zmniejszony rozmiar, co ogranicza ich zdolności metaboliczne i biosyntetyczne oraz wyjaśnia ich pasożytniczą i saprofityczną naturę1.
Mycoplasma pneumoniae jest jednym z Mykoplazm, które infekują człowieka i jest uważana za najbardziej zjadliwą2. M. pneumoniae kolonizuje górne drogi oddechowe, prowadząc do nietypowego zapalenia płuc u dzieci i młodych dorosłych. Objawy kliniczne wywołane zakażeniem M. pneumoniae są grypopodobne, z bólem głowy, gorączką i kaszlem3. Cytadherencja M. pneumoniae do komórek gospodarza jest pośredniczona przez organellę przyłączeniową, w tym główną adhezję P1 i kilka białek dodatkowych4,5. Więcej objawów klinicznych może wystąpić z powodu miejscowego stanu zapalnego i stymulacji układu odpornościowego gospodarza wynikającego z bliskiego przylegania M. pneumoniae do błony śluzowej dróg oddechowych6. Chociaż zapalenie płuc jest cechą charakterystyczną zakażenia M. pneumoniae, ujawniono, że zakażenie tą bakterią może być również odpowiedzialne za szerokie spektrum objawów pozapłucnych w różnych miejscach anatomicznych, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, serce, skóra i stawy7.
Jeśli chodzi o wszystkie gatunki Mycoplasma, diagnoza M. pneumoniae jest wyzwaniem. Objawy kliniczne wywołujące mykoplazmozę są w większości niewidoczne i niecharakterystyczne8. Ponieważ bardzo trudno jest zdiagnozować zakażenie M. pneumoniae, opierając się wyłącznie na objawach klinicznych i objawach, szczególnie interesujące są badania laboratoryjne9. Wykrywanie kolonii M. pneumoniae za pomocą hodowli jest złotą metodą prawidłowego diagnozowania. Jednak wybredne wymagania dotyczące wzrostu i długi czas potrzebny na dostarczenie ostatecznych wyników (1-2 tygodnie) komplikują hodowlę, a tym samym oznaczają, że rzadko jest ona używana do rutynowej diagnozy10. Technologie amplifikacji kwasów nukleinowych zostały zweryfikowane pod względem szybkości i wydajności, chociaż ze względu na ich stosunkowo wysoki koszt i niedostępność w niektórych placówkach opieki zdrowotnej, te techniki molekularne nie są uważane za testy diagnostyczne pierwszego rzutu. Prawdą jest, że komercyjne testy PCR są szeroko stosowane do diagnozowania zakażeń M. pneumoniae, ale nadal nie mogą zastąpić serologii. Ponadto częste występowanie zarówno wyników fałszywie ujemnych, jak i fałszywie dodatnich ograniczyło użycie PCR9. Rutynowo serologia pozostaje najbardziej praktykowana w laboratoriach w diagnostyce zakażenia M. pneumoniae. Od dziesięcioleci opisywanych jest kilka podejść serologicznych, takich jak zimne hemaglutyniny, test wiązania dopełniacza11, pośredni test hemaglutynacji12, immunofluorescencja13, oraz technologia ELISA, która została po raz pierwszy zastosowana w serologii mykoplazmy na początku lat 1980-tych14,15,16. Jednym z głównych problemów napotykanych podczas wykonywania serodiagnostyki ELISA zakażenia M. pneumoniae są reakcje krzyżowe, co znacznie obniża swoistość techniki. Wcześniej donoszono o niespecyficznej adsorpcji ludzkich surowic antygenami M. pneumoniae; w rzeczywistości wiele przeciwciał wykrytych przez test ELISA w surowicach ludzkich może nie zawsze być związanych z antygenami mykoplazmatycznymi17, ze względu na podobieństwo M. pneumoniae z niektórymi bakteriami18,19 oraz niektóre tkanki zwierzęce i ludzkie20.
Ze względu na wysokie odczyty tła obserwowane w konwencjonalnym teście ELISA, który był praktykowany w laboratorium, interpretacja wyników była często skomplikowana, a zatem dostarczenie właściwej diagnozy M. pneumoniae było trudnym zadaniem. Stawiając czoła temu problemowi, zdecydowaliśmy się na poprawę testu ELISA M. pneumoniae poprzez usunięcie niespecyficznych reakcji antygenów M. pneumoniae z przeciwciałami, które mają być badane. W tym celu pracowaliśmy nad selektywnym zubożeniem niespecyficznych antygenów M. pneumoniae za pomocą techniki adsorpcji. W rzeczywistości głównym celem testu ELISA wychwytującego antygen jest specyficzne wykrycie immunoglobuliny (Ig) G M. pneumoniae w próbkach ludzkiej surowicy. Koncepcja tego testu ELISA polega głównie na selektywnym wychwytywaniu antygenów specyficznych dla M. pneumoniae przed dodaniem próbek surowicy ludzkiej. Selektywność ta jest zapewniona przez inkubację surowego antygenu M. pneumoniae z poliklonalną surowicą odpornościową M. pneumoniae, wyprodukowaną u królików w laboratorium i nadanie mu specyficzności gatunkowej poprzez adsorpcję przeciwko panelowi bakterii heterologicznych, należących lub nienależących do klasy Mollicutes, dzielących antygeny z M. pneumoniae gatunki i/lub o których wiadomo, że kolonizują drogi oddechowe. Procedurę adsorpcji powtórzono trzykrotnie, a jej skuteczność w eliminowaniu reaktywności krzyżowej przetestowano za pomocą immunoblottingu. Opracowany test ELISA jest połączeniem testu ELISA typu sandwich i pośredniego. Krótko mówiąc, studzienki płytki ELISA są najpierw pokryte poliklonalną surowicą specyficzną dla M. pneumoniae. Następnie dodaje się antygen M. pneumoniae i wychwytuje go między surowicą a przeciwciałami obecnymi w próbce surowicy, która ma być poddana badaniu. Utworzony kompleks immunologiczny jest wykrywany przez drugorzędowe przeciwciało sprzężone z enzymem (IgG sprzężone z peroksydazą). Reakcje są wizualizowane przez dodanie substratu chromogenicznego, a absorbancja jest mierzona spektrofotometrycznie. Ten wewnętrzny test ELISA jest schematycznie przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Test ELISA domowej roboty okazał się skuteczny w wykrywaniu zakażenia M. pneumoniae i jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych testów w rutynowej diagnostyce.

<table><tbody><tr><td>4-chloro-1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788-50 TAB</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Bacto</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50 G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanowy węglanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50 Kazeina Cap</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078-1 KG</td><td></td></tr><tr><td>CMRL1066&nbsp;</td><td>VWR</td><td>P0058-N1L</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Difco PPLO Bulion</td><td>BD</td><td>255420</td><td>Frey media</td></tr><tr><td>Czytnik płytek ELISA</td><td>MULTISKAN GO, Thermo Scientific</td><td>Ref: 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Capricorn Scientific</td><td>FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka IgG sprzężona z peroksydazą kozią</td><td>Abcam</td><td>ab6759</td><td></td></tr><tr><td>IgG IgG Life sprzężone z peroksydazą kozią</td><td></td><td>656120</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 37%</td><td>Prolab</td><td>2025.290</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2), roztwór 30%</td><td>Scharlau</td><td>HI01361000</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Przygotowane w Instytucie Pasteura w Tunisie</td><td></td><td>Dostarczone przez laboratorium bakteriologii Instytutu Pasteura w Tunisie</td></tr><tr><td>Mycoplasma pneumoniae poliklonalna surowica wytwarzana u królika</td><td>Wyprodukowano w Instytucie Pasteura w Tunisie</td><td></td><td>Surowica została wyprodukowana w wyniku immunizacji królików w Instytucie Pasteura w Tunisie</td></tr><tr><td>Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004-10G</td><td></td></tr><tr><td>Płaska 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania Nunc Maxisorp z płaskim dnem&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G sodu (1 MIU)</td><td>PANPHARMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol red</td><td>fluka chemika</td><td>77660</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>MP Biomedicals</td><td>902887</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Novachim</td><td>PS02805</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4) 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311011</td><td></td></tr><tr><td>Tiomersal</td><td>USB</td><td>22215</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże TMB (3,3', 5,5' Roztwór tetrametylobenzydyny)</td><td>Abcam</td><td>ab142042</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6791-1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1379-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, proszek, Ultrapure</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J23547&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania mycoplasma pneumoniae

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae to prokariota z niedoborem ściany komórkowej, znana głównie z kolonizacji dróg oddechowych człowieka i endemiczna, ze szczytami epidemii co 6 lat, u starszych dzieci i młodych dorosłych. Rozpoznanie M. pneumoniae jest trudne ze względu na wybredny charakter patogenu i możliwość bezobjawowego nosicielstwa. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia M. pneumoniae na podstawie miareczkowania przeciwciał w próbkach surowicy pacjentów pozostaje najczęściej praktykowaną metodą. Ze względu na potencjalny problem immunologicznej reaktywności krzyżowej z użyciem surowicy poliklonalnej dla M. pneumoniae, opracowano test immunoenzymatyczny z wychwytywaniem antygenu (ELISA) w celu poprawy swoistości diagnostyki serologicznej. Płytki ELISA są pokryte poliklonalnymi przeciwciałami M. pneumoniae, hodowanymi u królików i swoistymi po adsorpcji przeciwko panelowi heterologicznych bakterii, które mają wspólne antygeny z gatunkami M. pneumoniae i/lub o których wiadomo, że kolonizują drogi oddechowe. Przereagowane antygeny homologiczne M. pneumoniae są następnie specyficznie rozpoznawane przez odpowiadające im przeciwciała w próbkach surowicy. Dalsza optymalizacja parametrów fizykochemicznych, którym poddawany jest test ELISA do wychwytywania antygenu, doprowadziła do uzyskania wysoce specyficznego, czułego i powtarzalnego testu ELISA.

aktywność immunoblottingowa nieadsorbowanych przeciwciał poliklonalnych Mycoplasma pneumoniae anty serum przeciwko bakteriom heterologicznym 
Reakcje krzyżowe rzeczywiście występują, co wykazano w wynikach immunoblottingu (Rysunek 2) i w porównaniu z kontrolą pozytywną (ścieżka 1), niektóre z *M. pneumoniae* antygeny są wspólne dla badanych bakterii. Intensywność tych reakcji krzyżowych była zmienna. Na przykład, M. ...

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae is a cell wall-deficient prokaryote, mainly known to colonize the human respiratory tract and to be endemic, with epidemic peaks ...

Podobnie jak w przypadku wszystkich pacjentów z mykoplazmą, ich rozpoznanie Mycoplasm pneumoniae jest trudne ze względu na reakcje krzyżowe. Proponowany przez nas test ELISA opiera się na selektywnym zubożaniu nieswoistych antygenów Mycoplasm pneumoniae przy użyciu techniki adsorpcji. Opisany w tym filmie test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość przestrzenną.I rzeczywiście, okazało się, że jest to wiarygodny test przesiewowy do dokładnej diagnozy infekcji Mycoplasm pneumoniae. Kroki poprzedzające test ELISA zademonstruje Imen Chniba, doktorant. A etapem ELISA będzie Nadine Khadraoui, technik z naszego laboratorium.Aby rozpocząć procedurę adsorpcji antygenu, należy pobrać 12 heterologicznych antygenów bakteryjnych do probówki mikrowirówkowej i dostosować stężenie białka odpowiadające połowie surowicy, która ma być zaadsorbowana. Następnie odwirować mieszaninę antygenu w temperaturze 14 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać osad. Następnie ponownie zawiesić osad z oczyszczonym poliklonalnym anty-Mycoplasma pneumoniae IgG i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z powolnym mieszaniem.Pod koniec inkubacji ponownie odwirować zawiesinę w stężeniu 14 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odzyskać supernatant odpowiadający specyficznej surowicy poliklonalnej Mycoplasma pneumoniae. Aby pokryć 96-dołkową płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym, rozcieńczyć przeciwciało do 10 mikrogramów na mililitr i 0,1 molowego buforu wodorowęglanu węglanowego o pH 9,6. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała do każdej studzienki mikropłytki i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia usuń roztwór powlekający i umyj płytkę pięć razy buforem myjącym. Następnie zablokuj niezwiązane powierzchnie powlekanych studzienek, dodając 100 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki. Po jednogodzinnej inkubacji płytki w temperaturze pokojowej, należy usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety i umyć płytkę, jak pokazano wcześniej.Dodać równą ilość całych białek Mycoplasma pneumoniae o stężeniu 10 nanogramów na studzienkę i pozostawić reakcję antygen-przeciwciało na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć nadmiar antygenu i umyć płytkę, jak pokazano. Następnie rozcieńczyć próbki testowe surowicy ludzkiej i odwołać się do dodatnich i ujemnych kontroli surowicy.Następnie dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonych próbek testowych i kontrolnych do odpowiednich studzienek i duplikatów. Oznaczyć studzienki niezawierające ani antygenu, ani surowic jako puste. Po inkubacji płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej usunąć roztwór surowicy i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.Pobrać pipetę 100 mikrolitrów odpowiednich rozcieńczonych przeciwciał detekcyjnych sprzężonych z enzymami do każdego dołka i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po usunięciu niezwiązanych ciał detekcyjnych i umyciu płytki, dodaj 100 mikrolitrów roztworu TMB Chromogen, aby uwidocznić wiązanie antygen-przeciwciało. Pozwól talerzowi rozwijać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów 7,5% kwasu siarkowego. Na koniec odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek i posortuj wyniki na podstawie obliczenia wskaźnika pozytywności. Analiza immunoblot między niezaadsorbowaną surowicą poliklonalną Mycoplasma pneumoniae a heterologicznymi antygenami bakteryjnymi wykazała reaktywność krzyżową, ale z różną intensywnością.Na przykład antygeny Mycoplasma gallisepticum i Mycoplasma imitans wykazywały najsilniejszą reaktywność, mimo że były to mykoplazmy ptaków. W przeciwieństwie do tego, żaden z dwóch ludzkich izolatów klinicznych Ureaplasma urealyticum nie wykazał żadnej reakcji. Jednak antygeny pozostałych gatunków mykoplazm ludzkich narządów płciowych i inne antygeny bakteryjne powodowały znaczne reakcje krzyżowe z surowicą.Analiza immunoblot potwierdziła skuteczność adsorpcji surowicy poliklonalnej przeciwciał Mycoplasma pneumoniae przeciwko heterologicznym antygenom bakteryjnym. Procedura adsorpcji wyeliminowała wszystkie reakcje krzyżowe, dzięki czemu surowica odpornościowa Mycoplasma pneumoniae stała się specyficzna dla wszystkich kolejnych testów serologicznych i immunoblottingowych. Co więcej, zestaw surowic ludzkich testowanych przy użyciu testu ELISA wychwytywania antygenu opracowany w tym badaniu okazał się dodatni dla Mycoplasma pneumoniae IgG z dobrą swoistością.Specyficzność tego testu ELISA jest zapewniona głównie przez technikę adsorpcji, ponieważ podstawowe jest staranne wykonanie tego krytycznego kroku i powtórzenie go co najmniej dwa lub trzy razy. Zasada tej techniki może być stosowana do diagnozowania innych gatunków mykoplazmy lub ogólnie innych bakterii. Jednak wybór antygenów bakteryjnych do adsorpcji powinien być nieistotny i odpowiedni.

antigen-capture-enzyme-linked-immunosorbent-assay-for-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Zestaw do wykrywania Mycoplasma metodą PCR LookOut wykorzystuje reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR), która jest uznawana za metodę z wyboru zapewniającą najwyższą czułość w wykrywaniu zanieczyszczeń Mycoplasma, Acholeplasma i Ureaplasma w hodowlach komórkowych oraz innych produktach biologicznych pochodzenia komórkowego.

Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Ten film demonstruje wykrywanie chemicznie sprzężonych kompleksów przeciwciało-antygen za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich, czyli ELISA. Przechwycone przeciwciało wiąże się ze specyficznym epitopem antygenu koniugatu przeciwciało-antygen, który można później uwidocznić za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem.

Test immunoenzymatyczny w celu weryfikacji chemicznie sprzężonych koniugatów przeciwciało-antygen

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Diagnoza zakażenia Eimeria u kurcząt pozostaje wymagająca. Podejścia oparte na morfologii pasożytów i patologii żywiciela są zwykle niejednoznaczne, podczas gdy podejścia molekularne oparte na PCR okazały się wymagające pod względem kosztów i wiedzy specjalistycznej. Celem tego protokołu jest ustanowienie amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jako prostej diagnostyki molekularnej infekcji eimeriana.

Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z...

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

Poznaj metodę ELISA wychwytującą antygen do diagnostyki Mycoplasma pneumoniae z zastosowaniem techniki adsorpcji eliminującej reakcje krzyżowe. Ta niezawodna metoda zapewnia wysoką specyficzność w badaniach serologicznych.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Przeglądaj więcej filmów