Name: Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Poznaj protokół obrazowania poklatkowego 3D dynamiki ściany komórkowej w mchu Physcomitrium patens przy użyciu barwnika kalkofluor. Metoda umożliwia wizualizację zmian grubości ścian komórkowych bez konieczności transformacji białek fluorescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Soucy Patricii i Betty Nunn z Uniwersytetu w Louisville za pomoc przy mikroskopie konfokalnym. Praca ta została sfinansowana przez National Science Foundation (1456884 do M.P.R.) oraz przez National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 do M.P.R.).

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla listy materiałów i sprzętu oraz Tabelę 1 dla listy rozwiązań, które mają być użyte w tym protokole.
1. Przygotowanie roślin do naczyń ze szklanym dnem
<ol>
	<li>Hoduj tkankę protonemalną mchu w podłożu agarowym BCDAT na 13 cm szalce Petriego w stałym białym świetle (~50 μmol m-2 s-1) przez 7 dni w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej.</li>
	<li>Filtruj i sterylizuj calcofluor white i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Odczynnik jest stabilny przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Rozproszyć 7-dniową tkankę mchu w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl wysterylizowanej wody. Upewnij się, że tkanka protonemalna mchu jest wystarczająco rozproszona w postaci małych kawałków w wodzie. W przypadku typu dzikiego (WT) użyj kleszczy, aby oddzielić protonemata; w przypadku mutanta GGB należy użyć pipety P-1000.</li>
	<li>Dodaj 10 μl wysterylizowanego białka kalkofluorowego do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i pozostaw mikroprobówkę pionowo w kapturze na 2 minuty w celu zabarwienia.</li>
	<li>Natychmiast po zabarwieniu wymieszaj rośliny z 200 μl schłodzonego BCDATG, zawierającego pożywkę BCDAT uzupełnioną 0,5% (w/v) glukozy i 0,4% (w/v) gumy gellan, pipetując pięciokrotnie pipetą P-1000. 
	UWAGA: Upewnij się, że podłoże BCDATG jest wystarczająco schłodzone (tuż przed zestaleniem się podłoża), aby uniknąć stresu dla roślin.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę zawierającą rośliny i pożywkę BCDATG do naczynia ze szklaną podstawą o średnicy 27 mm. Upewnij się, że objętość BCDATG do mieszania komórek nie przekracza 200 μl i że 200 μl BCDATG z próbkami jest równomiernie rozłożone na powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 7 mm w celu wytworzenia cienkiej warstwy filmu, tak aby próbki znajdowały się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania.</li>
	<li>Po zestaleniu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przykryj cienką warstwę 3 ml schłodzonego BCDATG i pozostaw na 10 minut, aby ponownie zastygł. 
	UWAGA: Upewnij się, że kroki 1.2-1.5 są wykonywane w sterylnym kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Na dnie naczynia narysuj dziewięć linii, każda w kierunku równoległym i prostopadłym (Rysunek 2). Zaznacz wiersze znakami od a do h i oznacz kolumny liczbami od 1 do 8. Użyj górnego, dolnego, prawego, środkowego i lewego, aby zaznaczyć pozycje w każdym kwadracie. Na przykład, jeśli roślina znajduje się w kwadracie w drugim rzędzie i szóstej kolumnie i jest umieszczona w lewej górnej części kwadratu, wówczas roślina ta otrzymuje nazwę "b6_upper_left".</li>
	<li>Naczynie ze szklanym dnem zawierające rośliny należy hodować pod czerwonym światłem przez 5 dni w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej, a następnie w świetle białym przez 1-2 dni, a następnie poddawać obrazowaniu poklatkowemu codziennie przez okres do 3 dni. W przypadku WT należy wstępnie wyhodować rośliny w słabym czerwonym świetle (0,5 μmol m-2 s-1) od góry przez 5 dni, aby wywołać odpowiedź fototropową protonematy, tak aby rośliny mogły przyczepić się do dna szalek11. 
	UWAGA: Słabe czerwone światło jest zapewniane przez przepuszczenie białego światła przez czerwony filtr z tworzywa akrylowego o grubości 3 mm do odpornych na światło pudełek. W przypadku mutantów ggb hodowla wstępna w czerwonym świetle jest opcjonalna, ponieważ mutanty ggb nie mają odpowiedzi fototropowej3.</li>
</ol>
2. Obrazowanie i rekonstrukcja 3D
<ol>
	<li>Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające rośliny na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego, ze szklanym dnem skierowanym w stronę obiektywu. Użyj mikroskopu konfokalnego do wizualizacji kalkofluoru za pomocą soczewki obiektywowej 20x. Rób zdjęcia laserem 405 nm, otworkiem przy 1,0, wzmocnieniem HV przy 100, regulacją przesunięcia tła na 0, mocą lasera 5%-7%, rozmiarem skanowania 1,024 x 1,024 i prędkością skanowania 1/2 klatki/s. Zbierz 17-30 sekcji optycznych serii Z o rozmiarze kroku 1,0 μm. Nazwij obrazy przy użyciu kodu w kroku 1.6, na przykład "b6_upper_left-day0", i zapisz.
	<ol>
		<li>Wybierz kanał DAPI w Acquisition (Akwizycja) i zaznacz pole Z (Z) w obszarze ND Acquisition (Akwizycja ND). Aby ustawić dolny i górny limit stosu Z, kliknij przyciski Góra i Dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zrekonstruować obrazy 3D, otwórz plik .nd2 (Rysunek 3A; patrz Spis materiałów) i kliknij Wolumin (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>
3. Obrazowanie tych samych roślin w różnych punktach czasowych
<ol>
	<li>Po każdym obrazowaniu włóż szklaną podstawę z powrotem do komory wzrostowej.</li>
	<li>Powtórz czynności od kroku 2.1 dla obrazowania i rekonstrukcji 3D. 
	UWAGA: Aby znaleźć te same rośliny, użyj kodu wymienionego w kroku 1.6 i nadaj nazwę "b6_upper_left-day1" lub "b6_upper_left-day2", w zależności od wieku roślin.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Naure+Plants%22%5BJournal%5D)">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li>
<li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+living+plant+cell%3A+From+probes+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang%2C+Y+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2010 (2), (2010).</li>
<li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li>
<li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li>
<li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+FM4-64%2C+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li>
<li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li>
<li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li>
<li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Poklatkowa rekonstrukcja 3D, czyli obrazowanie 4D, jest potężnym narzędziem do obserwacji dynamiki morfologii komórkowej podczas procesów rozwojowych. W tym protokole, poprzez zmieszanie bieli kalkofluorowej z pożywką, można zaobserwować dynamikę morfologii komórek 3D w mchu P. patens. Korzystając z tej metody, zaobserwowaliśmy, że powierzchnia ścian komórkowych w mutantach ggb jest rozrywana podczas rozwoju3. Co więcej, zmniejszone pogrubienie ścian komórkowych jest skorelowane ...

Ściany komórkowe roślin ulegają dynamicznym zmianom podczas ekspansji i rozwoju komórek1,2,3. Utrzymanie integralności ściany komórkowej ma kluczowe znaczenie dla adhezji komórek roślinnych podczas wzrostu i rozwoju, a także dla odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Chociaż wizualizacja dynamiki ściany komórkowej żywych komórek w długim okresie czasu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób adhezja komórek jest utrzymywana podczas rozwoju i adaptacji do zmian środowiskowych, obecne metody bezpośredniej obserwacji dynamiki ściany komórkowej są nadal trudne.
Obrazowanie poklatkowe zmian komórkowych może dostarczyć informacji o dynamice rozwoju organizmu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości4,5,6,7. Podczas gdy poklatkowe obrazowanie 3D ma ogromny potencjał do badania dynamicznych zmian kształtu komórki podczas wzrostu i rozwoju, technika ta zwykle wymaga transformacji białka fluorescencyjnego4,5,6,7. Jednak w przypadku większości systemów transformacje genetyczne są albo czasochłonne, albo trudne technicznie. Alternatywnie od dawna dostępne są barwniki fluorescencyjne, które przyczepiają się do składników komórkowych. Barwniki fluorescencyjne mogą emitować światło fluorescencyjne po naświetleniu światłem o określonej długości fali. Typowymi przykładami są Edu, DAPI, PI, FM4-64 i calcofluor white8,9,10. Jedną z głównych wad jest jednak to, że barwniki te mogą być zwykle używane tylko w utrwalonej tkance lub do krótkich eksperymentów, częściowo ze względu na szkody, jakie wyrządzają komórce8,9,10.
Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem, sygnały calcofluoru są stabilne, gdy biel calcofluor jest mieszana z podłożem podczas eksperymentów poklatkowych na mchu P. patens. Korzystając z tej metody, zaobserwowano oderwanie komórek w mutantach ggb za pomocą obrazowania poklatkowego 3D w okresie 3 dni3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Metodę tę można zastosować do wielu innych systemów, które zawierają ściany komórkowe i które mogą być barwione przez kalkofluor.

<table><tbody><tr><td>Filtr światła z tworzywa sztucznego czerwonego o grubości 3 mm</td><td>&nbsp; Mitsubishi</td><td>&nbsp; No.102</td><td></td></tr><tr><td>Miska ze szklaną podstawą o średnicy 27 mm&nbsp;</td><td>Iwaki</td><td>3930-035</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>A6924</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor biały&nbsp;</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>18909-100ML-F</td><td>Calcofluor White M2R, 1 g/L i Evans niebieski, 0,5 g/L</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>A1</td><td> NIS element software; .nd2 w przeglądarce NIS-elements, do pobrania z https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer </td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>TE200&nbsp;</td><td>Wyposażony w kamerę DS-U3;</td></tr><tr><td>Guma gellan&nbsp;</td><td>Nacali Tesque</td><td>12389-96</td><td></td></tr><tr><td>Komory do wzrostu roślin</td><td>SANYO&nbsp;</td><td>Sanyo MLR-350H</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka sterylizowana 0,22 &mu; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie poklatkowe 3d dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Obrazowanie poklatkowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na obserwację dynamicznych zmian wzrostu i rozwoju na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku obserwacji przez długi okres technika wymaga transformacji białka fluorescencyjnego; Jednak w przypadku większości systemów transformacja genetyczna jest albo czasochłonna, albo technicznie niedostępna. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół obrazowania poklatkowego 3D dynamiki ściany komórkowej w okresie 3 dni przy użyciu barwnika kalkofluorowego (który barwi celulozę w ścianie komórkowej rośliny), opracowanego w mchu Physcomitrium patens. Sygnał barwnika kalkofluorowego ze ściany komórkowej jest stabilny i może trwać przez 1 tydzień bez widocznego rozpadu. Za pomocą tej metody wykazano, że oderwanie komórek w mutantach ggb (w których podjednostka beta geranylgeranylotransferazy-I białka) jest spowodowane nieuregulowaną ekspansją komórek i wadami integralności ściany komórkowej. Co więcej, wzory barwienia kalkofluorem zmieniają się w czasie; Mniej intensywnie zabarwione regiony korelują z przyszłymi miejscami ekspansji/rozgałęzień komórek w typie dzikim. Metodę tę można zastosować do wielu innych systemów, które zawierają ściany komórkowe i które mogą być barwione przez kalkofluor.

Metoda ta pozwala na obserwację dynamiki ściany komórkowej podczas rozwoju u typu dzikiego oraz mutantów ggb (Rycina 1). Wyniki wykazały, że obszary o mniejszym pogrubieniu ściany komórkowej korelują z miejscami ekspansji/rozgałęziania komórek, co pozwala na przewidzenie miejsc ekspansji/rozgałęziania u typu dzikiego (Rycina 1A). Powierzchnia ścian komórkowych u mutantów ggb ulegała rozerwaniu podczas rozwoju w wyniku niekontrolowanej ekspansji...

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Obrazowanie poklatkowe z mikroskopią fluorescencyjną pozwala na obserwację dynamicznych zmian wzrostu i rozwoju na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Ten prosty protokół obrazowania poklatkowego 3D może bezpośrednio badać dynamikę ściany komórkowej przez długi czas. Protokół ten wykorzystuje barwnik kalkofluorowy do oznaczania dynamiki grubości ściany komórkowej, a zatem nie wymaga transformacji białka fluorescencyjnego.Sygnały kalkofluoru są stabilne i mogą utrzymywać się przez ponad tydzień. Metoda ta może być stosowana do wielu innych systemów o prostych strukturach zawierających ściany komórkowe i może być barwiona kalkofluorem, np. u roślin kwitnących. W tym protokole sygnały kalkofluoru są stabilne, gdy barwnik ten jest mieszany z podłożem podczas całego procesu obrazowania poklatkowego.Na początek rozprowadź siedmiodniową tkankę mchu w 1,5-mililitrowej mikroprobówce zawierającej 20 mikrolitrów wysterylizowanej wody. W przypadku typu dzikiego użyj kleszczy, aby oddzielić protonemata. W przypadku mutanta ggb należy oddzielić protonematy za pomocą pipety AP-1000.Dodaj 10 mikrolitrów wysterylizowanego calcofluor-white do mikroprobówki i pozostaw probówkę pionowo w kapturze na dwie minuty w celu zabarwienia. Natychmiast po barwieniu wymieszaj rośliny z 200 mikrolitrami schłodzonego BCDATG zawierającego pożywkę BCDAT, pipetując pięciokrotnie pipetą P1000 i przenieś mieszaninę do naczynia ze szklanej podstawy o średnicy 27 milimetrów. Upewnij się, że 200 mikrolitrów BCDATG z próbkami jest równomiernie rozłożone na powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 27 milimetrów, aby wytworzyć cienką warstwę folii, tak aby próbki znajdowały się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania.Po zestaleniu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przykryj cienką warstwę trzema mililitrami schłodzonego BCDATG i pozostaw na 10 minut do ponownego zestalenia. Na spodzie naczynia narysuj dziewięć linii, każda w kierunku równoległym i prostopadłym, a wiersze zaznacz znakami od A do H, a kolumny cyframi od jednego do ośmiu. Użyj górnego, dolnego, prawego, środkowego i lewego, aby zaznaczyć pozycje w każdym kwadracie.Na przykład, jeśli roślina znajduje się w kwadracie w drugim rzędzie, w szóstej kolumnie i jest umieszczona w lewej górnej części kwadratu, to roślina ta otrzymuje nazwę b6 w lewym górnym rogu. Umieść naczynie ze szklanym dnem w białym świetle na jeden do dwóch dni, a następnie poddaj je obrazowaniu poklatkowemu codziennie, przez okres do trzech dni. Aby zrekonstruować obrazy 3D, otwórz plik ND2 i kliknij przycisk wolumin.Zrekonstruuj ścianę komórkową w dniu zero, dniu pierwszym, trzecim i czwartym. Po zrobieniu każdego zdjęcia włóż szklane naczynie z powrotem do komory uprawy. Dynamiczne zmiany w ściankach poprzecznych wykazano za pomocą barwienia kalkofluorem białym w typie dzikim oraz mutantów ggb.W przypadku mutantów ggb białe przerywane linie poniżej każdego obrazu wskazują uszkodzoną ścianę komórkową powierzchni w rozszerzających się komórkach, a pomarańczowe linie wskazują komórki poniżej powierzchni ściany komórkowej w ggb. Różnice w sygnale kalkofluorowo-białym można wykryć na powierzchni komórek, a mniej zabarwione regiony wskazują na ekspansję komórek w mutantach ggb lub nowo rozgałęzionych miejscach w typie dzikim. W przypadku hodowli wstępnej typu dzikiego, rośliny w słabym czerwonym świetle z góry przez pięć dni są wymagane do wywołania reakcji fototropowych protonematów, tak aby rośliny mogły być przyczepione do dna naczyń, a rośliny mogły pojawić się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania, ponieważ kalkofluor-biały może być używany z innym barwnikiem, takim jak mikrosfera.Można również uzyskać dodatkowe informacje na temat ekspansji komórek. Dynamika ściany komórkowej roślin ma kluczowe znaczenie dla wydajnego wzrostu i rozwoju, a także dla odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Protokół ten pozwala na bezpośredni podział zmian w sygnałach ściany komórkowej i integrację.

3-d-time-lapse-imaging-cell-wall-dynamics-using-calcofluor-moss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.

Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Ten raport opisuje podstawowe metody używane do hodowli i eksperymentalnego manipulowania jednokomórkową streptophyte alg, Penium margaritaceum. Zapewnia również podstawowe protokoły obrazowania opartego na mikroskopii, w tym znakowanie żywych komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych i innych sond fluorescencyjnych oraz skaningową mikroskopię elektronową.

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

Poznaj protokół obrazowania poklatkowego 3D dynamiki ściany komórkowej w mchu Physcomitrium patens przy użyciu barwnika kalkofluor. Metoda umożliwia wizualizację zmian grubości ścian komórkowych bez konieczności transformacji białek fluorescencyjnych.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Przeglądaj więcej filmów