Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu
10 lutego 2023
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.
Obrazowanie poklatkowe z mikroskopią fluorescencyjną pozwala na obserwację dynamicznych zmian wzrostu i rozwoju na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Ten prosty protokół obrazowania poklatkowego 3D może bezpośrednio badać dynamikę ściany komórkowej przez długi czas. Protokół ten wykorzystuje barwnik kalkofluorowy do oznaczania dynamiki grubości ściany komórkowej, a zatem nie wymaga transformacji białka fluorescencyjnego.
Sygnały kalkofluoru są stabilne i mogą utrzymywać się przez ponad tydzień. Metoda ta może być stosowana do wielu innych systemów o prostych strukturach zawierających ściany komórkowe i może być barwiona kalkofluorem, np. u roślin kwitnących. W tym protokole sygnały kalkofluoru są stabilne, gdy barwnik ten jest mieszany z podłożem podczas całego procesu obrazowania poklatkowego.
Na początek rozprowadź siedmiodniową tkankę mchu w 1,5-mililitrowej mikroprobówce zawierającej 20 mikrolitrów wysterylizowanej wody. W przypadku typu dzikiego użyj kleszczy, aby oddzielić protonemata. W przypadku mutanta ggb należy oddzielić protonematy za pomocą pipety AP-1000.
Dodaj 10 mikrolitrów wysterylizowanego calcofluor-white do mikroprobówki i pozostaw probówkę pionowo w kapturze na dwie minuty w celu zabarwienia. Natychmiast po barwieniu wymieszaj rośliny z 200 mikrolitrami schłodzonego BCDATG zawierającego pożywkę BCDAT, pipetując pięciokrotnie pipetą P1000 i przenieś mieszaninę do naczynia ze szklanej podstawy o średnicy 27 milimetrów. Upewnij się, że 200 mikrolitrów BCDATG z próbkami jest równomiernie rozłożone na powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 27 milimetrów, aby wytworzyć cienką warstwę folii, tak aby próbki znajdowały się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania.
Po zestaleniu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przykryj cienką warstwę trzema mililitrami schłodzonego BCDATG i pozostaw na 10 minut do ponownego zestalenia. Na spodzie naczynia narysuj dziewięć linii, każda w kierunku równoległym i prostopadłym, a wiersze zaznacz znakami od A do H, a kolumny cyframi od jednego do ośmiu. Użyj górnego, dolnego, prawego, środkowego i lewego, aby zaznaczyć pozycje w każdym kwadracie.
Na przykład, jeśli roślina znajduje się w kwadracie w drugim rzędzie, w szóstej kolumnie i jest umieszczona w lewej górnej części kwadratu, to roślina ta otrzymuje nazwę b6 w lewym górnym rogu. Umieść naczynie ze szklanym dnem w białym świetle na jeden do dwóch dni, a następnie poddaj je obrazowaniu poklatkowemu codziennie, przez okres do trzech dni. Aby zrekonstruować obrazy 3D, otwórz plik ND2 i kliknij przycisk wolumin.
Zrekonstruuj ścianę komórkową w dniu zero, dniu pierwszym, trzecim i czwartym. Po zrobieniu każdego zdjęcia włóż szklane naczynie z powrotem do komory uprawy. Dynamiczne zmiany w ściankach poprzecznych wykazano za pomocą barwienia kalkofluorem białym w typie dzikim oraz mutantów ggb.
W przypadku mutantów ggb białe przerywane linie poniżej każdego obrazu wskazują uszkodzoną ścianę komórkową powierzchni w rozszerzających się komórkach, a pomarańczowe linie wskazują komórki poniżej powierzchni ściany komórkowej w ggb. Różnice w sygnale kalkofluorowo-białym można wykryć na powierzchni komórek, a mniej zabarwione regiony wskazują na ekspansję komórek w mutantach ggb lub nowo rozgałęzionych miejscach w typie dzikim. W przypadku hodowli wstępnej typu dzikiego, rośliny w słabym czerwonym świetle z góry przez pięć dni są wymagane do wywołania reakcji fototropowych protonematów, tak aby rośliny mogły być przyczepione do dna naczyń, a rośliny mogły pojawić się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania, ponieważ kalkofluor-biały może być używany z innym barwnikiem, takim jak mikrosfera.
Można również uzyskać dodatkowe informacje na temat ekspansji komórek. Dynamika ściany komórkowej roślin ma kluczowe znaczenie dla wydajnego wzrostu i rozwoju, a także dla odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Protokół ten pozwala na bezpośredni podział zmian w sygnałach ściany komórkowej i integrację.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy rękopis przedstawia szczegółowy protokół dotyczący 3D obrazowania time-lapse dynamiki ściany komórkowej w żywym tkankach mchu. Metoda umożliwia wizualizację oderwania ściany komórkowej w mutantach ggb oraz wzorców pogrubienia w dzikim typie mchu w trakcie rozwoju przez dłuższy okres.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Rozwój roślin
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Imageowanie time-lapse jest kluczowe dla obserwacji dynamiki komórkowej.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia szczegółową wizualizację procesów wzrostu.
- Barwnik calcofluor jest używany do barwienia ścian komórkowych bez konieczności transformacji białek fluorescencyjnych.
- Stałość sygnałów calcofluor poprawia wiarygodność obrazowania na przestrzeni czasu.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do obserwacji dynamiki ściany komórkowej w mchu.
- Badanie różnic w zachowaniu ściany komórkowej między mutantami ggb a dzikim typem mchu.
- Podanie metody zastosowania do innych układów roślinnych z ściankami komórkowymi.
Zastosowane metody
- 3D imageowanie time-lapse z wykorzystaniem mikroskopi fluorescencyjnej.
- Zastosowanie barwnika calcofluor do oznaczania dynamiki ściany komórkowej.
- Stałość sygnałów calcofluor utrzymana przez cały proces imageowania.
- Zastosowanie protokołu do różnych układów roślinnych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizację oderwania ściany komórkowej w mutantach ggb.
- Obserwację wzorców pogrubienia w dzikim typie mchu.
- Demonstrację zastosowania protokołu do innych struktur roślinnych.
- Potwierdzenie stabilności sygnałów calcofluor na przestrzeni długich okresów imageowania.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania dynamiki ściany komórkowej.
- Uzyskane wglądy mogą zwiększyć zrozumienie rozwoju roślin.
- Ta metoda może być przystosowana do zastosowania w różnych gatunkach roślin.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
