System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Transgeniczne danio pręgowane okazały się kluczowe dla naszego zrozumienia rozwoju zarodków. System Tol2 jest wszechstronnym narzędziem, które umożliwia naukowcom szybkie i systematyczne generowanie wielu transgenicznych danio pręgowanego do badań FASD. Modułowa konstrukcja i łatwość generowania nowych komponentów zestawu sprawiają, że system Tol2 jest wszechstronnym narzędziem do generowania nowych transgeników bez konieczności przeprojektowywania jakichkolwiek komponentów zestawu.

Moja rada dla badaczy stosujących tę technikę po raz pierwszy jest taka, aby przeprowadzili kilka próbnych prób, aby ćwiczyć się w precyzji generowania i wstrzykiwania konstruktów transgenicznych. Na początek zlinearyzuj plazmid zestawu Tol2 zawierający transpozazę za pomocą endonukleazy restrykcyjnej, łącząc 10 mikrolitrów plazmidu transporazy, 1,5 mikrolitra buforu reakcyjnego endonukleazy restrykcyjnej i 0,3 mikrolitra endonukleazy w probówce mikrowirówki o pojemności 500 mikrolitrów. Napełnij reakcję do 20 mikrolitrów wodą wolną od RNAse.

Wymieszaj i strawij w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przerwij trawienie, dodając do mieszaniny reakcyjnej jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA, dwa mikrolitry pięciomolowego octanu amonu i 80 mikrolitrów 100% etanolu. Wymieszaj i schłódź się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwirować i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu DNA w wodzie wolnej od RNAzy. Następnie określ liniowe stężenie plazmidu w nanogramach na mikrolitr na fluorometrze, uruchamiając dwa mikrolitry próbki. Skonfiguruj produkcję mRNA SP6, łącząc 10 mikrolitrów 2X NTP / CAP, dwa mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego, 0,1 do jednego mikrograma liniowej matrycy DNA w dwóch mikrolitrach mieszanki enzymów SP6 w probówce o pojemności 500 mikrolitrów.

Napełnij reakcję do 20 mikrolitrów wodą wolną od RNAzy i wymieszaj przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach dodaj jeden mikrolitr DNA, dobrze wymieszaj i inkubuj przez dodatkowe 15 minut. Zatrzymaj reakcję, dodając 30 mikrolitrów roztworu wytrącającego chlorek litu.

Wymieszaj i schłódź się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odwiruj roztwór, aby osadzać mRNA i odessać supernatant przed umyciem osadu jednym mililitrem 80% etanolu. Wysuszyć granulki na powietrzu i ponownie zawiesić je w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNAse.

Określ stężenie mRNA za pomocą fluorometru, a następnie podwielokrotność 100 nanogramów mRNA na probówkę do jednorazowego użytku i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić reakcję, zbierz po 10 femtomoli P5E, PME i P3E oraz 20 femtomoli docelowego wektora PDEST. Zidentyfikuj rozmiar wszystkich czterech wektorów i par zasad ze źródła plazmidu.

Po określeniu stężenia wszystkich czterech wektorów, używając masy DNA jako 660 gramów na mol oraz wielkości plazmidu i par zasad, oblicz łączną ilość nanogramów plazmidu potrzebnych do osiągnięcia 10 femtomoli dla wektorów wejściowych lub 20 femtomoli dla wektora docelowego. Następnie wygeneruj konstrukcję sox17:EGFP-CAAX przy użyciu komponentów opisanych w manuskrypcie. Korzystając ze stężenia plazmidu, oblicz całkowite mikrolitry każdego plazmidu potrzebne do osiągnięcia 10 femtomoli lub 20 femtomol, a następnie podziel to przez dwa, aby użyć w pięciu mikrolitrach pół reakcji LR.

Wygeneruj 10 femtomoli P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) i 20 femtomoli wektora docelowego. Ustaw pięć mikrolitrów połówkową reakcji LR, łącząc objętości P5E, PME, P3E i PDEST w probówce o pojemności 500 mikrolitrów. Następnie dodaj sterylną wodę, aby objętość wynosiła cztery mikrolitry.

Mieszaj enzym LR dwa razy przez jedną minutę przed dodaniem jednego mikrolitra do reakcji i dokładnie wymieszaj przed inkubacją w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnego dnia zatrzymaj reakcję LR, dodając 0,5 mikrolitra proteinazy K. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostudź do temperatury pokojowej. Następnie przekształć trzy do czterech mikrolitrów plazmidu w rozmrożone chemicznie kompetentne komórki, dodając plazmid i pozostawiając komórki na lodzie przez 25 do 30 minut.

Następnie poddaj ogniwa szokowi cieplnemu w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Po szoku cieplnym dodaj do komórek 250 mikrolitrów bogatej w antybiotyki pożywki płynnej i inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Rozprowadzić 300 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na jednej płytce ampicyliny Luria-Bertani i inkubować przez noc.

Następnego dnia przebadaj kolonie pod kątem obecności dwóch fenotypów: przezroczystego i nieprzezroczystego. Zbieraj przezroczyste kolonie pojedynczo, zaszczepiaj płynną kulturę i wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Połącz 150 nanogramów plazmidu, 100 nanogramów mRNA transpozazy i 2% czerwieni fenolowej na lodzie.

Następnie dodaj wodę wolną od RNA, aby uzyskać objętość trzech mikrolitrów. Przenieść jeden zarodek w stadium komórkowym za pomocą pipet transferowych na płytkę iniekcyjną wypełnioną elektromagnetyczem całkowicie pokrywającą agar, a następnie delikatnie wycisnąć około 50 do 75 zarodków na szczelinę płytki iniekcyjnej. Dodaj mieszaninę plazmidu plazmidu fenolowego mRNA do otwartego końca igły do wstrzykiwań kapilarnych.

Umieść igłę kapilarną w tworniku zestawu iniekcyjnego i włącz zestaw do iniekcji. Opuścić igłę do płytki iniekcyjnej i złamać końcówkę za pomocą kleszczy, aby umożliwić wypompowanie tylko niewielkiej ilości mieszaniny przez zestaw iniekcyjny. Wstrzyknąć zarodki za pomocą trzynanolitrowego bolusa mieszaniny plazmidu plazmidu fenolowego mRNA do ciała komórkowego zarodka.

Po zakończeniu należy wyjąć zarodki z płytki iniekcyjnej, delikatnie wyjmując je ze szczeliny i przenieść, pipetując je na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym EM. Inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Wybierz odpowiedni etap rozwoju dla fluorescencyjnej ekspresji transgenu i przeprowadź badanie przesiewowe pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Badania przesiewowe w kierunku transgenów niefluorescencyjnych poprzez badania przesiewowe w kierunku fluorescencyjnych markerów transgenicznych, takich jak GFP, napędzanych przez specyficzny dla serca promotor genu Cmlc2.

Kiedy zarodki z dodatnim wynikiem insercji transgenicznej rozwijają się w dorosłe osobniki i osiągają wiek rozrodczy, należy je indywidualnie przebadać pod kątem transmisji linii zarodkowej i ekspresji transgenu, krzyżując je z danio pręgowanym typu dzikiego. Przedstawiono przykładowe kolonie bakteryjne otrzymane w wyniku transformacji rekombinacji LR. Przezroczyste kolonie zawierały prawidłowy produkt rekombinacji LR w ponad 85% przypadków, podczas gdy nieprzezroczyste kolonie nigdy nie zawierały prawidłowego produktu rekombinacji.

Diagnostyczne trawienie trzech kolonii z transformacji produktów rekombinacji LR wykazało, że pojedyncza nieprzezroczysta kolonia nie zawierała żadnego plazmidu, podczas gdy dwie przezroczyste kolonie zawierały pojedyncze prążki w 9 544 parach zasad. Transpozaza mRNA w 1,950 parze zasad jest pokazana tutaj. Ekspresję endodermy mozaikowej EGFP-CAAX zaobserwowano w 75% wstrzykniętych zarodków.

Transgeniczną ekspresję markera Cmlc2 EGFP w rozwijającym się sercu obserwowano 24 godziny po zapłodnieniu. Dorosłe rybo pręgowane miały transmisję w linii zarodkowej sox17: EGFP-CAAX generował fluorescencyjne zarodki z endodermą w pełni znakowaną EGFP-CAAX. Zarówno przednio-tylna długość endodermy, jak i długość grzbietowo-brzuszna każdego woreczka z woreczków od pierwszego do piątego mierzono w kontrolnych i traktowanych etanolem dzikich zarodkach zmutowanych BMP.

Na całkowitą długość endodermy nie miał wpływu genotyp ani leczenie. Jednak woreczki pierwsze i trzecie wykazały znaczny wzrost długości woreczka między zarodkami dzikimi nieleczonymi i leczonymi etanolem, ale znaczne zmniejszenie długości między mutantami BMP nieleczonymi i leczonymi etanolem. Worek drugi wykazał znaczny wzrost rozmiaru woreczka odpowiednio między grupami typu dzikiego i zmutowanego BMP nietraktowanymi i leczonymi etanolem.

Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby zachować precyzję w pipetowaniu i rozcieńczaniu systemu Tol2, a także uderzaniu w ciało komórki podczas wstrzykiwania zarodka.