Name: System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj system Tol2 do transgenezy w Danio rerio dla badań nad rozwojem zarodka i FASD. Ta modułowa metoda umożliwia szybkie tworzenie konstruktów transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania przedstawione w tym artykule były wspierane przez grant z National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 dla C.B.L.

Wszystkie embriony danio pręgowanego użyte w tej procedurze były hodowane i rozmnażane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC12. Protokoły te zostały zatwierdzone przez University of Louisville.
UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano szczep danio pręgowanego typu dzikiego, AB, oraz linię podwójnego mutanta bmp4st72;smad5b1100. Cała woda użyta w tej procedurze była sterylną wodą z odwróconej osmozy. Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego. Pomiary endodermy przeprowadzono za pomocą narzędzia pomiarowego w programie ImageJ. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego.
1. Przygotowanie roztworów i pożywek
<ol>
	<li>Pożywki bakteryjne: Rozpuścić bulion LB lub agar zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie poddać autoklawowaniu. Przed wylaniem pożywki do szalek Petri o średnicy 100 mm dodać ampicylinę (50 µg/mL), kanamycynę (50 µg/mL) lub kombinację ampicyliny i chloramfenikolu (odpowiednio 50 µg/mL i 30 µg/mL).</li>
	<li>Aby przygotować 20-krotny roztwór stokowy pożywki dla embrionów, rozpuścić w 1 L wody następujące składniki: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g Na2HPO4 oraz 4,9 g MgSO4·7H2O. Roztwór stokowy wysterylizować poprzez filtrację przy użyciu systemu filtracji próżniowej 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Należy zignorować powstający biały osad; nie będzie on miał wpływu na właściwości pożywki.</li>
	<li>W 19 L wody rozpuścić 1,2 g NaHCO3 i dodać 1 L 20-krotnego roztworu stokowego pożywki dla embrionów w celu przygotowania roboczego roztworu pożywki dla embrionów; roztwór ten należy utrzymywać w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Aby przygotować 2% roztwór czerwieni fenolowej, rozpuścić 20 mg soli sodowej czerwieni fenolowej w 1 mL wody wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Formy do iniekcji embrionów
<ol>
	<li>Aby przygotować agarozową płytkę do iniekcji, rozpuścić agarozę w pożywce dla zarodków do stężenia końcowego 3%, podgrzewając do wrzenia.</li>
	<li>Wlać 50 mL agarozy do szalek Petriego o średnicy 100 mm, a gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, ostrożnie umieścić w niej formę do iniekcji, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza pod formą.</li>
	<li>Pozostawić płytki agarozowe do ostygnięcia. Po zastygnięciu agarozy wyjąć formę do iniekcji i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Pipety dozujące
<ol>
	<li>Wytnij igły z kapilar o średnicy zewnętrznej (OD) 1,0 mm zawierających filament, korzystając z pionowej wyciągarki do pipet z solenoidem ustawionym na 2,5 i elementem grzejnym ustawionym na 14,6. 
	UWAGA: Można użyć dowolnej wyciągarki grzewczej, o ile pozwala ona na czyste i równomierne wyciągnięcie kapilar w dwie igły, jednak w celu uzyskania spójnych wyników iniekcji, igły do iniekcji należy przygotować w ciągu 1 tygodnia przed iniekcją embrionów zebrafish.
	<ol>
		<li>Umieść kapilarę w wyciągarce, zaciśnij zaciski na obu końcach, a następnie aktywuj element grzejny.</li>
		<li>Wyciągnij kapilary, aby utworzyć dwie igły do iniekcji.</li>
		<li>Wyjmij kapilary z wyciągarki i przechowuj je w pustej szalce Petri z paskiem plasteliny, która pełni rolę uchwytu na igły.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie mRNA transpozazy
<ol>
	<li>Zlinearyzuj plazmid Tol2Kit zawierający transpozazę za pomocą endonukleazy restrykcyjnej NotI, łącząc w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL następujące składniki: 10 µL plazmidu transpozazy (150 ng/µL), 1,5 µL buforu do reakcji endonukleazy restrykcyjnej oraz 0,3 µL endonukleazy NotI.</li>
	<li>Uzupełnij objętość reakcji do 20 µL wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszaj i inkubuj w celu trawienia w 37 °C przez noc.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie transpozazy, dodając do reakcji trawiennej 1 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 µL 5 M NH4OAc oraz 80 µL 100% EtOH, a następnie wymieszaj i schłodź w −20 °C przez noc.</li>
	<li>Wiruj roztwór z prędkością 14 000x g przez 20 min w 4 °C, a następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad DNA w wodzie wolnej od RNaz.</li>
	<li>Wyznacz stężenie liniowego plazmidu w nanogramach na mikrolitr (ng/µL) za pomocą fluorometru, mierząc najpierw 2 µL próbki kontrolnej z wody wolnej od RNaz, a następnie 2 µL zlinearyzowanego plazmidu. 
	UWAGA: Stężenia plazmidu zazwyczaj mieszczą się w przedziale 100-200 ng/µL</li>
	<li>Przygotuj produkcję mRNA SP6, łącząc w odpowiedniej kolejności następujące składniki w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL: 10 µL 2x NTP/CAP, 2 µL 10x buforu do reakcji, 0,1-1 µg liniowej matrycy DNA oraz 2 µL mieszaniny enzymów SP6.</li>
	<li>Uzupełnij objętość reakcji do 20 µL wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszaj i inkubuj w 37 °C przez 2 h.</li>
	<li>Po 2 h inkubacji dodaj 1 µL DNazy, dokładnie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 15 min w 37 °C.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję SP6, dodaj do probówki z reakcją 30 µL roztworu do precypitacji LiCl, a następnie wymieszaj i schłodź w −20 °C przez noc.</li>
	<li>Wiruj roztwór z prędkością 14 000 x g przez 20 min w 4 °C, aby uzyskać osad mRNA, a następnie odessij nadsącz i przemyj osad mRNA 1 mL 80% EtOH (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).</li>
	<li>Wiruj roztwór z prędkością 14 000 x g przez 20 min w 4 °C, aby uzyskać osad mRNA, a następnie odessij nadsącz. Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Resuspenduj osad mRNA w 20 µL wody wolnej od RNaz, wyznacz stężenie mRNA w nanogramach na mikrolitr (ng/µL) za pomocą fluorometru zgodnie z opisem w kroku 4.5 (powinno wynosić co najmniej 100 ng/µL), rozdziel mRNA w ilości 100 ng na probówkę do jednorazowego użycia i przechowuj w −80 °C. 
	​UWAGA: Aby upewnić się, że mRNA nie uległo degradacji, można szybko przeprowadzić elektroforezę 2 µL mRNA na żelu do DNA, aby potwierdzić obecność pojedynczego prążka przy 1 950 bps.</li>
</ol>
5. Klonowanie Multisite Gateway w celu stworzenia wektorów wejściowych do transgenezy
UWAGA: Protokół ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Kwan i wsp.10, przy czym reakcja LR została zapisana jako reakcja pół-LR z całkowitą objętością 5 µL. W celu wygenerowania nowych elementów wpisu należy zastosować reakcje BP z wykorzystaniem wektorów donorowych 5', środkowego oraz 3'10,13.
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić reakcję, należy odmierzyć po 10 fmol p5E, pME i p3E oraz 20 fmol wektora docelowego (pDest). 
	UWAGA: Wielomiejscowa rekombinacja LR wykorzystuje cztery różne wektory plazmidowe: wektor wejściowy 5' (p5E), wektor wejściowy środkowy (pME), wektor wejściowy 3' (p3E) oraz wektor docelowy (pDest), w celu wygenerowania unikalnego konstruktu transgenicznego flankowanego powtórzeniami Tol2, gotowego do wstrzyknięcia do embrionów danio pręgowanego.
	<ol>
		<li>Określ wielkość wszystkich czterech wektorów w parach zasad na podstawie plazmidu źródłowego (Tabela 1strona wiki Tol2Kit14 lub Addgene11; zobacz Tabela materiałów). 
		UWAGA: W przypadku nowych wektorów należy przeprowadzić pełne sekwencjonowanie plazmidu poprzez komercyjne firmy sekwencjonujące mogą podać dokładną wielkość plazmidu w parach zasad (bp).</li>
		<li>Wyznacz stężenie wszystkich czterech wektorów w nanogramach na mikrolitr (ng/µl)µL) przy użyciu fluorometru, zgodnie z opisem w kroku 4.5.</li>
		<li>Przyjmując masę DNA wynoszącą 660 g/mol oraz rozmiar plazmidu (w pz), należy obliczyć całkowitą liczbę nanogramów (ng) plazmidu potrzebnych do uzyskania 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy). 
		<img alt="Wzór obliczeniowy dla wektora, \(Rozmiar wektora [bps] \times 10\: fmol\), do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych." src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Laboratorium Mosimanna na University of Colorado, Anschutz Medical Campus, udostępniło bezpłatną arkusz kalkulacyjny do obliczania potrzebnej ilości plazmidu (w ng) oraz objętości (w µL) wektorów niezbędnych w reakcji LR15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć opisowany poniżej konstrukt, sox17:EGFPCAAX, należy użyć następujących wektorów: wektora p5E zawierającego zebrafish sox17 promotor o wielkości 6 918 bp16; wektor pME zawierający prenylowane EGFP o rozmiarze 3345 bp10; wektor p3E zawierający sekwencję sygnału późnego poliadenylacji SV40 o wielkości 2838 bp10oraz pDest o rozmiarze 5 883 bp10.</li>
	<li>Wykorzystując stężenie plazmidu określone w kroku 5.1.2 oraz ilość w nanogramach (ng) dla każdego wektora (krok 5.1.3), oblicz całkowitą liczbę mikrolitrów (µL) każdego plazmidu niezbędnego do uzyskania 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy), a następnie podzielić tę wartość przez dwa w celu zastosowania w 5 µL reakcje half-LR (wszystkie wartości wymienione poniżej są podane w Tabela 2). 
	<img alt="Wzór na obliczenie ilości wektora do reakcji ligacji (LR); równanie na stężenie objętościowe wektora w μL." src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">
	<ol>
		<li>Aby otrzymać 10 fmol p5E-sox17, należy użyć 45,66 ng (przy stężeniu 140,3 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej czterokrotnie, aby uzyskać 0.65 µL.</li>
		<li>Aby uzyskać 10 fmol pME-EGFPCAAX, należy użyć 22,08 ng (przy stężeniu 213,5 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej 10-krotnie, aby otrzymać 0.52 µL.</li>
		<li>Aby otrzymać 10 fmol p3E-poly A, należy użyć 15,73 ng (przy stężeniu 276,1 ng/µL) i rozcieńczyć w sterylnej wodzie 20-krotnie, aby otrzymać 0.57 µL.</li>
		<li>Dla 20 fmol wektora docelowego należy użyć 77,66 ng pDest (przy stężeniu 307,3 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej 5-krotnie, aby otrzymać 1.63 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować 5 µL reakcja half-LR, połączyć objętości p5E, pME, p3E i pDest określone w kroku 5.3 w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml, a następnie dodać sterylną wodę do uzyskania całkowitej objętości reakcji wynoszącej 4 µL.</li>
	<li>Mieszaninę enzymów LR należy energicznie wymieszać w wirówce typu vortex dwa razy przez 1 minutę każdorazowo, aby zapewnić właściwe wymieszanie, a następnie dodać 1 µL do reakcji i wymieszać dokładnie.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 25 °C na noc (16+ h).</li>
	<li>Zatrzymać reakcję LR poprzez dodanie 0.5 µL proteinazy K (2 µg/µL), inkubować w 37 °C przez 10 min, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przekształć 3-4 µL plazmidu do rozmrożonych, chemicznie kompetentnych komórek poprzez dodanie plazmidu i inkubację komórek w lodzie przez 25–30 min.</li>
	<li>Podczas gdy komórki znajdują się w lodzie, ogrzej dwie płytki z agarem LB z ampicyliną do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Poddaj komórki szokowi termicznemu w 42°C w kąpieli wodnej przez dokładnie 30 s.</li>
	<li>Po szoku termicznym należy dodać 250 µL pożywek płynnych, bogatych i wolnych od antybiotyków do komórek, a następnie inkubować z wytrząsaniem w 37 °C przez 1,5 h.</li>
	<li>Rozprzestrzenianie 300 µL bakterii na jednej płytce z ampicyliną, a następnie inkubować w 37°C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia rano należy przesiewać kolonie pod kątem obecności dwóch fenotypów: przeźroczystego i nieprzezroczystego, a następnie wyselekcjonować kolonie przeźroczyste (zgodnie z opisem w Kwan et al.10) po kolei zaszczepić hodowlę płynną, a następnie inkubować z wytrząsaniem przy 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Przezroczyste kolonie niemal zawsze zawierają prawidłową kolonię LR (&gt;w 85% przypadków).</li>
	<li>Korzystając z komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta, należy przeprowadzić izolację plazmidów z każdej z kultur w cieczy, a następnie wykonać trawienie diagnostyczne każdego plazmidu w celu potwierdzenia odpowiedniej wielkości konstruktu transgenicznego, co świadczy o prawidłowym przebiegu reakcji LR gateway.</li>
	<li>Ponownie transformuj prawidłowe konstrukty transgeniczne, stosując standardowy protokół transformacji bakteryjnej opisany w krokach 5.4-5.12, wykorzystując 0,5-1 µL plazmidu i inkubować wyłącznie w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Ponownie wysej kolonie i potwierdź, że każda z nich zawiera transgeniczny konstrukt LR, zgodnie z etapem 5.14.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie plazmidu zgodnie z opisem w kroku 4.5 (co najmniej 150 ng/µL jest wymagane do iniekcji zarodków).</li>
</ol>
6. Iniekcja transgenu do embrionów
<ol>
	<li>Odmrozić na lodzie jednorazową próbkę mRNA transpozazy oraz transgeniczny konstrukt Tol2 i ogrzać płytkę do iniekcji z agarozy do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Połączyć na lodzie następujące składniki: 150 ng plazmidu, 100 ng mRNA transpozazy oraz 2% czerwieni fenolowej (0,3 µL). Następnie dodać wodę wolną od RNA, aby uzupełnić objętość do 3 µL.</li>
	<li>Przenieść embriony w stadium jednej komórki za pomocą pipet transferowych na płytkę do iniekcji (opisaną w kroku 2) wypełnioną EM całkowicie pokrywającym agar, a następnie delikatnie ułożyć około 50–75 embrionów w każdym gnieździe płytki do iniekcji.</li>
	<li>Nanieść mieszaninę mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej na otwarty koniec kapilarnej igły do iniekcji, umieścić igłę kapilarną w uchwycie urządzenia do iniekcji i włączyć urządzenie. 
	UWAGA: Urządzenie do iniekcji wykorzystuje sprężony gaz, np. powietrze, aby po aktywacji wprowadzić pulsacyjnie żądaną objętość (opisaną w kroku 6.5) mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej do embrionu.</li>
	<li>Opuścić igłę kapilarną do EM na płytce do iniekcji i odłamać końcówkę za pomocą pęsety, aby urządzenie do iniekcji wypompowało jedynie niewielką ilość mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Wstrzyknąć do ciała komórkowego embrionu mały bolus 3 nL mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej. 
	UWAGA: Bolus 3 nL to objętość mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej, przy której siedem bolusów mogłoby teoretycznie zmieścić się równomiernie wzdłuż linii środkowej embrionu.</li>
	<li>Po zakończeniu iniekcji embrionów usunąć je z płytki do iniekcji, delikatnie wypychając je z gniazd, i przenieść za pomocą pipet transferowych do 100 mm szalki Petriego ze świeżym EM (około 40 mL), a następnie inkubować w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić rozwój embrionów.</li>
</ol>
7. Przesiewowe badanie zarodków w celu wykrycia insercji transgenicznej
<ol>
	<li>W przypadku ekspresji białek fluorescencyjnych należy wybrać odpowiedni stopień rozwoju, w którym transgen fluorescencyjny powinien ulec ekspresji, a następnie sprawdzić obecność fluorescencji pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. 
	UWAGA: Zarodki te będą wykazywać mozaikową ekspresję oraz genomiczną insercję konstruktu transgenicznego.</li>
	<li>W celu identyfikacji transgenów niefluorescencyjnych należy przeprowadzić przesiew w kierunku fluorescencyjnego markera transgenicznego (zgodnie z opisem w kroku 7.1), takiego jak GFP sterowany promotorem specyficznym dla serca genu cmlc2 lub mCherry sterowany promotorem specyficznym dla soczewki αcyrstallin, które znajdują się w osobnych wektorach docelowych.</li>
	<li>Należy pozwolić zarodkom wykazującym pozytywną insercję transgeniczną na pełny rozwój do stadium dorosłych ryb danio pręgowanych.</li>
	<li>Po osiągnięciu przez potencjalne ryby transgeniczne wieku rozrodczego należy poddać je indywidualnej weryfikacji pod kątem transmisji w linii zarodkowej oraz ekspresywności transgenu poprzez krzyżowanie ich z rybami danio pręgowanymi typu dzikiego.</li>
	<li>Osobniki dorosłe, których zarodki rozwijają się prawidłowo i wykazują najsilniejszą oraz najbardziej odpowiednią ekspresję transgenu, są zachowywane jako unikalne linie transgeniczne danio pręgowanych do dalszych prac i analiz. 
	UWAGA: Jako alternatywną metodę weryfikacji genomicznej insercji konstruktów transgenicznych można zaprojektować primery do PCR, które amplifikują wyłącznie konstrukt transgeniczny, a nie DNA typu dzikiego.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany idealnie nadaje się do badania wpływu ekspozycji na etanol na rozwój i stany chorobowe 7,8. Danio pręgowany wytwarza dużą liczbę półprzezroczystych, zewnętrznie zapłodnionych, genetycznie podatnych na rozciąganie zarodków, co pozwala na obrazowanie na żywo kilku tkanek i typów komórek znakowanych transgenami jednocześnie w wielu kontekstach środowiskowych19,20. Te mocne strony, w połączeni...

Prenatalne narażenie na etanol powoduje kontinuum strukturalnych deficytów i zaburzeń poznawczych określanych jako spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych (FASD)1,2,3,4. Złożone relacje między wieloma czynnikami sprawiają, że badanie i zrozumienie etiologii FASD u ludzi jest trudne. Aby sprostać temu wyzwaniu, wykorzystano szeroką gamę modeli zwierzęcych. Biologiczne i eksperymentalne narzędzia dostępne w tych modelach okazały się kluczowe w rozwijaniu naszego zrozumienia mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu, a wyniki z tych systemów modelowych były niezwykle spójne z tym, co stwierdzono w badaniach nad etanolem u ludzi5,6. Wśród nich danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania teratogenezy etanolu7,8, częściowo ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wysoką płodność, podatność genetyczną i półprzezroczyste zarodki. Połączenie tych zalet sprawia, że danio pręgowany idealnie nadaje się do badań obrazowania FASD na żywo w czasie rzeczywistym przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego.
Transgeniczne rybo pręgowane były szeroko wykorzystywane do badania wielu aspektów rozwoju embrionalnego9. Jednak tworzenie konstruktów transgenicznych i kolejnych linii transgenicznych może być niezwykle trudne. Standardowy transgen wymaga aktywnego elementu promotora do napędzania transgenu i sygnału poli A lub "ogona", a wszystko to w stabilnym wektorze bakteryjnym do ogólnego utrzymania wektora. Tradycyjne generowanie wieloskładnikowego konstruktu transgenicznego wymaga wielu czasochłonnych etapów klonowania podrzędnego10. Podejścia oparte na PCR, takie jak montaż Gibsona, mogą obejść niektóre problemy związane z podklonowaniem. Jednak unikalne startery muszą być zaprojektowane i przetestowane pod kątem generowania każdego unikalnego konstruktu transgenicznego10. Poza budową transgenu, integracja genomowa, transmisja w linii zarodkowej i badania przesiewowe w celu prawidłowej integracji transgenu również były trudne. W tym miejscu opisujemy protokół korzystania z systemu transgenezy Tol2 opartego na transpozonach (Tol2Kit)10,11. Ten modułowy system wykorzystuje wielomiejscowe klonowanie bram do szybkiego generowania wielu konstruktów transgenicznych ze stale powiększającej się biblioteki wektorów "wejściowych" i "docelowych". Zintegrowane elementy transpozycyjne Tol2 znacznie zwiększają szybkość transgenezy, umożliwiając szybką budowę i integrację genomową wielu transgenów. Korzystając z tego systemu, pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać wytwarzanie transgenicznej linii endodermalnej danio pręgowanego do badania specyficznych dla tkanek defektów strukturalnych leżących u podstaw FASD. Ostatecznie, w tym protokole, pokazujemy, że modułowa konfiguracja i budowa transgenicznych konstruktów znacznie pomogą w badaniach FASD na bazie danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Skrzynka narzędziowa Addgene Tol2</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Powietrze</td><td></td><td></td><td>Dostarczane bezpośrednio przez uniwersytet Waga analityczna</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Kapilara</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Przygotowanie plazmidu</td> dawcy <td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Nisko-EEO / wielofunkcyjny / biologia molekularna Klasa Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (heptahydrat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety</td><td>Zastosowane oprzyrządowanie naukowe</td> Probówka do mikrowirówek <td>MIMPH-M-</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Arkusz obliczeniowy</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Czerwona sól sodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu (dwuzasadowy)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz ciśnieniowy</td><td>Zastosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (dwuzasadowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 &micro; M System filtracji próżniowej&nbsp;</td><td>Strona Wiki Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chemicznie kompetentni E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Forma do mikroiniekcji danio pręgowanego</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

system danio pręgowanego tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Alkoholowe zaburzenia płodowe (FASD) charakteryzują się bardzo zmiennym zestawem wad strukturalnych i zaburzeń poznawczych, które powstają w wyniku prenatalnej ekspozycji na etanol. Ze względu na złożoną patologię FASD, modele zwierzęce okazały się kluczowe dla naszego obecnego zrozumienia wad rozwojowych wywołanych etanolem. Danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania wad rozwojowych wywołanych etanolem ze względu na wysoki stopień zachowania zarówno genetyki, jak i rozwoju między danio pręgowanym a ludźmi. Jako system modelowy, danio pręgowany posiada wiele cech, które czynią je idealnymi do badań rozwojowych, w tym dużą liczbę zewnętrznie zapłodnionych zarodków, które są genetycznie podatne i półprzezroczyste. Dzięki temu naukowcy mogą precyzyjnie kontrolować czas i dawkę ekspozycji na etanol w wielu kontekstach genetycznych. Jednym z ważnych narzędzi genetycznych dostępnych u danio pręgowanego jest transgeneza. Jednak generowanie konstruktów transgenicznych i ustanawianie linii transgenicznych może być złożone i trudne. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zajmujący się danio pręgowanymi stworzyli system transgenezy Tol2 oparty na transpozonach. Ten modułowy system wykorzystuje wielostanowiskowe podejście do klonowania Gateway w celu szybkiego montażu kompletnych transgenicznych konstruktów opartych na transpozonach Tol2. W tym miejscu opisujemy elastyczny zestaw narzędzi systemu Tol2 oraz protokół generowania konstruktów transgenicznych gotowych do transgenezy danio pręgowanego i ich wykorzystania w badaniach etanolu.

Do generowania konstruktów transgenicznych wykorzystano system transgenezy Tol2. W celu stworzenia konstruktu transgenicznego użyto trzech wektorów wejściowych: p5E, zawierającego elementy promotora/enhancera genu, pME, zawierającego gen podlegający ekspresji pod wpływem elementów promotora/enhancera oraz p3E, który w minimalnej konfiguracji zawiera ogon polyA. poprzez wielomiejscowa klonowanie Gateway LR. Wektor docelowy, pDest, dostarcza powtórzeń Tol2 niezbędnych do insercji genomowej konstruktu transgeniczne...

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgeniczne danio pręgowane okazały się kluczowe dla naszego zrozumienia rozwoju zarodków. System Tol2 jest wszechstronnym narzędziem, które umożliwia naukowcom szybkie i systematyczne generowanie wielu transgenicznych danio pręgowanego do badań FASD. Modułowa konstrukcja i łatwość generowania nowych komponentów zestawu sprawiają, że system Tol2 jest wszechstronnym narzędziem do generowania nowych transgeników bez konieczności przeprojektowywania jakichkolwiek komponentów zestawu.Moja rada dla badaczy stosujących tę technikę po raz pierwszy jest taka, aby przeprowadzili kilka próbnych prób, aby ćwiczyć się w precyzji generowania i wstrzykiwania konstruktów transgenicznych. Na początek zlinearyzuj plazmid zestawu Tol2 zawierający transpozazę za pomocą endonukleazy restrykcyjnej, łącząc 10 mikrolitrów plazmidu transporazy, 1,5 mikrolitra buforu reakcyjnego endonukleazy restrykcyjnej i 0,3 mikrolitra endonukleazy w probówce mikrowirówki o pojemności 500 mikrolitrów. Napełnij reakcję do 20 mikrolitrów wodą wolną od RNAse.Wymieszaj i strawij w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przerwij trawienie, dodając do mieszaniny reakcyjnej jeden mikrolitr 0,5 molowego EDTA, dwa mikrolitry pięciomolowego octanu amonu i 80 mikrolitrów 100% etanolu. Wymieszaj i schłódź się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia odwirować i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu DNA w wodzie wolnej od RNAzy. Następnie określ liniowe stężenie plazmidu w nanogramach na mikrolitr na fluorometrze, uruchamiając dwa mikrolitry próbki. Skonfiguruj produkcję mRNA SP6, łącząc 10 mikrolitrów 2X NTP / CAP, dwa mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego, 0,1 do jednego mikrograma liniowej matrycy DNA w dwóch mikrolitrach mieszanki enzymów SP6 w probówce o pojemności 500 mikrolitrów.Napełnij reakcję do 20 mikrolitrów wodą wolną od RNAzy i wymieszaj przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach dodaj jeden mikrolitr DNA, dobrze wymieszaj i inkubuj przez dodatkowe 15 minut. Zatrzymaj reakcję, dodając 30 mikrolitrów roztworu wytrącającego chlorek litu.Wymieszaj i schłódź się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odwiruj roztwór, aby osadzać mRNA i odessać supernatant przed umyciem osadu jednym mililitrem 80% etanolu. Wysuszyć granulki na powietrzu i ponownie zawiesić je w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNAse.Określ stężenie mRNA za pomocą fluorometru, a następnie podwielokrotność 100 nanogramów mRNA na probówkę do jednorazowego użytku i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić reakcję, zbierz po 10 femtomoli P5E, PME i P3E oraz 20 femtomoli docelowego wektora PDEST. Zidentyfikuj rozmiar wszystkich czterech wektorów i par zasad ze źródła plazmidu.Po określeniu stężenia wszystkich czterech wektorów, używając masy DNA jako 660 gramów na mol oraz wielkości plazmidu i par zasad, oblicz łączną ilość nanogramów plazmidu potrzebnych do osiągnięcia 10 femtomoli dla wektorów wejściowych lub 20 femtomoli dla wektora docelowego. Następnie wygeneruj konstrukcję sox17:EGFP-CAAX przy użyciu komponentów opisanych w manuskrypcie. Korzystając ze stężenia plazmidu, oblicz całkowite mikrolitry każdego plazmidu potrzebne do osiągnięcia 10 femtomoli lub 20 femtomol, a następnie podziel to przez dwa, aby użyć w pięciu mikrolitrach pół reakcji LR.Wygeneruj 10 femtomoli P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) i 20 femtomoli wektora docelowego. Ustaw pięć mikrolitrów połówkową reakcji LR, łącząc objętości P5E, PME, P3E i PDEST w probówce o pojemności 500 mikrolitrów. Następnie dodaj sterylną wodę, aby objętość wynosiła cztery mikrolitry.Mieszaj enzym LR dwa razy przez jedną minutę przed dodaniem jednego mikrolitra do reakcji i dokładnie wymieszaj przed inkubacją w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnego dnia zatrzymaj reakcję LR, dodając 0,5 mikrolitra proteinazy K. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostudź do temperatury pokojowej. Następnie przekształć trzy do czterech mikrolitrów plazmidu w rozmrożone chemicznie kompetentne komórki, dodając plazmid i pozostawiając komórki na lodzie przez 25 do 30 minut.Następnie poddaj ogniwa szokowi cieplnemu w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Po szoku cieplnym dodaj do komórek 250 mikrolitrów bogatej w antybiotyki pożywki płynnej i inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Rozprowadzić 300 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na jednej płytce ampicyliny Luria-Bertani i inkubować przez noc.Następnego dnia przebadaj kolonie pod kątem obecności dwóch fenotypów: przezroczystego i nieprzezroczystego. Zbieraj przezroczyste kolonie pojedynczo, zaszczepiaj płynną kulturę i wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Połącz 150 nanogramów plazmidu, 100 nanogramów mRNA transpozazy i 2% czerwieni fenolowej na lodzie.Następnie dodaj wodę wolną od RNA, aby uzyskać objętość trzech mikrolitrów. Przenieść jeden zarodek w stadium komórkowym za pomocą pipet transferowych na płytkę iniekcyjną wypełnioną elektromagnetyczem całkowicie pokrywającą agar, a następnie delikatnie wycisnąć około 50 do 75 zarodków na szczelinę płytki iniekcyjnej. Dodaj mieszaninę plazmidu plazmidu fenolowego mRNA do otwartego końca igły do wstrzykiwań kapilarnych.Umieść igłę kapilarną w tworniku zestawu iniekcyjnego i włącz zestaw do iniekcji. Opuścić igłę do płytki iniekcyjnej i złamać końcówkę za pomocą kleszczy, aby umożliwić wypompowanie tylko niewielkiej ilości mieszaniny przez zestaw iniekcyjny. Wstrzyknąć zarodki za pomocą trzynanolitrowego bolusa mieszaniny plazmidu plazmidu fenolowego mRNA do ciała komórkowego zarodka.Po zakończeniu należy wyjąć zarodki z płytki iniekcyjnej, delikatnie wyjmując je ze szczeliny i przenieść, pipetując je na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym EM. Inkubować w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Wybierz odpowiedni etap rozwoju dla fluorescencyjnej ekspresji transgenu i przeprowadź badanie przesiewowe pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Badania przesiewowe w kierunku transgenów niefluorescencyjnych poprzez badania przesiewowe w kierunku fluorescencyjnych markerów transgenicznych, takich jak GFP, napędzanych przez specyficzny dla serca promotor genu Cmlc2.Kiedy zarodki z dodatnim wynikiem insercji transgenicznej rozwijają się w dorosłe osobniki i osiągają wiek rozrodczy, należy je indywidualnie przebadać pod kątem transmisji linii zarodkowej i ekspresji transgenu, krzyżując je z danio pręgowanym typu dzikiego. Przedstawiono przykładowe kolonie bakteryjne otrzymane w wyniku transformacji rekombinacji LR. Przezroczyste kolonie zawierały prawidłowy produkt rekombinacji LR w ponad 85% przypadków, podczas gdy nieprzezroczyste kolonie nigdy nie zawierały prawidłowego produktu rekombinacji.Diagnostyczne trawienie trzech kolonii z transformacji produktów rekombinacji LR wykazało, że pojedyncza nieprzezroczysta kolonia nie zawierała żadnego plazmidu, podczas gdy dwie przezroczyste kolonie zawierały pojedyncze prążki w 9 544 parach zasad. Transpozaza mRNA w 1,950 parze zasad jest pokazana tutaj. Ekspresję endodermy mozaikowej EGFP-CAAX zaobserwowano w 75% wstrzykniętych zarodków.Transgeniczną ekspresję markera Cmlc2 EGFP w rozwijającym się sercu obserwowano 24 godziny po zapłodnieniu. Dorosłe rybo pręgowane miały transmisję w linii zarodkowej sox17: EGFP-CAAX generował fluorescencyjne zarodki z endodermą w pełni znakowaną EGFP-CAAX. Zarówno przednio-tylna długość endodermy, jak i długość grzbietowo-brzuszna każdego woreczka z woreczków od pierwszego do piątego mierzono w kontrolnych i traktowanych etanolem dzikich zarodkach zmutowanych BMP.Na całkowitą długość endodermy nie miał wpływu genotyp ani leczenie. Jednak woreczki pierwsze i trzecie wykazały znaczny wzrost długości woreczka między zarodkami dzikimi nieleczonymi i leczonymi etanolem, ale znaczne zmniejszenie długości między mutantami BMP nieleczonymi i leczonymi etanolem. Worek drugi wykazał znaczny wzrost rozmiaru woreczka odpowiednio między grupami typu dzikiego i zmutowanego BMP nietraktowanymi i leczonymi etanolem.Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby zachować precyzję w pipetowaniu i rozcieńczaniu systemu Tol2, a także uderzaniu w ciało komórki podczas wstrzykiwania zarodka.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Prezentujemy nasze podejście do wyszukiwania potencjalnych elementów enhansera w genach regulowanych rozwojowo oraz ocenę ich funkcji za pomocą mozaikowej transgenezy u rybek danio pręgowanych.

Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

W tym filmie demonstrujemy procedurę generowania stabilnej transgenicznej linii danio pręgowanej, konstytutywnie wyrażającej fluorescencyjne białko wskaźnika napięcia po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu transpozonów Tol2 składającego się z mRNA transpozazy i konstruktu transpozonu Tol2 kodującego wskaźnik napięcia fluorescencyjnego.

Transgeneza danio pręgowanego za pośrednictwem transpozonu Tol2: procedura generowania transgenicznego danio pręgowanego po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu Tol2 do zapłodnionych zarodków danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Obiekt dla danio pręgowanego nadający się do hodowli i badań in vivo jest zbudowany w łatwy i niedrogi sposób. Konserwacja jest minimalna. To miejsce jest idealne do angażowania studentów i niezależnych badań.

Budowa niedrogiego i łatwego w budowie obiektu do połowu danio pręgowanego

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj system Tol2 do transgenezy w Danio rerio dla badań nad rozwojem zarodka i FASD. Ta modułowa metoda umożliwia szybkie tworzenie konstruktów transgenicznych.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Przeglądaj więcej filmów