Name: Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę hodowli C. elegans na pożywkach stałych z barierą kwasu palmitynowego do długotrwałego śledzenia żywotności, zdrowia i fluorescencji biomarkerów. Protokół umożliwia interwencje awersyjne i automatyczne obrazowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R35GM133588 dla G.L.S., grant szkoleniowy NIHT32GM008659 dla L.E., United States National Academy of Medicine Catalyst Award dla G.L.S., oraz State of Arizona Technology and Research Initiative Fund zarządzany przez Arizona Board of Regents.

<ol><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).</li>
<li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NemaLife+chip%3A+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+AS+%22Micro+and+Nano+Systems+for+Biophysical+Studies+of+Cells+and+Small+Organisms%22">Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms</a>. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).</li>
<li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li>
<li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).</li>
<li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30(2017).</li>
<li>Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li>
<li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li>
<li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li>
<li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li>
<li>Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormSizer%3A+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142(2013).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li>
<li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoussel%2C+N+%22Worm%22">Worm</a>. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).</li>
<li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li>
<li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).</li>
<li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li>
<li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Medicine+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy nowatorski system hodowli, który dostosowuje mikrotace, pierwotnie opracowane do testów typowania tkanek ludzkiego antygenu leukocytów, aby umożliwić izolację i charakterystykę pojedynczych C. elegans w czasie w środowisku pożywki stałej, które jest kontekstowo podobne do NGM na bazie agaru, który jest standardem w badaniach nad C. elegans. System ten jest kompatybilny z różnymi interwencjami, w tym ograniczeniami dietetycznymi, leczeniem farmakami egzogennymi, wyzwaniem związany...

C. elegans są potężnym organizmem modelowym do badań w dziedzinie genetyki, biologii komórkowej i biologii molekularnej, ponieważ łatwo je hodować w laboratorium, mają krótki czas generacji i długość życia, mają wysoki stopień homologii białek ze ssakami i mają przezroczystą strukturę ciała, która pozwala na wizualizację in vivo fluorescencyjnych białek i barwników1. W wyniku długotrwałego stosowania C. elegans jako głównego systemu modelowego w wielu dziedzinach, w tym w biologii rozwoju i starzeniu się, ich wzrost i rozwój są dobrze poznane, ich genom został w pełni zsekwencjonowany i stworzono wiele potężnych narzędzi genetycznych, w tym biblioteki odżywiania RNAi obejmujące cały genom oraz tysiące zmutowanych i transgenicznych szczepów. Historycznie rzecz biorąc, C. elegans są hodowane jako populacje na stałych pożywkach wzrostowych nicieni agarowych (NGM), a fenotypy są oceniane ręcznie albo przez bezpośrednią obserwację, albo przez obrazowanie i dalszą analizę. Mikroskopia fluorescencyjna służy do uchwycenia różnych fenotypów molekularnych za pomocą barwników lub transgenicznie wyrażonych znaczników fluorescencyjnych u poszczególnych C. elegans. Obrazowanie fluorescencyjne zazwyczaj polega na unieruchomieniu lub sparaliżowaniu zwierzęcia na szkiełkach zawierających cienkie poduszki agarozowe, co jest inwazyjne i często śmiertelne. Wiąże się to również ze stosowaniem substancji chemicznych, takich jak lewamizol lub azydek sodu, które mogą potencjalnie zakłócać proces molekularny będący przedmiotem zainteresowania2,3. Łącznie podejścia te umożliwiają gromadzenie przekrojowych danych na poziomie populacji w szerokim zakresie fenotypów, ale nie pozwalają na śledzenie poszczególnych zwierząt w czasie.
W ostatnich latach pojawiło się kilka podejść do hodowli izolowanych C. elegans, co pozwala badaczom na uchwycenie dynamicznych zmian w fizjologicznych i molekularnych fenotypach zwierząt w czasie przy użyciu nowych technologii obrazowania. Jedną z kategorii podejścia do hodowli C. elegans są urządzenia mikroprzepływowe, w tym między innymi WormFarm4, chip5 oraz chip "behavior" firmy Chronis et al.6, między innymi7,8,9. Związane z nimi są metody hodowli oparte na płynach, które wykorzystują płytki wielodołkowe do charakteryzowania pojedynczych robaków lub małych populacji w czasie10,11. Mikrofluidyka i systemy mikropłytek zapewniają doskonałe pomiary ilościowe reakcji fenotypowych u C. elegans aż do pojedynczego zwierzęcia, ale środowisko hodowli stanowi kluczowe ograniczenie. Zdecydowana większość wcześniejszych badań nad C. elegans, szczególnie w dziedzinie starzenia, została zakończona na stałych podłożach na bazie agaru. Płynna kultura powoduje, że C. elegans pływa w sposób ciągły i reprezentuje odrębny kontekst środowiskowy, który może zmienić podstawową biologię. Na przykład zwierzęta hodowane w płynnych pożywkach mają drastycznie zmienioną zawartość tłuszczu i ekspresję genów - szczególnie w przypadku genów zaangażowanych w reakcję na stres - w porównaniu ze zwierzętami hodowanymi na stałym NGM12,13. Alternatywna kategoria metod obrazowania na pojedynczych zwierzętach obejmuje urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS), które izolują poszczególne zwierzęta na pożywkach stałych, starając się bardziej naśladować standardowe środowisko doświadczane przez robaki hodowane na stałym NGM w hodowli grupowej na płytkach Petriego. WorMotel to 240-dołkowe urządzenie PDMS przeznaczone do hodowli pojedynczych zwierząt na pożywkach stałych. Każda studzienka jest wypełniana zmodyfikowanym NGM przy użyciu niskotopliwej agarozy zamiast agaru i wysiewana pokarmem bakteryjnym, tworząc stałe środowisko podłoża podobne do najpopularniejszego systemu hodowli wykorzystującego płytki Petriego. Ściany studni są okrągłe, co pozwala na obrazowanie każdego zwierzęcia niezależnie od lokalizacji w studni (unikając wizualnego zaciemnienia spowodowanego przez zwierzę w pobliżu ściany w płycie wielostudziennej). Siarczan miedzi w wąskiej fosie otaczającej każdą studnię jest używany jako środek odstraszający do trzymania zwierząt w ich studniach14,15. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że siarczan miedzi jest nieskuteczny w zapobieganiu ucieczce robaków, gdy występują awersyjne warunki środowiskowe, w tym ograniczenia dietetyczne, bakterie chorobotwórcze lub substancje chemiczne wywołujące stres komórkowy (np. Parakwat).
Drugim systemem, który wykorzystuje stałe podłoże, jest Worm Corral, który wykorzystuje hydrożel do tworzenia małego, szczelnego środowiska dla każdego robaka na slajdzie, umożliwiając długoterminowe monitorowanie indywidualnie izolowanych zwierząt16. Kluczowym ograniczeniem jest to, że zwierzęta muszą być zamknięte w środowisku jako jaja, co wymaga użycia bezpłodnych zwierząt w celu zapobieżenia reprodukcji i ogranicza leczenie farmakologiczne do jednego zastosowania. Wielodawkowe próby leków można przeprowadzić w WorMotelu poprzez przeprowadzenie wielu rund ekspozycji przed przeniesieniem robaków do urządzenia lub poprzez miejscowe dodawanie dodatkowych leków do studzienek podczas eksperymentu; Jednak w tym drugim przypadku rzeczywista dawka narażenia po dodaniu dodatkowego leku do istniejącego odwiertu jest trudna do precyzyjnego określenia ilościowego i zależy od tego, jak szybko lek ulega degradacji. Zarówno WorMotel, jak i Worm Corral doskonale nadają się do obrazowania w jasnym lub ciemnym polu w celu uchwycenia informacji związanych z aktywnością i fizjologią zwierząt (np. wzrostem i rozwojem). Chociaż systemy te mogą być używane do monitorowania fluorescencji, z naszego doświadczenia wynika, że PDMS używany do tworzenia innych technologii obrazowania pojedynczych robaków jest podatny na tworzenie mikropęcherzyków, wychwytywanie cząstek stałych i inne drobne nieprawidłowości, które generują nieregularne artefakty fluorescencyjne, które zakłócają spójną wizualizację fluorescencji i kwantyfikację, szczególnie w zakresie emisji GFP, najpowszechniejszego fluoroforu stosowanego w badaniach nad C. elegans. Do tej pory obrazowanie fluorescencyjne na żywo poszczególnych zwierząt C. elegans w sposób podłużny opiera się głównie na urządzeniach mikroprzepływowych17.
Tutaj opisujemy nowatorską metodę hodowli poszczególnych C. elegans na stałych podłożach, która jest kompatybilna zarówno z interwencjami awersyjnymi, jak i bezpośrednim obrazowaniem fluorescencyjnym. Podejście to jest podobne w koncepcji do innych technologii obrazowania pojedynczego robaka, z wyjątkiem tego, że niestandardowo formowany chip PDMS został zastąpiony dostępnymi na rynku mikrotacami polistyrenowymi pierwotnie opracowanymi do testów mikrocytotoksyczności (powszechnie nazywanymi również tacami Terasaki)18. Te mikrotace zawierają studzienki, które można wypełnić stałymi pożywkami i zasiać pokarmem bakteryjnym, ściśle naśladując środowisko doświadczane przez zwierzęta przy użyciu standardowej metodologii hodowli ciał stałych NGM. Każda studnia jest otoczona awersyjną barierą z kwasu palmitynowego, a nie siarczanu miedzi. Kwas palmitynowy jest powszechnie stosowany w celu zapobiegania ucieczce robaków z pożywki stałej, przy użyciu standardowej hodowli grupowej na płytkach Petriego w eksperymentach, w których robaki są poddawane awersyjnemu środowisku, takiemu jak ograniczenia dietetyczne lub narażenie na stresor chemiczny. Mikrotacki wytwarzają również minimalne i spójne tło fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie fluorescencyjne zwierząt bezpośrednio w ich środowisku hodowlanym. Ten nowy system hodowli pojedynczych zwierząt na bazie agaru nie tylko pozwala na śledzenie poszczególnych zwierząt przez całe życie oraz monitorowanie wzrostu, rozwoju, aktywności i długości życia, ale jest również kompatybilny z bezpośrednią mikroskopią fluorescencyjną. Ponieważ robaki mogą być obrazowane bez paraliżu lub fiksacji, biomarkery fluorescencyjne in vivo można określić ilościowo w ujęciu wzdłużnym u poszczególnych zwierząt pozostających na pożywce hodowlanej, co pozwala na obserwację dynamicznych zmian w ciągu życia każdego zwierzęcia. Ten system hodowli jest również kompatybilny z automatyczną generacją systemów do śledzenia długości życia i innych wskaźników zdrowotnych14,19. Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli poszczególnych C. elegans w tym systemie opartym na mikrotacach, omawiamy potencjalne pułapki i rozwiązywanie problemów oraz omawiamy zalety i ograniczenia w stosunku do innych systemów, a w szczególności zaktualizowany i zoptymalizowany protokół WorMotel15.
Każde środowisko hodowli pojedynczych robaków składa się z mikrotacki zamontowanej wewnątrz standardowej tacki jednodołkowej za pomocą niestandardowego adaptera wydrukowanego w 3D (Rysunek 1A). Studnie są wypełnione niskotopliwymi pożywkami hodowlanymi nicieni agarozowych (lmNGM), obsiane skoncentrowanymi bakteriami jako źródłem pożywienia i otoczone powłoką z kwasu palmitynowego, aby zapobiec ucieczce robaków (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Przestrzeń między tacą mikro a ściankami płytki jednodołkowej jest wypełniona nasyconymi kryształkami wody, aby utrzymać wilgotność (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Na pokrywę tacki nakładana jest powłoka detergentowa, aby zapobiec kondensacji. Do każdej studzienki dodaje się pojedynczego robaka, a tacę z pojedynczą studzienką uszczelnia się Parafilmem, aby utrzymać wilgoć i umożliwić wymianę tlenu. Jeden doświadczony badacz może przygotować równolegle do sześciu mikrotac.

<table><tbody><tr><td>Drukowane w 3D wkładki terasaki</td><td>Firma drukarska na zamówienie</td><td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL</td><td>Druk FDM, rozmiar dyszy 0,6 mm przy użyciu standardowych systemów PLA plus filament</td></tr><tr><td>AirClean AC624LF pionowym wyciągiem z przepływem laminarnym</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-100-4376</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Bacto</td><td>Thermo Scientific</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 </td><td>Acros organics</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>N2</td><td>Szczep typu dzikiego</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Goldbio</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>101380</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp;</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td>OP50</td><td>Standardowy pokarm laboratoryjny dla C. elegans</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Millipore</td><td>ex0276-4</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>FUdR&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>F10705-1.0</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżające kryształy wody&nbsp;</td><td>M2 Polymer Technologies</td><td>Typ S</td><td>Super chłonny polimer typu S</td></tr><tr><td>Izopropyl &szlig;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>GoldBio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>Chusteczki do zadań</td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>BD Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Aparat monochromatyczny Leica K5 sCMOS</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica M205 FCA</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Research Products International</td><td>A20070-250.0</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M-8900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray Płytka jednodołkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>264728</td><td></td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Sigma</td><td>N1538</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>Acros organics</td><td>129700010</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Coastwide Professional</td><td>365374</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Sieciownik UV</td></tr><tr><td>Tacki Terasaki (Lambda)</td><td>One Lambda</td><td>151431</td><td></td></tr><tr><td>Thermolyne Dri-bath</td><td>Thermolyne</td><td>DB28125</td><td></td></tr><tr><td>Tween&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr></tbody></table>

długotrwała hodowla poszczególnych caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans są powszechnie używane do badania biologii starzenia. Standardową praktyką w badaniach starzenia się C. elegans jest hodowla grup robaków na stałych pożywkach wzrostowych nicieni (NGM), co pozwala na efektywne gromadzenie danych na poziomie populacji dotyczących przeżycia i innych fenotypów fizjologicznych oraz okresowe pobieranie próbek subpopulacji w celu ilościowej oceny biomarkerów fluorescencyjnych. Ograniczeniem tego podejścia jest niemożność (1) śledzenia poszczególnych robaków w czasie w celu opracowania trajektorii wieku dla interesujących fenotypów oraz (2) monitorowania biomarkerów fluorescencyjnych bezpośrednio w kontekście środowiska hodowli. Alternatywne podejścia do hodowli wykorzystują kulturę płynną lub mikrofluidyczną do monitorowania poszczególnych zwierząt w czasie, w niektórych przypadkach z uwzględnieniem kwantyfikacji fluorescencji, z kompromisem polegającym na tym, że środowisko hodowli różni się kontekstowo od stałego NGM. WorMotel to wcześniej opisane mikrofabrykowane urządzenie wielodołkowe do hodowli izolowanych robaków na stałym NGM. Każdy robak jest utrzymywany w studni zawierającej stały NGM otoczony fosą wypełnioną siarczanem miedzi, środkiem odstraszającym kontakt z C. elegans, umożliwiającym wzdłużne monitorowanie poszczególnych zwierząt. Uważamy, że siarczan miedzi jest niewystarczający, aby zapobiec ucieczce robaków poddanych awersyjnym interwencjom powszechnym w badaniach nad starzeniem się, w tym ograniczeniom dietetycznym, bakteriom chorobotwórczym i czynnikom chemicznym wywołującym stres komórkowy. Urządzenia wielodołkowe są również formowane z polidimetylosiloksanu, który wytwarza artefakty o wysokim poziomie tła podczas obrazowania fluorescencyjnego. Protokół ten opisuje nowe podejście do hodowli izolowanych glist na stałym NGM przy użyciu dostępnych na rynku mikrotac polistyrenowych, pierwotnie zaprojektowanych do typowania ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), umożliwiając pomiar przeżycia, fenotypów fizjologicznych i fluorescencji przez całe życie. Bariera z kwasem palmitynowym zapobiega ucieczce robaków, nawet w przypadku awersyjnych warunków. Każda płytka może hodować do 96 zwierząt i łatwo dostosowuje się do różnych warunków, w tym ograniczeń dietetycznych, RNAi i dodatków chemicznych, a także jest kompatybilna z automatycznymi systemami zbierania danych dotyczących długości życia i aktywności.

Opisane tutaj środowisko hodowli pojedynczych nicieni w mikropłytkach może być wykorzystane do monitorowania różnych fenotypów, w tym długości życia i okresu zdrowia (health span), aktywności i ruchu, kształtu ciała i geometrii pełzania, a także ekspresji transgenicznych fluorescencyjnych biomarkerów w poszczególnych osobnikach w czasie. System hodowli w mikropłytkach jest zgodny z analizą długości życia przeprowadzaną zarówno poprzez ręczną ocenę, jak i zbieranie obrazów i późniejszą analizę obrazowania. Podobnie jak w ...

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Chociaż istnieją inne metody hodowli ciał stałych, jest to pierwszy system hodowli ciał stałych, który umożliwia automatyczne śledzenie podłużne życia i długości zdrowia poszczególnych zwierząt oraz obrazowanie podłużne biomarkerów fluorescencyjnych w jednym systemie. Protokół ten zapewnia porównywalne wyniki ze standardowymi eksperymentami C.elegans na stałym NGM i jest kompatybilny zarówno z interwencjami awersyjnymi, jak i bezpośrednim obrazowaniem fluorescencyjnym na żywo. System ten będzie nieoceniony w badaniach nad starzeniem się, zwłaszcza w odniesieniu do długotrwałego narażenia na stresory środowiskowe oraz obserwacji dynamiki genów i białek przez dłuższy czas.Unikanie zanieczyszczenia i konsekwentne suszenie w studniach są wyzwaniem. Podkreśliliśmy kluczowe punkty w pisemnym protokole, aby zminimalizować te problemy. Na początek zmiel 500 miligramów stałego kwasu palmitynowego w moździerzu i tłuczku.Połącz go z 15 mililitrami TWEEN 20 w stożkowej fiolce o pojemności 50 mililitrów i wymieszaj przez wirowanie, aby rozpuścić kryształy. Dodaj 17,5 mililitra 100% etanolu i wymieszaj roztwór, aby rozpuścić jak najwięcej kwasu palmitynowego. Następnie dodaj 17,5 mililitra ultraczystej wody i energicznie wiruj.Delikatnie podgrzej roztwór w kąpieli perełkowej w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż kwas palmitynowy całkowicie się rozpuści. Podgrzej kąpiel perełkową do 80 stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed użyciem podamy jeden mililitr roztworu roboczego kwasu palmitynowego na mikrotacę do oddzielnego sterylnego pojemnika i dodaj cztery mikrolitry nystatyny na jeden mililitr roztworu kwasu palmitynowego przed podgrzaniem.Teraz spryskaj wnętrze i zewnątrz mikrotacki etanolem do nasycenia i strząśnij nadmiar etanolu. Aby wysterylizować mikrotackę, umieść płytkę i pokrywkę oddzielnie w sieciowniku UV. Po 20 minutach odwróć talerz i pokrywkę.Następnie umieść 15-mililitrową stożkową fiolkę z roztworem roboczym kwasu palmitynowego w kąpieli perełkowej i pozwól, aby wszelkie widoczne kryształy całkowicie się rozpuściły przed użyciem. Rozgrzej mikrotackę, umieszczając ją na półce otaczającej wannę z koralikami z założonymi pokrywkami na dwie minuty. Zdejmij pokrywę tacki Microtray i powoli dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego kwasu palmitynowego przez tylną ściankę mikrotacy.Załóż pokrywki i pozostaw tackę na kąpieli perełkowej na dwie do trzech minut, aby roztwór kwasu palmitynowego osiadł na dnie mikrotacy. Obróć mikrotackę o 180 stopni i dodaj roztwór roboczy kwasu palmitynowego, jak pokazano wcześniej. Przygotuj lmNGM, dodając składniki opisane w manuskrypcie.Następnie odpipetować 20 mikrolitrów lmNGM do każdej mikrotacki umieszczonej na stole. Pamiętaj, aby zakryć tackę Microtray podczas napełniania pipety, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Aby zasiać dołki Microtray pokarmem bakteryjnym, odwiruj kulturę wyhodowaną przez noc w temperaturze 3 500 G przez 20 minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulturę bakterii w dziesięciokrotnym stężeniu z 85-milimolowym roztworem chlorku sodu. Następnie ostrożnie odpipetować pięć mikrolitrów dziesięciokrotnie skoncentrowanej kultury bakteryjnej na powierzchnię lmNGM w każdym dołku. Nie pozwól, aby kultura bakterii przepłynęła przez ścianę studni i wpadła do kwasu palmitynowego, ponieważ przyciągnie to robaki do opuszczenia studni.Umieść sterylną wkładkę wydrukowaną w 3D na sterylnej płytce jednodołkowej. Umieść tacę Microtray w wydrukowanym w 3D adapterze w płytce jednodołkowej. Obficie dozuj kryształki wody na wierzchu wydrukowanej w 3D wkładki między zewnętrzną studzienką mikrotacki a wewnętrzną ścianką płytki jednodołkowej.Jeśli robaki nie są dodawane natychmiast, zamknij mikrotackę, aby użyć jej następnego dnia. Zamknij pokrywę tacki i użyj jednego kawałka Parafilmu, aby owinąć wszystkie cztery strony, aby uszczelnić Microtray. Powtórz etap uszczelniania z Parafilm jeszcze dwa razy dla trzech warstw.Dodaj jednego robaka na studzienkę, gdy osiągną pożądany etap życia. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu detergentu do pokrywki płytki jednodołkowej i użyj chusteczki roboczej, aby równomiernie pokryć pokrywkę. Użyj dodatkowych chusteczek roboczych, aby rozprowadzić roztwór detergentu, aż widzenie przez pokrywkę nie zostanie zniekształcone.Lekko rozciągnij pierwszy kawałek Parafilmu, aby pokryć dwie strony tacy. Przetrzyj górną część tacki chusteczką zadaniową i zwilż ją 70% etanolem, aby usunąć wszelkie odciski palców. Zmierz żywotność, delikatnie stukając w bok lub górę płytki lub świecąc jasnym niebieskim światłem na talerz i obserwując każde zwierzę.Zabij zwierzę, jeśli nie poruszy się w ciągu kilku sekund. Powtarzaj to zadanie co jeden do trzech dni, aż wszystkie robaki umrą. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne na pojedynczych studzienkach.Narażenie na siarczan miedzi i ditiotreitol znacznie skróciło żywotność robaków i długość zdrowia. W przeciwieństwie do tego, siarczan miedzi zmniejszał odsetek życia spędzonego w dobrym zdrowiu, podczas gdy ditiotreitol nie. Siarczan miedzi zmniejszał średnią aktywność u osób w populacji w większym stopniu niż ditiotreitol we wszystkich grupach wiekowych.Średnia populacji na obszarze występowania poszczególnych zwierząt w ramach krzywej aktywności w ciągu całego życia jest znacznie zaniżona przez siarczan miedzi lub ditiotreitol. Skumulowana aktywność dla poszczególnych zwierząt do 10 dnia koreluje z ich długością życia u zwierząt upominających się ditionitreitolem, ale nie u zwierząt kontrolnych nieleczonych lub upośledzonych siarczanem miedzi. Drastyczny wzrost ekspresji KYNU-1 obserwuje się między trzecim a ósmym dniem dorosłości, a następnie następuje postępujący spadek wraz z wiekiem.Skumulowana ekspresja mScarlet KYNU-1 do 14 dnia dorosłości koreluje z długością życia zwierząt. Ponieważ ekspresja KYNU-1 jest dynamiczna przez całe życie, porównaliśmy ekspresję KYNU-1 w różnym wieku z całkowitym przeżyciem u poszczególnych zwierząt. W żadnym pojedynczym punkcie czasowym ekspresja KYNU-1 nie była istotnie skorelowana z przeżyciem.Podczas próby tej procedury najważniejszymi krokami są dodanie kwasu palmitynowego, pipetowanie agaru i wprowadzenie robaków. Technika ta umożliwia podłużne śledzenie długości życia i zdrowia, a także biomarkerów fluorescencyjnych u poszczególnych robaków w sposób bezpośrednio porównywalny z testami NGM.

long-term-culture-individual-caenorhabditis-elegans-on-solid-media

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Poznaj metodę hodowli C. elegans na pożywkach stałych z barierą kwasu palmitynowego do długotrwałego śledzenia żywotności, zdrowia i fluorescencji biomarkerów. Protokół umożliwia interwencje awersyjne i automatyczne obrazowanie.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Przeglądaj więcej filmów