Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych
2 grudnia 2022
Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.
Chociaż istnieją inne metody hodowli ciał stałych, jest to pierwszy system hodowli ciał stałych, który umożliwia automatyczne śledzenie podłużne życia i długości zdrowia poszczególnych zwierząt oraz obrazowanie podłużne biomarkerów fluorescencyjnych w jednym systemie. Protokół ten zapewnia porównywalne wyniki ze standardowymi eksperymentami C.elegans na stałym NGM i jest kompatybilny zarówno z interwencjami awersyjnymi, jak i bezpośrednim obrazowaniem fluorescencyjnym na żywo. System ten będzie nieoceniony w badaniach nad starzeniem się, zwłaszcza w odniesieniu do długotrwałego narażenia na stresory środowiskowe oraz obserwacji dynamiki genów i białek przez dłuższy czas.
Unikanie zanieczyszczenia i konsekwentne suszenie w studniach są wyzwaniem. Podkreśliliśmy kluczowe punkty w pisemnym protokole, aby zminimalizować te problemy. Na początek zmiel 500 miligramów stałego kwasu palmitynowego w moździerzu i tłuczku.
Połącz go z 15 mililitrami TWEEN 20 w stożkowej fiolce o pojemności 50 mililitrów i wymieszaj przez wirowanie, aby rozpuścić kryształy. Dodaj 17,5 mililitra 100% etanolu i wymieszaj roztwór, aby rozpuścić jak najwięcej kwasu palmitynowego. Następnie dodaj 17,5 mililitra ultraczystej wody i energicznie wiruj.
Delikatnie podgrzej roztwór w kąpieli perełkowej w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż kwas palmitynowy całkowicie się rozpuści. Podgrzej kąpiel perełkową do 80 stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed użyciem podamy jeden mililitr roztworu roboczego kwasu palmitynowego na mikrotacę do oddzielnego sterylnego pojemnika i dodaj cztery mikrolitry nystatyny na jeden mililitr roztworu kwasu palmitynowego przed podgrzaniem.
Teraz spryskaj wnętrze i zewnątrz mikrotacki etanolem do nasycenia i strząśnij nadmiar etanolu. Aby wysterylizować mikrotackę, umieść płytkę i pokrywkę oddzielnie w sieciowniku UV. Po 20 minutach odwróć talerz i pokrywkę.
Następnie umieść 15-mililitrową stożkową fiolkę z roztworem roboczym kwasu palmitynowego w kąpieli perełkowej i pozwól, aby wszelkie widoczne kryształy całkowicie się rozpuściły przed użyciem. Rozgrzej mikrotackę, umieszczając ją na półce otaczającej wannę z koralikami z założonymi pokrywkami na dwie minuty. Zdejmij pokrywę tacki Microtray i powoli dodaj 200 mikrolitrów roztworu roboczego kwasu palmitynowego przez tylną ściankę mikrotacy.
Załóż pokrywki i pozostaw tackę na kąpieli perełkowej na dwie do trzech minut, aby roztwór kwasu palmitynowego osiadł na dnie mikrotacy. Obróć mikrotackę o 180 stopni i dodaj roztwór roboczy kwasu palmitynowego, jak pokazano wcześniej. Przygotuj lmNGM, dodając składniki opisane w manuskrypcie.
Następnie odpipetować 20 mikrolitrów lmNGM do każdej mikrotacki umieszczonej na stole. Pamiętaj, aby zakryć tackę Microtray podczas napełniania pipety, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Aby zasiać dołki Microtray pokarmem bakteryjnym, odwiruj kulturę wyhodowaną przez noc w temperaturze 3 500 G przez 20 minut.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulturę bakterii w dziesięciokrotnym stężeniu z 85-milimolowym roztworem chlorku sodu. Następnie ostrożnie odpipetować pięć mikrolitrów dziesięciokrotnie skoncentrowanej kultury bakteryjnej na powierzchnię lmNGM w każdym dołku. Nie pozwól, aby kultura bakterii przepłynęła przez ścianę studni i wpadła do kwasu palmitynowego, ponieważ przyciągnie to robaki do opuszczenia studni.
Umieść sterylną wkładkę wydrukowaną w 3D na sterylnej płytce jednodołkowej. Umieść tacę Microtray w wydrukowanym w 3D adapterze w płytce jednodołkowej. Obficie dozuj kryształki wody na wierzchu wydrukowanej w 3D wkładki między zewnętrzną studzienką mikrotacki a wewnętrzną ścianką płytki jednodołkowej.
Jeśli robaki nie są dodawane natychmiast, zamknij mikrotackę, aby użyć jej następnego dnia. Zamknij pokrywę tacki i użyj jednego kawałka Parafilmu, aby owinąć wszystkie cztery strony, aby uszczelnić Microtray. Powtórz etap uszczelniania z Parafilm jeszcze dwa razy dla trzech warstw.
Dodaj jednego robaka na studzienkę, gdy osiągną pożądany etap życia. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu detergentu do pokrywki płytki jednodołkowej i użyj chusteczki roboczej, aby równomiernie pokryć pokrywkę. Użyj dodatkowych chusteczek roboczych, aby rozprowadzić roztwór detergentu, aż widzenie przez pokrywkę nie zostanie zniekształcone.
Lekko rozciągnij pierwszy kawałek Parafilmu, aby pokryć dwie strony tacy. Przetrzyj górną część tacki chusteczką zadaniową i zwilż ją 70% etanolem, aby usunąć wszelkie odciski palców. Zmierz żywotność, delikatnie stukając w bok lub górę płytki lub świecąc jasnym niebieskim światłem na talerz i obserwując każde zwierzę.
Zabij zwierzę, jeśli nie poruszy się w ciągu kilku sekund. Powtarzaj to zadanie co jeden do trzech dni, aż wszystkie robaki umrą. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne na pojedynczych studzienkach.
Narażenie na siarczan miedzi i ditiotreitol znacznie skróciło żywotność robaków i długość zdrowia. W przeciwieństwie do tego, siarczan miedzi zmniejszał odsetek życia spędzonego w dobrym zdrowiu, podczas gdy ditiotreitol nie. Siarczan miedzi zmniejszał średnią aktywność u osób w populacji w większym stopniu niż ditiotreitol we wszystkich grupach wiekowych.
Średnia populacji na obszarze występowania poszczególnych zwierząt w ramach krzywej aktywności w ciągu całego życia jest znacznie zaniżona przez siarczan miedzi lub ditiotreitol. Skumulowana aktywność dla poszczególnych zwierząt do 10 dnia koreluje z ich długością życia u zwierząt upominających się ditionitreitolem, ale nie u zwierząt kontrolnych nieleczonych lub upośledzonych siarczanem miedzi. Drastyczny wzrost ekspresji KYNU-1 obserwuje się między trzecim a ósmym dniem dorosłości, a następnie następuje postępujący spadek wraz z wiekiem.
Skumulowana ekspresja mScarlet KYNU-1 do 14 dnia dorosłości koreluje z długością życia zwierząt. Ponieważ ekspresja KYNU-1 jest dynamiczna przez całe życie, porównaliśmy ekspresję KYNU-1 w różnym wieku z całkowitym przeżyciem u poszczególnych zwierząt. W żadnym pojedynczym punkcie czasowym ekspresja KYNU-1 nie była istotnie skorelowana z przeżyciem.
Podczas próby tej procedury najważniejszymi krokami są dodanie kwasu palmitynowego, pipetowanie agaru i wprowadzenie robaków. Technika ta umożliwia podłużne śledzenie długości życia i zdrowia, a także biomarkerów fluorescencyjnych u poszczególnych robaków w sposób bezpośrednio porównywalny z testami NGM.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy protokół hodowli na podłożu stałym dla izolowanych nicieni, umożliwiający dożywotnie śledzenie fizjologiczne oraz kwantyfikację fluorescencji. System ten zawiera barierę z kwasu palmitynowego, co pozwala na zastosowanie interwencji awersyjnych, takich jak bakterie patogenne i stresory chemiczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Badania nad starzeniem
- Monitorowanie fizjologiczne
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Obecne ograniczenia w śledzeniu długości życia poszczególnych nicieni.
- Potrzeba zintegrowanych systemów kompatybilnych z różnymi interwencjami.
- Znaczenie zrozumienia dynamiki genów w kontekście starzenia się.
Zastosowane metody
- Kultura stała nicieni na barierze z kwasu palmitynowego.
- Organizm modelowy: C. elegans.
- Obrazowanie fluorescencyjne i monitorowanie parametrów fizjologicznych.
Główne wyniki
- Wykazano użyteczność nowego systemu hodowli w badaniach nad starzeniem.
- Ekspozycja na siarczan miedzi i ditiotreitol wpłynęła w różny sposób na długość życia oraz okres zdrowia.
- Dynamiczna ekspresja KYNU-1 korelowała z długością życia, co podkreśla złożoność regulacji genów.
Wnioski
- Badanie dostarcza wiarygodnego protokołu monitorowania stanu zdrowia i długowieczności nicieni.
- Istotne implikacje dla przyszłych badań nad czynnikami stresowymi i ekspresją genetyczną związaną ze starzeniem się.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużne monitorowanie poszczególnych osobników Caenorhabditis elegans na podłożach stałych umożliwia wysokorozdzielcze śledzenie długości życia, okresu zdrowia oraz dynamicznej ekspresji biomarkerów przy różnych interwencjach. System ten wypełnia istotną lukę w biologii starzenia się i stresu, wspierając bezpośrednią, zautomatyzowaną kwantyfikację fluorescencji w środowisku istotnym fizjologicznie. Takie podejście zwiększa pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów i ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach procesów odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie dynamiki genów i białek w oparciu o postawione hipotezy w całym cyklu życia poszczególnych organizmów.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji wpływu interwencji na przeżywalność oraz długość życia w zdrowiu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki podłużnemu monitorowaniu biomarkerów w odpowiedzi na stresory.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje walidowane, reprodukowalne układy biologiczne do dalszego przesiewania interwencji genetycznych lub chemicznych.
- Standaryzuje ilościowe odczyty fluorescencji i przeżywalności w celu opracowania niezawodnych testów.
- Umożliwia skalowalny, zautomatyzowany zbiór danych kompatybilny z wysokoprzepustowymi procesami analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli stresu istotnych dla danej choroby do translacyjnego odkrywania biomarkerów w badaniach nad starzeniem.
- Zapewnia ciągłość od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie długoterminowego zbierania danych na poziomie indywidualnym.
- Usprawnia decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez korelację dynamicznej ekspresji biomarkerów z przeżywalnością.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do szlaków starzenia się i odpowiedzi na stres.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie kontrolowanych, podłużnych badań interwencyjnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników dla screeningu związków chemicznych lub genetycznego w warunkach istotnych fizjologicznie.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe pomiary przeżywalności, aktywności i fluorescencji w czasie, co umożliwia rzetelną analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną poprzez modelowanie przewlekłej ekspozycji i dynamiki biomarkerów w systemie skalowalnym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych interwencji i która jest kompatybilna z automatycznym pozyskiwaniem danych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w badaniach podłużnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka hipotez biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących biologii starzenia i stresu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z nicciami, obrazowaniu fluorescencyjnym oraz analizie danych podłużnych.
- Wymaga dostępu do polistyrenowych mikroplatek, platform obrazujących oraz infrastruktury kontroli parametrów środowiskowych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania pożywek i protokołów interwencyjnych.
- Metoda jest dostosowalna do różnych tła genetycznych i rodzajów interwencji, lecz jest wrażliwa na kontaminację i spójność procesu wysychania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują staranne nakładanie barier oraz precyzyjne pipetowanie w celu zapobieżenia ucieczce zwierząt i zapewnienia integralności danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Prepare Palmitic Acid Working Solution
1:27
Applying Palmitic Acid Coating to Microtray
2:53
Loading the Microtray with Low‐Melt Nematode Growth Media (lmNGM) and Seeding the Microtray Wells with Bacterial Food
3:47
Enclosing Each Microtray Inside a Single‐Well Plate
4:25
Adding Worms to the Microtray and Preparing the Culture Environment for Long‐Term Use
5:01
Imaging Individual Worms in Microtray Wells
5:27
Results: Correlation of Phenotypes in Individual Animals Across Populations
6:53
Conclusion
