Name: Preparat zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej do sekwencjonowania pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj metodę przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej (Oreochromis niloticus) do sekwencjonowania. Protokół enzymatyczny zapewnia wysoką żywotność komórek i usprawnia badania w akwakulturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hainan (nr 320QN211) oraz Programu Funduszu Badawczego Prowincji Guangdong Kluczowego Laboratorium Kontroli Chorób Zwierząt Wodnych i Zdrowej Kultury Chin (NO. PBEA2021ZD01).

Wszystkie protokoły dla zwierząt podczas tego badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hainan (numer protokołu: HNUAUCC-2022-00063; Data zatwierdzenia: 03-03-2022). Listę sprzętu i materiałów użytych w tym eksperymencie można znaleźć w Tabeli Materiałów. Podsumowanie obecnego protokołu jest zilustrowane na Rysunek 1.
1. Przygotowanie ryb
<ol>
	<li>Pozyskaj 6-miesięczną tilapię nilową o średniej masie ciała 100 g ze sprawdzonego źródła. Wybierz ryby, które są wolne od jakichkolwiek oznak choroby.</li>
	<li>Przestań karmić rybę na 24 godziny przed przejściem do następnego kroku. 
	UWAGA: Post ryb zmniejsza objętość treści jelitowej i ułatwia przygotowanie odcinków jelitowych.</li>
	<li>Opłucz rybę w dobrze napowietrzonej sterylnej wodzie przez 15 minut, aby zmyć luźno związane bakterie z powierzchni ciała.</li>
	<li>Poddaj rybę eutanazji metanosulfonianem trikainy o stężeniu 300 mg/l (MS-222) przez około 10 minut, aż do ustania wszelkich ruchów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Przygotować 0,08% sól fizjologiczną buforowaną fosforanami BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, do płukania komórek i ponownego zawieszania). Rozpuścić 0,08 g BSA (0,8% w/v) w 100 ml 1x DPBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C, a po użyciu wstępnie schłodzić na lodzie. 
	UWAGA: Dodatek BSA jest korzystny dla zminimalizowania zbrylania się komórek. Współczynnik BSA można zwiększyć z 0,04% do 1% w zależności od warunków zlepiania się komórek.</li>
	<li>Przygotować odczynnik enzymatyczny do dysocjacji komórek.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kolagenazę/dypazę 1x PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml (0,1 U/ml kolagenazy i 0,8 U/ml dypazy). Upewnij się, że używany jest PBS, a nie DPBS. 
		UWAGA: PBS dostarcza jony wapnia potrzebne do prawidłowego funkcjonowania enzymu. DPBS nie powinien być używany na tym etapie, ponieważ jest wolny od Ca2 + / Mg2 +. Dodatkowo w obecnym protokole stosowana jest kolagenaza typu I.</li>
		<li>Przefiltrować rozcieńczenie przez sterylny filtr membranowy 0,22 μm.</li>
		<li>Przygotować odczynnik do dysocjacji komórek, który składa się z 95% objętości roztworu kolagenazy/dypazy i 5% objętości płodowej surowicy bydlęcej (FBS). 
		UWAGA: Odczynnik dysocjacyjny powinien być świeży za każdym razem, gdy jest używany. Stosowanie 5% FBS pomaga utrzymać żywotność komórek podczas trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór błękitu trypanowego.
	<ol>
		<li>Weź roztwór błękitu trypanowego z lodówki o temperaturze 4 °C i trzymaj go w temperaturze 15-20 °C przez kilka minut przed użyciem, aby zapobiec wytrącaniu się osadów.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez sterylną membranę 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Przed użyciem schłodzoną wirówkę należy schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Zaopatrz się w sterylne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml bez RNaz, probówki stożkowe o pojemności 50 ml, szklane pipety i końcówki o szerokim otworze, filtry membranowe, sitka do komórek oraz wszystkie probówki i końcówki o niskiej retencji.</li>
	<li>Autoklaw szklanych pipet i narzędzi do preparowania, w tym kleszczy, nożyczek i skalpeli, a następnie wstępnie potraktuj je roztworem do usuwania RNazy, aby zapobiec niepożądanym skutkom RNazy dla sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.</li>
</ol>
4. Sekcja tkanek i dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Umieść uśpioną rybę na lodzie w celu sekcji. Aseptycznie zbierz 3-4 cm środkowego odcinka jelita i wytnij jak najwięcej tłuszczu i krezki. Ostrożnie usunąć tłuszcz przyczepiony do powierzchni jelita oraz warstwę elastycznej i plastycznej przezroczystej błony śluzowej za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Tłuszcz i krezka są przyczepione do zewnętrznej powierzchni jelita.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej tłuszczu, aby zapobiec jego niekorzystnemu wpływowi na protokół dysocjacji. Za pomocą strzykawki delikatnie przepłucz fragmenty sterylnym, lodowatym PBS kilka razy, aby zmyć zawartość jelitową i śluz. Unikaj nieostrożnego obchodzenia się.</li>
	<li>Rozetnij fragment jelita na małe kawałki i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 1 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie usunąć supernatant i zastąpić 1 ml lodowatego 0,08% BSA-DPBS. Ponownie zawiesić fragmenty tkanki poprzez delikatne aspiracje za pomocą szklanej pipety. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Usunąć supernatant i wytrawić fragmenty tkanek za pomocą 1 ml odczynnika dysocjacji enzymatycznej (950 μl roztworu kolagenazy/dypazy i 50 μl FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
	<ol>
		<li>Dodatkowo dodać 5 μl inhibitora RNazy (40 U/μL w roztworze podstawowym) do odczynnika dysocjacyjnego, jeśli próbki są przygotowane do sekwencjonowania RNA jednokomórkowego. 
		UWAGA: Końcowe stężenie mieszaniny kolagenazy i dypazy wynosi 1 mg/ml, w tym kolagenaza w stężeniu 0,1 U/ml i dyspaza w stężeniu 0,8 U/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręcznie odwracaj rurkę w odstępach 5 minut podczas 30-60 minutowej kąpieli wodnej. 
	UWAGA: Dokładny czas inkubacji różni się w zależności od użytych tkanek. Sprawdzaj postęp dysocjacji pod mikroskopem, aż nie będzie widać tkanki masowej. Umieścić 10 μl zawiesiny komórek na szkiełku podstawowym za pomocą pipety i zbadać je pod mikroskopem. Wydłuż czas trawienia, jeśli komórki nie są całkowicie zdysocjowane.</li>
	<li>Obracać probówki o masie 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie usunąć odczynnik do dysocjacji komórek enzymatycznych za pomocą końcówek o szerokim otworze. Dodaj 1 ml lodowatego 0,08% BSA-DPBS i delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze przez 1 minutę.
	<ol>
		<li>Powtórz ten krok dwukrotnie. 
		UWAGA: Pipetowanie w górę i w dół należy wykonywać ostrożnie przy użyciu końcówek o szerokim otworze i niskiej retencji, aby zapobiec rozerwaniu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępnie zwilż sitko o wielkości 40 μm 0,08% BSA-DPBS i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko. Postukaj i spłucz dodatkowym 200 μl DPBS, a następnie zbierz zawiesinę na dnie tubki.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 5 μl DNazy I (1 U/μl) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 15-20 °C. Wirować w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 400 μl lodowatego DPBS (bez Ca2+/Mg2+). Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą końcówek o szerokim otworze, aby wymieszać komórki. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
</ol>
5. Barwienie i badanie mikroskopowe
<ol>
	<li>W celu barwienia zawiesinę komórkową należy zmieszać z 0,4% roztworem błękitu trypanowego w stosunku 1:1. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5-10 μl mieszaniny do hemocytometru i zbadać pod mikroskopem. 
	UWAGA: Żywe komórki będą miały niebarwioną cytoplazmę, podczas gdy martwe komórki będą miały niebieską cytoplazmę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Policz pod mikroskopem żywe i martwe komórki w trzech różnych polach. Oblicz procent żywotności komórek, dzieląc liczbę żywotnych komórek przez całkowitą liczbę komórek w polu. 
	UWAGA: Żywotność komórek powinna być większa niż 85%, a stężenie komórek nie powinno być mniejsze niż 1 x 105-1 x 107 / ml. Tło zawiesiny komórek powinno być czyste, bez grudek, fragmentów lub zanieczyszczeń.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+sequencing%3A+new+developments+and+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The single-cell sequencing: new developments and medical applications.</a> Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+human+skin+identifies+novel+fibroblast+subpopulation+and+enrichment+of+immune+subsets+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Wen, L., Tang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+epigenome+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell epigenome sequencing technologies.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+coupled+with+bioinformatics+reveals+PHYH+as+a+potential+biomarker+in+kidney+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).</li>
<li>Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+for+the+study+of+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease.</a> Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).</li>
<li>Andrews, T. S., Hemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cell+populations+with+scRNASeq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identifying cell populations with scRNASeq.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+new+gill+cell+line+from+the+striped+catfish%2C+Pangasianodon+hypophthalmus+%28Sauvage%2C+1878%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878).</a> Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+high-quality+primary+cell+culture+from+fish+pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+caudal+fin-derived+cell+line%2C+AOF%2C+from+the+Oscar%2C+Astronotus+ocellatus%5BTitle%5D)+AND+%22FishPhysiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus.</a> FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).</li>
<li>Schnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+reconstruction%2C+primary+culture+and+experimental+use+of+rainbow+trout+gill+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia.</a> Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).</li>
<li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li>
<li>Ayyaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+the+regenerating+intestine+reveal+a+revival+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell.</a> Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).</li>
<li>Pan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+neuroepithelial+cells+and+other+cell+types+of+the+gills+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+exposed+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia.</a> Scientific Reports. 12, 10144(2022).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36(2010).</li>
<li>Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+changes+in+cell+shape+and+chromatin+structure+result+in+radiosensitization+of+monolayer+Chinese+hamster+V79+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).</li>
<li>Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+trypsinization+and+alternative+procedures+for+cell+preparation+before+RNA+extraction+on+RNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity.</a> Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+activity+of+smooth+muscle+L-type+Ca2%2B+channels+and+its+reversal+by+NF-kappaB+inhibitors+in+Crohn%27s+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).</li>
<li>Chung, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequences+and+domain+structures+of+mammalian%2C+avian%2C+amphibian+and+teleost+tropoelastins%3A+Clues+to+the+evolutionary+history+of+elastins%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins.</a> Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Merlos-Suárez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+signature+identifies+colorectal+cancer+stem+cells+and+predicts+disease+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).</li>
<li>Glass, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+distinct+population+of+proglucagon-expressing+cells+specific+to+the+mouse+upper+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine.</a> Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
<li>Gu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+size-dependent+effects+of+polystyrene+microplastics+on+immune+and+secretory+cell+populations+from+zebrafish+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines.</a> Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+reveals+a+hepatic+stellate+cell-activation+roadmap+and+myofibroblast+origin+during+liver+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice.</a> Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).</li>
<li>Howard, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Pezoldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+splenic+fibroblasts+reveals+subset-specific+innate+immune+signatures+in+homeostasis+and+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection.</a> Communications Biology. 4 (1), 1355(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Barriga, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mex3a+Marks+a+slowly+dividing+subpopulation+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 30(2016).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+arsenic+and+2%2C2-dichloroacetamide+on+different+cell+populations+of+zebrafish+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver.</a> Science of the Total Environment. 821, 152961(2022).</li>
<li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+world+fisheries+and+aquaculture+2022.+Towards+blue+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agriculture+Organization+of+the+United+Nations+%28FAO%29%22%5BJournal%5D)">The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation.</a> Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).</li>
<li>Beck, B. H., Peatman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeck%2C+BH+%22Mucosal+Health+in+Aquaculture%22">Mucosal Health in Aquaculture</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Lee, H., Engin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+highly+viable+single-cell+suspensions+from+mouse+pancreatic+islets+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100144(2020).</li>
<li>Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+dissociation+protocol+for+generation+of+single+cell+suspension+from+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae.</a> MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Avey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+uncovers+a+robust+transcriptional+response+to+morphine+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia.</a> Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje przygotowanie wysokiej jakości jednokomórkowej zawiesiny jelita tilapii nilowej. Przed dysocjacją konieczne jest usunięcie tłuszczu i krezki z jelita, szczególnie w przypadku jelit ryb mięsożernych z dużą ilością tłuszczu. Użycie strzykawki zamiast twardego skrobania do zmycia treści jelitowej zmniejsza mechaniczne uszkodzenia komórek. Aby zapewnić żywotność komórek, konieczne jest również utrzymanie temperatury na poziomie 20 °C lub niższym na etapie preparacji tkanek i płukania. Roztwory myjące są ...

Komórki są podstawowymi jednostkami organizmów. W porównaniu z badaniami tkanek masowych, badania na poziomie pojedynczej komórki mogą odzwierciedlać heterogeniczność komórek i dostarczać informacji o wyższej rozdzielczości1. W ostatnich latach naukowcy zastosowali technologie sekwencjonowania pojedynczych komórek do badań genomu, transkryptomu, epigenomu lub badań multiomicznych na poziomie pojedynczych komórek u ssaków, danio pręgowanego i innych organizmów modelowych i poinformowali o wielkich przełomach2,3,4,5,6,7. Podczas gdy większość badań koncentrowała się na organizmach modelowych, istnieje niewiele protokołów referencyjnych lub komercyjnych zestawów dysocjacyjnych do sekwencjonowania pojedynczych komórek u ekonomicznych gatunków ryb, co ogranicza zastosowanie sekwencjonowania jednokomórkowego w badaniach nad akwakulturą. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie protokołów dysocjacji tkanek, które wytwarzają wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności komórek i integralności kwasów nukleinowych.
Optymalizacja protokołu dysocjacji tkanek za pomocą odpowiedniego enzymu lub kombinacji enzymów w celu uzyskania wystarczającej liczby żywotnych komórek przy minimalnych uszkodzeniach jest niezbędna. Najskuteczniejszy enzym dysocjacji tkanek różni się w zależności od typu tkanki. U ssaków do przygotowania zawiesin jednokomórkowych dla tkanek stałych ssaków użyto kilku enzymów, w tym kolagenazy, dypazy, trypsyny, papainy, elastazy, hialuronidazy, liberazy, akutazy i trypLE8,9. Trawienie trypsyny w połączeniu z zakłóceniami mechanicznymi było powszechnie stosowane do dysocjacji tkanek w hodowli komórkowej u ryb10,11,12,13,14. Trypsyna była również używana lub dodawana do koktajlu trawiennego w celu dysocjacji tkanek w jelicie szczura15 i tkanka skrzelowa danio pręgowanego16. Jednak z kilku powodów trypsyna nie jest najlepszą opcją do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Sama trypsyna jest zwykle nieskuteczna w dysocjacji tkanek. Dodatkowo trypsyna indukuje pęknięcia nici DNA17,18 i degradację RNA19.
Papaina degraduje białka, które tworzą ścisłe połączenia między komórkami. W komórkach nerwów i mięśni gładkich ssaków papaina jest bardziej wydajna i mniej destrukcyjna niż inne proteazy20,21. Jednak, podobnie jak trypsyna, papaina powoduje agregację komórek indukowaną przez wolne DNA w wyniku lizy komórek, która zachodzi podczas trawienia enzymatycznego9. Elastaza rozkłada elastynę, która zwykle znajduje się w skórze, płucach, więzadłach, ścięgnach i tkankach naczyniowych22. Jest często stosowany w połączeniu z kolagenazą, dypazą lub trypsyną w celu dysocjacji tkanki płucnej8. Hialuronidaza rozszczepia wiązania glikozydowe hialuronanu, przyczyniając się do trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej w różnych tkankach łącznych i skórze9,23.
Ogólnie rzecz biorąc, kolagenaza i dispase są dobrymi opcjami do rozpadu macierzy zewnątrzkomórkowej. Zostały one użyte do dysocjacji jelit ludzkich, mysich i danio pręgowanych24,25,26,27. Kolagenaza niszczy wiązanie peptydowe w kolagenie, wspomaga trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej i uwalnia komórki do zawiesiny, a zatem kolagenaza jest często stosowana do dysocjacji tkanek stałych ludzi i myszy, w tym do wątroby28,29, spleen30, pancreas31 i intestine25. Dypaza jest proteazą, która hydrolizuje N-końcowe wiązania peptydowe niepolarnych reszt aminokwasowych i jest łagodniejsza niż kolagenaza. Rozszczepia składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna, kolagen typu IV i w mniejszym stopniu kolagen typu I, nie wpływając na połączenia komórkowo-komórkowe. Dypaza jest używana oddzielnie lub z innymi enzymami do dysocjacji tkanek, takich jak intestine25,32, brain33, liver34, itd. Ponadto dostępne na rynku koktajle trawienne, w tym liberaza, akutaza i trypLE, są również dobrą alternatywą dla dysocjacji tkanek stałych, szczególnie dla skóry, wątroby i nerek8,9.
Tilapia nilowa (Oreochromis niloticus) należy do rodziny pielęgnicowatych z rzędu Perciformes. Jest to jeden z najbardziej hodowanych gatunków ryb słodkowodnych w obszarach tropikalnych i subtropikalnych, z roczną produkcją 4,5 miliona ton w 2022 roku35. Jest to jeden z najlepiej przebadanych gatunków ryb akwakultury z dobrze opisanym genomem. Tilapia nilowa jest idealnym modelem badawczym dla gatunków ryb akwakultury ze względu na krótki czas generacji, łatwość hodowli i zdolność przystosowania się do szerokiego zakresu środowisk hodowlanych. Jelito jest przedmiotem dużego zainteresowania badawczego, ponieważ jest narządem odżywiania, trawienia i wchłaniania, metabolizmu i odporności błony śluzowej. Jelito jest siedliskiem populacji drobnoustrojów i jest niezbędnym układem odpornościowym tkanki36. Jest aktywny immunologicznie ze względu na obecność wielu typów komórek odpornościowych, w tym makrofagów, limfocytów B, granulocytów i limfocytów T.
W obecnym badaniu opracowaliśmy protokół przygotowania wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej, aby ułatwić badania na poziomie pojedynczych komórek u gatunków ryb akwakultury. Zgodnie z charakterystyką tych enzymów specyficznych dla tkanek i pracami wstępnymi, kolagenaza / dypaza jest odpowiednia do dysocjacji tkanki jelitowej tilapii. Ostatnim typem enzymu, który należy wziąć pod uwagę przy przygotowywaniu zawiesin jednokomórkowych, jest DNaza-I, która zapobiega agregacji komórek poprzez degradację wolnego DNA uwalnianego w wyniku lizy martwych komórek podczas trawienia enzymatycznego bez inicjowania szlaków apoptotycznych9 i zwiększa wydajność żywych komórek36. Dodatkowo albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest dodawana do buforu myjącego w celu zmniejszenia zlepiania się komórek i poprawy żywotności komórek. Kilka firm produkujących odczynniki opisuje BSA jako stabilizator enzymów. Dodatek 0,04%-1% BSA do PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) został wykorzystany do opracowania roztworu myjącego do przygotowania zawiesin do sekwencjonowania pojedynczych komórek bez negatywnych skutków38. Dodanie niskiego stosunku BSA może pomóc w utrzymaniu żywotności komórek i uniknięciu agregacji komórek wywołanej przez wolne DNA w wyniku lizy komórek. Protokół ten może również stanowić cenne odniesienie do opracowywania protokołów dysocjacji komórek z jelit innych gatunków ryb akwakultury.

<table><tbody><tr><td>0,22-&mu; m Sterylny filtr</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SLGV033RB</td><td>Służy do filtrowania i sterylizacji roztworu enzymatycznego.</td></tr><tr><td>40-&mu; m Sitko do komórek</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>F8200</td><td>Sitko do komórek stosuje się w celu wyeliminowania niestrawionych kawałków tkanki.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0098</td><td>w proszku; rozcieńczyć 0,04 g BSA w 100 ml 1&razy; DPBS do przygotowania 0,04% BSA-DPBS bffer myjący. Przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>Kolagenaza/dispaza</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rozcieńczyć</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNaza I pomaga zmniejszyć zlepianie się komórek.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, Ca2+/Mg2+</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600438</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Surowica, stosowana w objętości 5% w roztworze digetstion.</td></tr><tr><td>Odwrócony&nbsp; Mikroskop</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>Służy do badania żywotności komórek.</td></tr><tr><td>Liberaza</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 0,25 mg/ml.</td></tr><tr><td>Nil tilpia (Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift Aquaculture Technology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td>Zdrowe ryby bez objawów chorobowych (średnia masa ciała: 100 g).&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Służy do wirowania petetu tkankowego i komórkowego.</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>Hamuje aktywność RNazy</td></tr><tr><td>Odczynnik RNazy-Be-Gone w fazie stałej</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>Służy do usuwania RNazy z narzędzi takich jak nożyczki preparacyjne i szklane pipety. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Do eutanazji ryb.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>Służy do barwienia martwych komórek.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607001</td><td>Rozcieńczyć PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml.</td></tr></tbody></table>

preparat zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Tilapia nilowa jest jednym z najczęściej hodowanych gatunków ryb słodkowodnych na świecie i jest szeroko stosowanym modelem badawczym do badań nad rybami akwakultury. Przygotowanie wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych jest niezbędne do badań na poziomie pojedynczej komórki, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub genomu. Nie ma jednak gotowego do użycia protokołu dla gatunków ryb akwakultury, w szczególności dla jelita tilapii. Skuteczne enzymy dysocjacyjne różnią się w zależności od typu tkanki. Dlatego niezbędna jest optymalizacja protokołu dysocjacji tkanek poprzez wybór odpowiedniego enzymu lub kombinacji enzymów w celu uzyskania wystarczającej liczby żywotnych komórek przy minimalnym uszkodzeniu. Badanie to ilustruje zoptymalizowany protokół przygotowania wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej z kombinacją enzymów kolagenazy / dispazy. Ta kombinacja jest wysoce skuteczna w dysocjacji z wykorzystaniem albuminy surowicy bydlęcej i DNazy w celu zmniejszenia agregacji komórek po trawieniu. Wydajność komórkowa spełnia wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek, z 90% żywotnością komórek i wysoką koncentracją komórek. Protokół ten można również zmodyfikować w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z jelit innych gatunków ryb. Badania te zapewniają skuteczny protokół referencyjny i zmniejszają potrzebę przeprowadzania dodatkowych prób w zakresie przygotowania zawiesin jednokomórkowych dla gatunków ryb akwakultury.

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek jelita nilskiej tilapii do sekwencjonowania pojedynczych komórek (Rysunek 1). Badania te wykazują, że mieszanina kolagenazy i dispazy wykazuje korzystny efekt dysocjacji i jest łagodna dla tkanki jelita. Wybór optymalnego enzymu trawiennego jest kluczowy dla przygotowania wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek. W pracach wstępnych porównano wydajność dysocjacji kilku powszechnie stosowanych enzy...

Tutaj demonstrujemy przygotowanie wysokiej jakości jednokomórkowego zawiesiny jelita tilapii do sekwencjonowania pojedynczych komórek.

Preparat zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Protokół ten stanowi wiarygodne odniesienie do przygotowania wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej w celu ułatwienia badań na poziomie pojedynczych komórek u gatunków ryb akwakultury. Technologia jest bardzo wydajna i może być stosowana w większości warunków laboratoryjnych. Zmniejsza to potrzebę przeprowadzania dodatkowych badań w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych dla gatunków ryb akwakultury.Zacznij od płukania sześciomiesięcznej tilapii nilowej w dobrze napowietrzonej sterylnej wodzie przez 15 minut, aby zmyć luźno związane bakterie z powierzchni. W celu przygotowania odczynnika enzymatycznego do dysocjacji komórek, rozcieńczyć dypazę kolagenazy w PBS do końcowego stężenia jednego miligrama na mililitr. Wymieszać 95% objętości przygotowanego roztworu enzymatycznego i 5% objętości FBS.Następnie przed użyciem wstępnie schłodzić wirówkę do czterech stopni Celsjusza. W celu wypreparowania tkanek umieść uśpioną rybę na lodzie i zbierz trzy do czterech centymetrów brzucha jelit. Wytnij tłuszcz i krezkę za pomocą kleszczy.Usuń tłuszcz przyczepiony do powierzchni jelita oraz elastyczną i plastyczną przezroczystą błonę śluzową. Delikatnie przepłukać fragment jelita sterylnym, lodowatym PBS za pomocą strzykawki, aby zmyć zawartość jelitową i śluz. Po kilku praniach rozetnij fragment na małe kawałki i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr lodowatego PBS.Odwirować mieszaninę o sile 300 x g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. I zastąp supernatant jednym mililitrem lodowatego 0,08% BSA-DPBS. Za pomocą szklanej pipety delikatnie odessać, aby ponownie zawiesić fragmenty tkanki.Po ponownym umyciu kawałków usuń supernatant i dodaj jeden mililitr przygotowanego odczynnika do dysocjacji enzymatycznej. Wymieszaj również pięć mikrolitrów inhibitora RNA z odczynnikiem dysocjacyjnym do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ręcznie odwracaj probówkę co pięć minut w czasie inkubacji od 30 do 60 minut.Po obróceniu probówek usuń odczynnik do dysocjacji komórek enzymatycznych za pomocą końcówek o szerokim otworze. Dodaj jeden mililitr lodowatego 0,08% BSA-DPBS i delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół, aby zapobiec ich rozerwaniu. Po odcentrowaniu i ponownym zawieszeniu komórek, umieść sitko o średnicy 40 mikrometrów wstępnie zwilżone 0,08% BSA-DPBS na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko. Postukaj w sitko, a następnie spłucz je 200 mikrolitrami DPBS i zbierz zawiesinę na dnie tubki. Po przeniesieniu zawiesiny do probówki o pojemności 1,5 mililitra dodaj pięć mikrolitrów DNA i inkubuj zawiesinę przez 15 minut w temperaturze od 15 do 20 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 400 mikrolitrach lodowatego DPBS bez jonów wapnia i magnezu. Następnie delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą końcówek o szerokim otworze, aby wymieszać komórki i powtórz ten proces jeszcze raz. Do barwienia wymieszać zawiesinę komórek w 0,4% roztworze błękitu trypanowego w równych proporcjach i inkubować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny na szklane szkiełko. Policz żywe i martwe komórki pod mikroskopem w trzech polach i oblicz procent żywotności komórek. Porównano skuteczność dysocjacji kilku powszechnie stosowanych enzymów.Udowodniono, że mieszanina dypazy kolagenazy ma lepszy efekt dysocjacji niż sama dyspaza kolagenazy lub trypsyna i kilka innych mieszanin enzymatycznych. Badanie mikroskopowe wykazało, że komórki jelitowe miały wysoką żywotność i były rozproszone jako pojedyncze komórki. Większość komórek była zdolna do życia, podczas gdy kilka zostało wybarwionych martwych z powodu przepuszczalnej błony komórkowej.Zwróć uwagę na rodzaj używanego PBS. Roztwór do trawienia enzymatycznego nie może być stosowany z PBS wolnym od wapnia/magnezu, ponieważ enzym wymaga jonów wapnia/magnezu do skutecznego działania. Procedura ta ułatwia badania na poziomie pojedynczych komórek u gatunków ryb akwakultury, dostarczając cennych punktów odniesienia do opracowywania protokołów dysocjacji komórek gatunków ryb akwakultury.

single-cell-suspension-preparation-from-nile-tilapia-intestine-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Tutaj prezentujemy protokół izolowania jąder z mózgów krótkotrwałego modelu kręgowców Nothobranchius furzeri do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra lub test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq).

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej (Oreochromis niloticus) do sekwencjonowania. Protokół enzymatyczny zapewnia wysoką żywotność komórek i usprawnia badania w akwakulturze.

Preparat zawiesiny jednokomórkowej z jelita tilapii nilowej do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów