Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Metoda ta pozwala na systematyczne badanie wpływu wielkości porów i szybkości przepływu na rozwój biofilmu w naturalnych i sztucznych ośrodkach porowatych, a tym samym można odkryć podstawowy mechanizm biozatykania się mediów porowatych. Głównymi zaletami tych technik są najwyższa rozdzielczość przestrzenna i czasowa zmiany oraz możliwość dostosowania platformy do szeregu warunków i wymagań eksperymentalnych. Zacznij od włączenia inkubatora pudełkowego mikroskopu na trzy godziny przed eksperymentem, aby zapewnić stabilną temperaturę 25 stopni Celsjusza.

Podłącz rurkę wlotową i wylotową do urządzenia mikroprzepływowego. Zabezpiecz połączenie między rurką a strzykawką, wkładając igłę o średnicy zewnętrznej 0,6 milimetra do rurki wlotowej. Umieść urządzenie mikroprzepływowe, 30 mililitrów wody dejonizowanej i 30 mililitrów pożywki hodowlanej w eksykatorze próżniowym i odgazowuj je przez co najmniej godzinę.

Po zakończeniu powoli wciągnij pożywkę hodowlaną i dejonizowaną wodę do dwóch oddzielnych 30-mililitrowych strzykawek. Następnie zamontuj urządzenie mikroprzepływowe na mikroskopie i umieść rurkę wylotową w pojemniku na odpady. Podłącz strzykawkę wypełnioną wodą dejonizowaną do kanału mikroprzepływowego przez rurkę mikroprzepływową i powoli wstrzykuj wodę, aż wydostanie się z wylotu czujnika ciśnienia.

Napełnij czujnik ciśnienia wodą i wypłucz wszystkie pęcherzyki z rurki łączącej kanał mikroprzepływowy z czujnikiem ciśnienia. Zamknij wylot czujnika ciśnienia dedykowanymi do czujnika ciśnienia. Napełnij pozostałą część kanału mikroprzepływowego wodą dejonizowaną.

Następnie umieść filtr o średnicy 1,2 mikrometra na strzykawce z podłożem hodowlanym. Wyjąć strzykawkę z wodą i ostrożnie podłączyć strzykawkę do rurki mikroprzepływowej wlotowej. Po zamontowaniu strzykawki na pompie strzykawkowej, należy przepłukać kanał pożywką hodowlaną z prędkością przepływu dwóch mililitrów na godzinę przez jedną godzinę.

Następnie ustaw pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu podczas eksperymentu i ustaw odczyt ciśnienia czujników ciśnienia na zero. Następnie odpipetować jeden mililitr kultury Bacillus subtilis NCIB 3610 o gęstości optycznej 0,1 przy długości fali 600 nanometrów w 1,5-mililitrowej fiolce wirówkowej. Aby załadować kulturę bakteryjną do kanału mikroprzepływowego, umieść probówkę wylotową w fiolce wirówki i odczekaj pięć minut, aby usunąć wszelkie potencjalne pęcherzyki powietrza z wylotu probówki.

Po zakończeniu należy pobrać 150 mikrolitrów roztworu bakteryjnego z szybkością przepływu jednego mililitra na godzinę, aż kanał mikroprzepływowy zostanie wypełniony kulturą bakteryjną. Następnie ostrożnie wyjmij filtr strzykawkowy pożywki hodowlanej i umieść wylot w pojemniku na odpady. Pozostaw komórki bakteryjne w warunkach zerowego przepływu w kanale mikroprzepływowym na trzy godziny, aby umożliwić ich powierzchniowe przyczepienie się do porowatego podłoża.

Aby rozpocząć eksperyment, rozpocznij przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu i rozpocznij odczyt ciśnienia w jednym hercu przed uzyskaniem obrazów rosnących biofilmów w żądanym przedziale czasowym, konfiguracji optycznej i powiększeniu. Proces tworzenia biofilmu został zobrazowany za pomocą mikroskopii jasnego pola, w której komórki bakteryjne i biofilm pojawiły się na obrazach jako ciemniejsze piksele. Podczas 24-godzinnego eksperymentu początkowo losowo rosnący biofilm skolonizował prawie całe porowate podłoże.

Pokrycie powierzchni biofilmu nastąpiło o 10% szybciej przy najmniejszym rozmiarze porów niż przy największym rozmiarze porów po 20 godzinach. Korelacja pokrycia powierzchni biofilmu ze wzrostem ciśnienia wykazała, że zatkanie kanału mikroprzepływowego o mniejszej wielkości porów doprowadziło do większej różnicy ciśnień między wlotem a wylotem niż w przypadku większego rozmiaru porów. Najważniejsze aspekty, o których należy pamiętać, to przeprowadzenie eksperymentu w środowisku o stabilnej temperaturze oraz dokładne odgazowanie urządzenia mikroprzepływowego i roztworów, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.

Metoda ta pozwala na systematyczne badania mające na celu rozwikłanie podstawowych mechanizmów wzrostu biofilmu zarówno w przemysłowych, jak i naturalnych ośrodkach porowatych w odniesieniu do wpływu natężenia przepływu i wielkości porów.