HPLC w połączeniu z chemicznym odciskiem palca do rozpoznawania wielu wzorców w celu identyfikacji autentyczności Clematidis armandii caulis

Protokół ten może zapewnić nową strategię skutecznej identyfikacji oryginalnych materiałów Clematidis armandii caulis i jego domieszek. Metoda ta może być stosowana w badaniach nad jakością materiałów leczniczych i stanowi odniesienie do badania standardów jakości innych chińskich materiałów leczniczych. Aby rozpocząć przygotowanie próbki, zmiel surowiec do jednolitej wielkości cząstek, przepuszczając je przez nylonową siatkę o odpowiedniej średnicy wewnętrznej.

Transfer dokładnie zważył dwa gramy zmielonego surowca do zakorkowanej 50-mililitrowej kolby stożkowej przed dodaniem 50 mililitrów metanolu do kolby. Umieścić korek na kolbie w ultradźwiękach podgrzanych do 600 watów i 40 kiloherców przez 30 minut. Pod koniec inkubacji przecedzić roztwór ekstraktu leczniczego przez bibułę filtracyjną.

Po odcedzeniu przenieść cztery mililitry roztworu metanolu zawierającego ekstrakty lecznicze do kolby miarowej o pojemności 10 mililitrów. Następnie dodaj do niego sześć mililitrów wody i wymieszaj roztwór. Pozostaw roztwór na 10 minut, aby się uspokoił.

Do analizy próbek metodą HPLC. Zacznij od przygotowania faz ruchomych i ustaw program gradientu HPLC zgodnie z opisem w manuskrypcie. Przefiltrować próbkę przez mikroporowatą membranę filtracyjną o grubości 0,45 mikrona i poddać ją analizie HPLC.

Dla każdej próbki należy wykonywać analizę sześć razy dziennie. Aby ocenić stabilność roztworu próbki, należy przeanalizować ten sam roztwór próbki przechowywany w temperaturze pokojowej przez 0, 2, 4, 6, 8, 12 i 24 godziny po przygotowaniu. Pobrać sześć powtórzeń tej samej próbki i wykryć jej odcisk palca w HPLC.

Zaimportuj odpowiednie dane do oprogramowania o nazwie System Oceny Podobieństwa Chromatograficznych Odcisków Palców Tradycyjnej Medycyny Chińskiej lub SESCF TCM w wersji 2012. Zaimportuj czas retencji i obszar piku dla wszystkich 10 partii autentycznych próbek Chuanmutong, a także pięciu partii domieszek do SESCF TCM w celu analizy. W menu głównym kliknij ustaw widmo referencyjne i przejdź do okna ustawień parametrów, aby ustawić referencyjny chromatograficzny odcisk palca autentycznego gatunku Chuanmutong jako odniesienie.

Następnie ustaw metodę generowania widma kontrolnego jako metodę mediany o szerokości okna czasowego 0,5. Następnie kliknij kalibrację wielopunktową w menu głównym, wybierz szczyty, a następnie wybierz opcję dopasowania pików jako zaznaczone szczyty. Na koniec kliknij przycisk Oblicz podobieństwo, aby przeprowadzić analizę podobieństwa próbek na podstawie odcisków palców chromatogramu referencyjnego Chuanmutong.

Aby przeprowadzić systemową analizę skupień, otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy statystycznej i kliknij plik, aby zaimportować do oprogramowania dane z 10 partii autentycznych próbek i pięciu partii domieszek. W menu, na karcie Klasyfikacja kliknij Analiza i grupowanie systemów. Jako zmienne należy wybrać wspólne obszary pików 10 partii próbek autentycznych i pięciu partii domieszek.

Ustaw liczbę klastrów na cztery. Następnie kliknij Metoda, aby wybrać Metodę klastrowania jako połączenie międzygrupowe. Wybierz interwał pomiaru jako korelację Pearsona i użyj zakładki OK, aby narysować mapę analizy skupień.

W przypadku analizy głównych składowych lub PCA otwórz oprogramowanie do analizy danych. Kliknij plik w menu i utwórz nowy zwykły projekt. Zaimportuj obszar pików 12 typowych pików w arkuszu kalkulacyjnym Excel lub podobnym z systemu HPLC.

Naciśnij przycisk Zakończ, aby zakończyć import danych. Aby ustawić typ modelu za pomocą PCA, kliknij Nowy, aby utworzyć nowy model, a następnie dopasuj dane za pomocą zakładek autodopasowania i dodawania. Przejdź do wyników, aby uzyskać mapę wyników PCA.

Korzystanie z ortogonalnej analizy częściowej dyskryminacji metodą najmniejszych kwadratów (OPLSDA). Wygeneruj mapę wyników PCA, jak pokazano wcześniej. Ustaw typ modelu za pomocą OPLSDA, klikając Nowy i Nowy Jako model jeden Przed przejściem do skalowania w wyborze par dla wszystkich, a następnie naciśnij AutoFit w wynikach, aby wygenerować mapę wyników OPLSDA.

Aby oszacować znaczenie i projekcję zmiennej, przejdź do menu oprogramowania do analizy danych i przejdź do Analizuj, a następnie ustaw liczbę na 200 w obszarze na mutacje. Uzyskaj wartości R kwadrat i Q kwadrat z wyniku OPLSDA i kliknij VIP i VIP predykcyjny, aby uzyskać mapę VIP. Odciski palców HPLC 10 autentycznych próbek Chuanmutong wykazały 12 odrębnych wspólnych pików, z których były stosunkowo duże i dobrze rozdzielone.

Pik numer 10 został wykorzystany jako pik referencyjny do oszacowania względnych czasów retencji pików spoczynkowych. Autentyczne próbki wykazywały stopień podobieństwa bardzo zbliżony do jednego, co sugeruje wysokie podobieństwo w dobrej konsystencji. Jednak stopień podobieństwa między pięcioma partiami domieszek a kontrolnym Chuanmutong był dość niski.

Zaobserwowano, że odciski palców HPLC pięciu domieszek różnią się od autentycznych próbek, głównie w regionie, w którym czas retencji wynosił od 28 do 55 minut. PCA wykazało oczywiste podobieństwo między autentycznymi odmianami i ich odmienność od domieszek, z wyjątkiem domieszki CC. Podobne wyniki uzyskano również z analizy skupień, gdy odległość klasyfikacji wynosiła 20. Macierz wyników wygenerowana przez OPLSDA nie wykazała przecięcia między punktami próbkowania autentycznych próbek a domieszkami.

Ponownie, domieszkujący CC bardziej przypominał autentyczne odmiany niż inne domieszki. Zgodnie z mapą VIP, piki o wartościach większych niż jeden zostały zidentyfikowane jako główne składniki markera powodujące różnicę między próbkami autentycznymi a domieszkami. Zawartość beta-sitosterolu, aktywnego składnika znajdującego się w Chuanmutong, została wykryta we wszystkich pięciu partiach domieszek, ale zawartość była bardzo zróżnicowana.

Protokół ten ustanawia różne metody analizy, aby odzwierciedlić wszystkie informacje o materiałach leczniczych pod wieloma kątami i dookoła, aby oszacować autentyczność materiałów leczniczych Chuanmutong.