Name: Badanie habituacji u stentora coeruleus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę badania habituacji u jednokomórkowego organizmu Stentor coeruleus przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia z mikrokontrolerem. Technika ta pozwala analizować mechanizmy uczenia się na poziomie komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tatyanie Makushok za niezliczone dyskusje na temat nauki Stentora. Praca ta została sfinansowana z grantu NSF MCB-2012647 oraz z grantu NIH R35 GM130327, a także z nagrody I2CELL przyznanej przez Fundację Fourmentin-Guilbert.

UWAGA: Podsumowanie schematu doświadczenia dotyczącego habituacji przedstawiono na Ryc. 2.
1. Montaż urządzenia do habituacji
<ol>
	<li>Podłącz sterownik silnika do silnika (patrz Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Połącz dwa przewody oznaczone jako A z płytki sterownika z niebieskim i czerwonym przewodem silnika. Połącz dwa przewody oznaczone jako B z płytki sterownika z zielonym i czarnym przewodem silnika. 
		UWAGA: Patrząc z góry na płytkę sterownika, gdy przewody silnika znajdują się u góry, cztery przewody wejściowe powinny być podłączone do wyprowadzeń silnika w następującej kolejności: niebieski, czerwony, czarny i zielony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbuduj obwód na płytce stykowej przedstawiony na Rysunku 4, zwracając szczególną uwagę na poprawną polaryzację diod LED.</li>
	<li>Podłącz Vcc (+5 V) z płytki sterownika do górnej szyny białej płytki stykowej, a Gnd z płytki sterownika do dolnej szyny płytki stykowej.</li>
	<li>Podłącz masę płytki stykowej do pinu masy płytki mikrokontrolera. Podłącz odpowiednio przewody zielonej diody LED, czerwonej diody LED, przełącznika i przycisku do cyfrowych pinów 8, 9, 10 i 11 płytki mikrokontrolera.</li>
	<li>Podłącz cyfrowe piny 2 i 3 płytki mikrokontrolera do przewodów Step i Dir płytki sterownika.</li>
	<li>Podłącz cyfrowe piny 4, 5, 6 i 7 płytki mikrokontrolera do przewodów płytki sterownika.
	<ol>
		<li>Podłącz pin 4 do MS1, pin 5 do MS2, pin 6 do MS3 oraz pin 7 do Enable.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasil płytkę sterownika zasilaczem 12 V. Podłącz zasilacz 12 V do czarno-zielonej wtyczki adaptera przymocowanej dwoma czerwonymi przewodami do płytki sterownika silnika. 
	​UWAGA: Nie podłączaj zasilacza 12 V do gniazda płytki mikrokontrolera.</li>
	<li>Pobierz program sterujący (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) na płytkę mikrokontrolera.</li>
	<li>Użyj kabla USB, aby podłączyć płytkę mikrokontrolera do komputera, który będzie również służył jako źródło zasilania dla płytki mikrokontrolera.</li>
	<li>Sprawdź, czy sterowniki użytkownika działają poprawnie.
	<ol>
		<li>Potwierdź, że przełącznik suwakowy włącza i wyłącza tryb automatyczny. W trybie automatycznym system będzie wykonywał krok w regularnych odstępach czasu określonych przez użytkownika (patrz poniżej).</li>
		<li>Sprawdź, czy zielona dioda LED zapala się, gdy tryb automatyczny jest włączony.</li>
		<li>Sprawdź, czy czerwona dioda LED miga 1 s przed podaniem impulsu przez silnik. Czerwona dioda LED jest lampką ostrzegawczą, która sygnalizuje, że system zaraz poda impuls mechaniczny.</li>
		<li>Przetestuj czerwony przycisk, który wyzwala mikro-krok 1/16 przy każdym naciśnięciu, niezależnie od tego, czy system znajduje się w trybie automatycznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ sterowania silnikiem krokowym, mikrokontroler Arduino, połączenia na płytce stykowej, schemat połączeń elektronicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Komponenty urządzenia do habituacji. Wszystkie oznaczone elementy elektroniczne są wymagane do montażu urządzenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obwodu LED; rezystory szeregowe; przełączniki sterujące przepływem prądu; podstawowe pojęcie z zakresu elektroniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Schemat elektroniczny. Przedstawiono układ na płytce stykowej. Przewody łączące się z płytką mikrokontrolera są ponumerowane zgodnie z opisem w protokole. D1 i D2 to odpowiednio czerwona i zielona dioda LED, połączone z masą za pomocą rezystorów 330 Ω. Dwa przełączniki są podciągnięte rezystorami 10 KΩ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie eksperymentu habituacji
<ol>
	<li>Pozyskać Stentor.</li>
	<li>Pokryć płytkę 35 mm 0,01% roztworem poliornityny.
	<ol>
		<li>Dodać 3 mL 0,01% roztworu poliornityny do płytki i pozostawić na noc.</li>
		<li>Przemyć płytkę dwukrotnie wodą ultrapure i raz pasteryzowaną wodą źródlaną (PSW) (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 3,5 mL PSW do płytki 35 mm.</li>
	<li>Przemyć Stentor w płytce 6-dołkowej (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dodać 3 mL PSW do pierwszego dołka oraz 5 mL PSW do drugiego i trzeciego dołka. Za pomocą pipety P1,000 przenieść 2 mL zawiesiny Stentor z naczynia hodowlanego do pierwszego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
		<li>Zidentyfikować pojedyncze osobniki Stentor za pomocą mikroskopu stereoskopowego (Tabela materiałów), a następnie za pomocą pipety P20 przenieść 100 osobników Stentor z pierwszego dołka do drugiego dołka.</li>
		<li>Zidentyfikować pojedyncze osobniki Stentor za pomocą mikroskopu stereoskopowego, a następnie za pomocą pipety P20 przenieść 100 osobników Stentor z drugiego dołka do trzeciego dołka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety P200 przenieść 100 osobników Stentor w całkowitej objętości 500 µL z trzeciego dołka płytki 6-dołkowej do płytki 35 mm w taki sposób, aby objętość końcowa w płytce 35 mm wyniosła 4 mL.</li>
	<li>Przykleić kawałek (7 cm x 7 cm) białego papieru do metalowej linijki w urządzeniu do habituacji. Upewnić się, że lewa krawędź papieru znajduje się 2 cm od końca linijki najbliżej ramienia.</li>
	<li>Za pomocą taśmy dwustronnej przykleić dno płytki 35 mm do środka papieru o wymiarach 2 cal x 2 cale znajdującego się na linijce w urządzeniu do habituacji.</li>
	<li>Pozostawić płytkę 35 mm w urządzeniu do habituacji przez co najmniej 2 h (czas ten można wydłużyć do całej nocy) z zamkniętą pokrywą. Przez cały okres aklimatyzacji przechowywać płytkę w warunkach oświetlenia otoczenia zgodnych z warunkami oświetlenia eksperymentalnego (tzn. nie narażać komórek na fluktuacje światła/ciemności). Ponadto upewnić się, że płytka nie jest poddawana żadnym zakłóceniom mechanicznym wynikającym z przypadkowego potrącenia.</li>
	<li>Ustawić kamerę mikroskopu USB (Tabela materiałów) centralnie nad płytką 35 mm z Stentor. W razie potrzeby umieścić pod kamerą mikroskopu USB podkładkę, np. pudełko z końcówkami do pipet, aby wyregulować wysokość. Alternatywnie można użyć statywu pierścieniowego do regulacji wysokości.</li>
	<li>Zainstalować aplikację Webcam recorder na laptopie (Tabela materiałów) i wykorzystać ją do wizualizacji komórek via wejście mikroskopowe.
	<ol>
		<li>Otworzyć aplikację Webcam recorder i wybrać mikroskop USB z menu rozwijanego. Wyregulować ostrość w kamerze mikroskopu USB tak, aby komórki były wyraźnie widoczne.</li>
		<li>Dostosować położenie kamery mikroskopu USB, aby zmaksymalizować liczbę komórek w polu widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otworzyć monitor szeregowy płyty mikrokontrolera: wybrać opcję No Line Ending i ustawić prędkość na 9 600 baud.</li>
	<li>Użyć komendy l w programie płyty mikrokontrolera, aby opuścić ramię, aż ledwo dotknie ono linijki. W razie potrzeby użyć komendy r , aby podnieść ramię i precyzyjnie dostosować jego położenie. 
	UWAGA: Jeśli ramię znajduje się w znacznej odległości od linijki, wpisać komendę d, aby wyłączyć prąd cewki silnika, co umożliwi ręczne przesunięcie ramienia w stronę linijki. Po ręcznym przesunięciu ramienia użyć komendy e, aby włączyć prąd cewki silnika i zablokować ramię w tej pozycji. Po prawidłowym opuszczeniu przed rozpoczęciem eksperymentu, dolna końcówka ramienia powinna znajdować się 1 cm od lewej krawędzi linijki. Ramię wywoła impuls mechaniczny poprzez uderzenie w linijkę.</li>
	<li>Użyć komendy i , aby zainicjować tryb automatyczny w urządzeniu do habituacji.</li>
	<li>Wpisać wielkość kroku w wierszu poleceń. Poziom 5 to najmniejszy krok, a Poziom 1 to największy krok. Do eksperymentów z habituacją bazową stosuje się wielkość kroku Poziom 4. 
	UWAGA: Bodziec Poziomu 5 powoduje przesunięcie linijki w dół o ~0,5 mm; Poziom 4 powoduje przesunięcie w dół o ~1 mm; Poziom 3 powoduje przesunięcie w dół o ~2 mm; Poziom 2 powoduje przesunięcie w dół o ~3-4 mm; a Poziom 1 powoduje przesunięcie w dół o ~8 mm. Bodziec Poziomu 5 generuje szczytową siłę nacisku ramienia na linijkę wynoszącą ~0,122 N; Poziom 4 generuje szczytową siłę nacisku ~0,288 N; a Poziom 3 generuje szczytową siłę nacisku ~0,557 N. Siły nacisku generowane przez Poziom 1 i Poziom 2 są trudniejsze do empirycznego określenia za pomocą dynamometru ze względu na znaczne oscylacje linijki występujące po kontakcie z ramieniem.</li>
	<li>Wpisać czas między impulsami w minutach. Interwał stosowany w eksperymentach z habituacją bazową wynosi 1 min.</li>
	<li>Rozpocząć nagrywanie wideo za pomocą aplikacji Webcam recorder, naciskając czerwony przycisk nagrywania. Następnie przełączyć przełącznik w aparaturze do habituacji, aby rozpocząć eksperyment od pierwszego zautomatyzowanego podania impulsu mechanicznego.</li>
</ol>
3. Analiza filmu z eksperymentu
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed pojawieniem się pierwszego impulsu mechanicznego na nagraniu, zatrzymaj odtwarzanie i policz liczbę Stentor, które są jednocześnie przytwierdzone do dna płytki 35 mm i wyciągnięte w wydłużony, trąbkowaty kształt (Rycina 5A, Wideo 1).</li>
	<li>Bezpośrednio po pierwszym impulsie policz liczbę Stentor, które są jednocześnie przytwierdzone do dna płytki i skurczone do kształtu kulistego (Rycina 5B, Wideo 1). 
	UWAGA: Skurczone komórki są łatwo rozróżnialne od komórek wydłużonych, ponieważ Stentor skraca długość swojego ciała o ponad 50% w ciągu 10 ms podczas zdarzenia skurczowego3.</li>
	<li>Podziel drugą liczbę przez pierwszą, aby określić ułamek Stentor, które skurczyły się w odpowiedzi na bodziec mechaniczny.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.3 dla wszystkich impulsów mechanicznych w nagraniu z eksperymentu.</li>
</ol>
<img alt="Obraz z mikroskopu przedstawiający wyniki elektroforezy: analiza rozdziału DNA na żelu, skala 1 mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Kurczenie się Stentor po otrzymaniu bodźca mechanicznego. (A) Stentor w stanie wydłużonym, przymocowany do dna szalki Petriego. (B) Stentor skurczony po otrzymaniu mechanicznej stymulacji poziomu 4 z urządzenia do habituacji. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu USB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Film przedstawiający Stentor podczas kurczenia się. Stentor otrzymuje bodziec mechaniczny poziomu 4 z urządzenia do habituacji w każdej minucie. Komórki te nie uległy jeszcze habituacji, dlatego kurczą się po otrzymaniu impulsu. Komórki znajdują się w szalce Petriego umieszczonej na urządzeniu do habituacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

<ol><li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+single+cell+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li>
<li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+in+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li>
<li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li>
<li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li>
<li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li>
<li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation%3A+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Psychological+Review%22%5BJournal%5D)">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li>
<li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759(2018).</li>
<li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytyczne kroki w protokole dotyczą zapewnienia, że Stentor pozostaje w optymalnych warunkach do wystąpienia skurczów. Reakcja skurczowa w teście habituacji wymaga, aby stentory były zakotwiczone na powierzchni za pomocą ich lepkiego uchwytu, ponieważ rzadko się kurczą, gdy swobodnie pływają. Jednak dolna powierzchnia płytki Petriego o średnicy 35 mm używanej do eksperymentów habituacyjnych zazwyczaj nie sprzyja zakotwiczeniu, chyba że jest pokryta poliornityną. Co więcej, Stentor nie może być narażony na żadne zakłócenia mechaniczne przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu habituacji, ponieważ Stentor zapominający skala czasowa wynosi 2-6 godzin3. Jeśli Stentor otrzyma stymulację mechaniczną w ciągu 2 godzin od czasu rozpoczęcia eksperymentu habituacji, istnieje możliwość, że ta wcześniejsza stymulacja wywoła niewielki poziom habituacji przed eksperymentem, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo skurczu po dostarczeniu przez urządzenie habituacyjne pierwszego impulsu mechanicznego. Wreszcie, na etapie analizy ważne jest, aby policzyć tylko liczbę Stentora , które kurczą się po impulsie - a nie przypadkowe spontaniczne skurcze, które występują przed dostarczeniem impulsu - aby uzyskać dokładny odczyt frakcji komórek, które skurczyły się w odpowiedzi na stymulację mechaniczną.
Protokół można łatwo modyfikować w celu zbadania różnych typów dynamiki habituacji poprzez zmianę siły i częstotliwości impulsów mechanicznych dostarczanych przez urządzenie habituacyjne. Daje to również możliwość zbadania innych rodzajów uczenia się, takich jak uwrażliwienie, które mogą wystąpić w Stentorze. Sam kod programu płytki mikrokontrolera można również dostosować, aby dostarczać różne wzory mechanicznych odczepów do Stentora.
Jednym z potencjalnych problemów, które należy rozwiązać za pomocą tego protokołu, jest niska częstotliwość zakotwiczenia Stentora , co może ograniczać liczbę Stentora , którą można zaobserwować w eksperymencie habituacji. Częstotliwość kotwiczenia jest czasami zmniejszona w kulturach Stentora , które nie były ostatnio karmione lub są skażone. Aby rozwiązać ten problem, należy umyć świeżą partię Stentora , aby rozpocząć nową kulturę i regularnie je karmić zgodnie z protokołem opisanym w Lin et al.10.
Protokół ten jest ograniczony tym, że tylko jedna płytka Stentor może być testowana na raz, co skutkuje pomiarami o stosunkowo niskiej przepustowości. Co więcej, obecne oprogramowanie nie pozwala na automatyzację analizy obrazu pojedynczej komórki. Większość pozyskanych danych dotyczy zatem poziomu populacji. Przyszłe modele urządzenia habituacyjnego i narzędzia do analizy obrazu mogą ułatwić wysokoprzepustowe eksperymenty na pojedynczych komórkach.
Habituacja w Stentor była wcześniej badana przy użyciu metod opisanych przez Wood3, ale ten nowy protokół pozwala na automatyzację eksperymentów. Automatyzacja nie tylko pozwala badaczowi na powtarzalne dostarczanie impulsów mechanicznych o określonej sile i częstotliwości, ale także ułatwia długoterminowe eksperymenty z przyzwyczajeniem, ponieważ urządzenie może być pozostawione włączone bez nadzoru przez wiele dni. Co więcej, użycie silnika krokowego zamiast solenoidu zastosowanego w eksperymentachWooda3 zmniejsza ryzyko rozmagnesowania w czasie, a także pozwala na zmianę siły bodźca w trakcie jednego eksperymentu.
Badanie habituacji komórkowej może ujawnić kliniczne spostrzeżenia dotyczące stanów takich jak zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD) i zespół Tourette'a, w których habituacja jest upośledzona11. Mechanizmy habituacji stentorów mogą również ujawnić nowe niesynaptyczne paradygmaty uczenia się, niezależne od złożonych obwodów komórkowych. Wreszcie, spostrzeżenia na temat uczenia się pojedynczych komórek mogą zainspirować metody przeprogramowania komórek w tkankach wielokomórkowych – to kolejna potencjalna droga do walki z chorobami.

Uczenie się zazwyczaj kojarzy się ze złożonym układem nerwowym, jednak coraz więcej dowodów wskazuje na to, że życie na wszystkich poziomach, włącznie z pojedynczymi komórkami, może przejawiać inteligentne zachowania. Zarówno w systemach naturalnych, jak i sztucznych, uczenie się jest adaptacyjną aktualizacją parametrów systemu na podstawie nowych informacji1, a inteligencja jest miarą procesu obliczeniowego, który ułatwia uczenie się2.
Stentor coeruleus to jednokomórkowy organizm zamieszkujący stawy, który wykazuje habituację – formę uczenia się, w której odpowiedź behawioralna słabnie pod wpływem powtarzającego się bodźca3. Stentor kurczy się w odpowiedzi na stymulację mechaniczną3, co stanowi prawdopodobną reakcję ucieczkową przed drapieżnikami wodnymi. Jednak powtarzające się zaburzenia o niskiej sile indukują habituację, co przejawia się postępującym spadkiem prawdopodobieństwa skurczu3. Habituowany Stentor nadal kurczy się po otrzymaniu silnej stymulacji mechanicznej4 lub stymulacji świetlnej5. Obserwacje te, zgodne z klasycznymi kryteriami habituacji u zwierząt opracowanymi przez Thompsona i Spencera6, silnie sugerują, że pierwotny spadek reakcji skurczowej wynika z procesu uczenia się, a nie ze zmęczenia lub wyczerpania ATP. Jako komórka wolnożyjąca, Stentor może być badany bez dużych zakłóceń ze strony komórek otaczających, co miałoby miejsce w przypadku tkanki wielokomórkowej. Kilka dodatkowych cech sprawia, że Stentor jest przystępnym systemem do badania uczenia się: jego duży rozmiar (1 mm), mierzalna odpowiedź habituacyjna3, łatwość iniekcji i mikromanipulacji7, w pełni zsekwencjonowany genom8 oraz dostępność narzędzi interferencji RNA (RNAi)9. Wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania uczenia się komórkowego bez udziału mózgu lub układu nerwowego wymaga odtwarzalnej procedury stymulowania komórek Stentor i pomiaru odpowiedzi.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ilościowego określania habituacji Stentor z wykorzystaniem aparatury połączonej z płytką mikrokontrolera, która umożliwia dostarczanie impulsów mechanicznych o określonej sile i częstotliwości, w tym metody budowy aparatury oraz przygotowania eksperymentu w sposób minimalizujący zakłócenia zewnętrzne (Rysunek 1). Zrozumienie habituacji na poziomie pojedynczej komórki pomoże w charakterystyce paradygmatów uczenia się, które są niezależne od złożonych obwodów neuronowych.
<img alt="Typowa konfiguracja urządzenia z mikroskopem USB i szalką Petriego do analizy komórkowej w laboratorium." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Konfiguracja eksperymentu habituacji. Szalka Petriego zawierająca Stentor jest umieszczona na elastycznej metalowej linijce urządzenia do habituacji. Następnie ramie urządzenia do habituacji uderza w metalową linijkę z określoną siłą i częstotliwością, wytwarzając falę bodźca przechodzącą przez pole komórek. Kamera mikroskopu USB rejestruje reakcje Stentor na stymulację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu habituacji komórek; konfiguracja impulsów mechanicznych, rejestracja mikroskopem USB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Podsumowanie schematu doświadczenia dotyczącego habituacji. Rysunek przedstawia podstawowe kroki zaangażowane w badanie Stentor z wykorzystaniem urządzenia do habituacji. Rysunek został stworzony za pomocą BioRender.com. Adaptacja z „Process Flowchart”, opracowanej przez BioRender.com (2022). Pobrano z https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>0,01% Poliornityna&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4957</td><td>Służy do powlekania płytki Petriego</td></tr><tr><td>35 mm płytki Petriego</td><td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td><td>L331</td><td>Zawiera Stentor podczas eksperymentów</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>StemCell Technologies</td><td>38016</td><td>Służy do mycia Stentor</td></tr><tr><td>Aluminiowa płytka stykowa, 4" x 24" x 1/2" (x1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB424</td><td>Służy do budowy urządzenia habituacyjnego</td></tr><tr><td>Duża łatwa w obsłudze sterownik Płytka sterownika silnika krokowego (x1)</td><td>Sparkfun</td><td>ROB-12859</td><td>Służy do budowy urządzenia</td></tr> <tr><td>habituacyjnegoSzyna konstrukcyjna, 1" x 5'' (x2)</td><td>Newport</td><td>Newport CR-1</td><td>Służy do budowy urządzenia habituacyjnego</td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Apple Store</td><td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td> <td>Podłącz laptopa do mikroskopu USB, aby wizualizować eksperymenty</td></tr><tr><td>Duży kątownik kątowy (x1)</td><td>Thorlabs</td><td>AP90RL</td><td>Służy do budowy urządzenia habituacyjnego</td></tr><tr><td>Płytka mikrokontrolera</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td>Służy do sterowania urządzeniem habituacyjnym</td></tr><tr><td>Nema 17 Silnik krokowy bipolarny 59Ncm 2A&nbsp; 84uncja&nbsp; 48mm 4-odprowadzeniowe&nbsp;</td><td>Stepperonline.com</td><td>5-17HS19-2004S1</td><td>Służy do budowy urządzenia habituacyjnego</td></tr><tr><td>Pasteryzowana woda źródlana</td><td>Carolina</td><td>132458</td><td>Media do eksperymentów Stentor</td></tr><tr><td>Nawias kątowy (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AP90</td><td>Służy do budowy urządzenia habituacyjnego</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Stemi 2000</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Służy do wizualizacji Stentora podczas etapów mycia</td></tr><tr><td>Stentor coeruleus</td><td>Karolina</td><td>131598</td><td>Są to komórki używane do eksperymentów habituacyjnych</td></tr><tr><td>Mikroskop USB</td><td>Celestron</td><td>44308</td><td>Służy do wizualizacji i nagrywania eksperymentów Rejestrator</td></tr><tr><td>kamery internetowej</td><td>Apple Store</td><td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td><td>Zainstaluj tę aplikację, aby nagrywać filmy z eksperymentów</td></tr></tbody></table>

badanie habituacji u stentora coeruleus

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Uczenie się jest zwykle związane ze złożonym układem nerwowym, ale jest coraz więcej dowodów na to, że życie na wszystkich poziomach, aż do pojedynczych komórek, może wykazywać inteligentne zachowania. Zarówno w systemach naturalnych, jak i sztucznych, uczenie się jest adaptacyjną aktualizacją parametrów systemu w oparciu o nowe informacje, a inteligencja jest miarą procesu obliczeniowego, która ułatwia uczenie się. Stentor coeruleus to jednokomórkowy organizm żyjący w stawie, który wykazuje habituację, formę uczenia się, w której reakcja behawioralna zmniejsza się po powtarzającym się bodźcu. Stentor kurczy się w odpowiedzi na stymulację mechaniczną, która jest pozorną reakcją ucieczki przed wodnymi drapieżnikami. Jednak powtarzające się perturbacje o niskiej sile wywołują habituację, o czym świadczy postępujące zmniejszanie prawdopodobieństwa skurczu. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania habituacji Stentora za pomocą aparatury połączonej z płytką mikrokontrolera, która może dostarczać impulsy mechaniczne o określonej sile i częstotliwości, w tym metody budowy aparatury i ustawiania eksperymentu w sposób, który minimalizuje zewnętrzne zakłócenia. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych podejść do mechanicznej stymulacji Stentora, to urządzenie pozwala na zmianę siły stymulacji pod kontrolą komputera w trakcie pojedynczego eksperymentu, co znacznie zwiększa różnorodność sekwencji wejściowych, które można zastosować. Zrozumienie habituacji na poziomie pojedynczej komórki pomoże scharakteryzować paradygmaty uczenia się, które są niezależne od złożonych obwodów.

Opisana powyżej metoda, z wykorzystaniem mechanicznego impulsu poziomu 4 o częstotliwości 1 uderzenia/min, powinna doprowadzić do stopniowego zmniejszenia prawdopodobieństwa skurczu Stentor w ciągu 1 h. Jest to oznaka habituacji (patrz Rysunek 6, Wideo 2).
<img alt="Wykres skurczu Stentora w odpowiedzi na impulsy mechaniczne; odpowiedź na bodziec; analiza danych eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Habituacja bazowa. Prawdopodobieństwo skurczu Stentor stopniowo spada w ciągu 1 h po otrzymaniu impulsów mechanicznych poziomu 4 z częstotliwością 1 uderzenia/min (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 2. Nagranie przyzwyczajonego Stentora. Komórki otrzymują mechaniczny bodziec poziomu 4 po 1 h otrzymywania impulsów mechanicznych o tej samej sile z częstotliwością 1 uderzenia/min. Większość komórek przyzwyczaiła się do bodźców w ciągu tej godziny i w związku z tym nie kurczy się. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Zmiana siły i/lub częstotliwości dostarczania impulsów mechanicznych może zmienić dynamikę habituacji Stentor. Na przykład, stosowanie impulsu poziomu 2 z częstotliwością 1 uderzenia/min zapobiega habituacji w ciągu 1 h (patrz Rysunek 7). Impuls poziomu 5 powinien wywołać skurcze u niewielkiej liczby lub żadnych osobników Stentor.
<img alt="Wykres odpowiedzi skurczowej Stentora; ułamek względem impulsów mechanicznych; analiza danych biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Brak habituacji w ciągu 1 h przy silniejszych siłach. Prawdopodobieństwo skurczu Stentor nie spada w sposób znaczący w ciągu 1 h po otrzymaniu impulsów mechanicznych poziomu 2 z częstotliwością 1 uderzenia/min (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Wprowadzamy metodę ilościowego określania habituacji Stentora za pomocą urządzenia połączonego z płytką mikrokontrolera, które może dostarczać impulsy mechaniczne o określonej sile i częstotliwości. Uwzględniamy również metody montażu aparatury i ustawienia eksperymentu w sposób minimalizujący perturbacje zewnętrzne.

Badanie habituacji u stentora coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Badanie habituacji na poziomie pojedynczej komórki pomoże scharakteryzować paradygmaty uczenia się, które są niezależne od złożonych obwodów neuronowych, pomagając nam w ten sposób zrozumieć pochodzenie inteligencji. Technika ta pozwala na zmianę siły i częstotliwości stymulacji mechanicznej dostarczanej do komórek pod automatyczną kontrolą komputerową, co znacznie zwiększa różnorodność sekwencji wejściowych. Wykorzystanie tych metod do badania habituacji komórkowej pomoże nam dowiedzieć się więcej o stanach takich jak ADHD i zespół Tourette'a, w których habituacja jest upośledzona.Aby rozpocząć, podłącz sterownik silnika do silnika, łącząc dwa przewody oznaczone literą A z płyty sterownika do niebieskiego i czerwonego przewodu na silniku. Następnie podłącz dwa przewody oznaczone literą B z płyty sterownika do zielonego i czarnego przewodu na silniku. Po zbudowaniu obwodu płytki stykowej ze szczególną starannością, aby podłączyć diody LED we właściwej polaryzacji, podłącz VCC z płytki sterownika do górnej szyny białej płytki stykowej.I ziemia od płyty sterownika do dolnej szyny płytki stykowej. Następnie podłącz masę płytki stykowej do bolca uziemiającego płytki mikrokontrolera. Następnie podłącz zieloną diodę LED, czerwoną diodę LED, przewody przełącznika i przycisku odpowiednio do pinów cyfrowych 8, 9, 10 i 11 płytki mikrokontrolera.Podłącz piny cyfrowe płytki mikrokontrolera dwa i trzy do przewodów płytki sterownika, krok i kierunek. Następnie podłącz pin czwarty do MS1, pin piąty do MS2, pin szósty do MS3 i pin siódmy, aby włączyć. Aby zasilić płytę sterownika, podłącz zasilacz 12 V do czarno-zielonej wtyczki adaptera, podłączonej dwoma czerwonymi przewodami do płyty sterownika silnika.Pobierz program sterujący na płytę mikrokontrolera. Użyj USB, aby podłączyć płytkę mikrokontrolera do komputera, który będzie również służył jako źródło zasilania płytki mikrokontrolera. Po uzyskaniu Stentora pokryj 35-milimetrową płytkę, dodając do niej trzy mililitry 0,01% roztworu poliornityny i pozostaw na noc.Umyj talerz dwukrotnie ultraczystą wodą i raz pasteryzowaną wodą źródlaną. Następnie dodaj 3,5 mililitra pasteryzowanej wody źródlanej do 35-milimetrowej płytki. Dodaj trzy mililitry pasteryzowanej wody źródlanej do pierwszej studzienki i pięć mililitrów do drugiej i trzeciej studzienki.Używając pipety P1000, dodaj dwa mililitry Stentora z naczynia hodowlanego do pierwszego dołka z sześciodołkowej płytki. Zidentyfikuj pojedynczy Stentor za pomocą mikroskopu stereoskopowego, a następnie użyj pipety P20, aby przenieść 100 Stentor z pierwszego dołka do drugiego dołka. Podobnie, po zidentyfikowaniu pojedynczego Stentora za pomocą mikroskopu stereoskopowego, jak pokazano wcześniej, przenieś 100 Stentor z drugiego dołka do trzeciego dołka za pomocą pipety P20.Następnie za pomocą pipety P200 przenieś 100 Stentor w całkowitej objętości 500 mikrolitrów z trzeciego dołka płytki sześciodołkowej do płytki 35 milimetrów, tak aby końcowa objętość wynosiła cztery mililitry. Przyklej kawałek białego papieru do metalowej linijki na urządzeniu habituacyjnym, upewniając się, że lewa krawędź papieru znajduje się dwa centymetry od końca linijki znajdującej się najbliżej zwory. Za pomocą taśmy dwustronnej przyklej dolną część płytki o grubości 35 milimetrów do środka papieru o wymiarach dwa na dwa cale na linijce na urządzeniu do habituacji.Pozostaw 35-milimetrową płytkę na urządzeniu do habituacji na co najmniej dwie godziny z zamkniętą pokrywką. Wyśrodkuj kamerę mikroskopu USB bezpośrednio nad 35-milimetrową płytką Stentora. Aby zainstalować aplikację do nagrywania kamery internetowej, otwórz aplikację do nagrywania kamery internetowej i wybierz mikroskop USB z menu rozwijanego.Dostosuj ostrość w kamerze mikroskopu USB tak, aby komórki były wyraźnie widoczne, a pozycja kamery maksymalizowała liczbę komórek w polu view. Po otwarciu monitora szeregowego płytki mikrokontrolera należy wybrać brak zakończenia linii i ustawić go na 9 600 bodów. Użyj polecenia L na płytce mikrokontrolera, aby opuścić zworę, aż ledwo dotknie linijki, i polecenia R, aby podnieść ramię, jeśli to konieczne, aby dostosować dokładną pozycję.Użyj polecenia I, aby zainicjować tryb automatyczny na urządzeniu habituacyjnym. Wprowadź kroki, rozmiar i czas między impulsami w minutach w wierszu poleceń. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą aplikacji do nagrywania kamery internetowej, naciskając czerwony przycisk nagrywania.Następnie przestaw przełącznik na aparacie habituacyjnym, aby rozpocząć eksperyment z pierwszym zautomatyzowanym mechanicznym dostarczaniem impulsów. Bezpośrednio przed pojawieniem się pierwszego impulsu mechanicznego na filmie, zatrzymaj się i policz liczbę Stentora, które są zarówno zakotwiczone na dnie 35-milimetrowej płyty, jak i rozciągnięte w wydłużony kształt przypominający trąbkę. Podobnie, po pierwszym impulsie policz liczbę Stentora, które są zarówno zakotwiczone na dnie płytki, jak i skurczone w kształt kuli.Podziel drugie liczenie przez pierwsze, aby określić frakcję Stentora, która skurczyła się w odpowiedzi na bodziec mechaniczny, powtarzając procedurę dla wszystkich impulsów mechanicznych w eksperymencie. Prawdopodobieństwo skurczu Stentora było monitorowane, a wyniki wykazały, że stopniowo maleje w ciągu jednej godziny. Po otrzymaniu czwartego poziomu impulsów mechanicznych z częstotliwością jednego stuknięcia na minutę, wskazujących na przyzwyczajenie.Zmiana siły lub częstotliwości dostarczania impulsów mechanicznych może zmienić dynamikę przyzwyczajenia Stentora. Korzystanie z zestawu impulsów drugiego poziomu o częstotliwości jednego stuknięcia na minutę wyklucza przyzwyczajenie w ciągu jednej godziny. Możemy badać różne rodzaje dynamiki habituacji, zmieniając siłę i częstotliwość stymulacji mechanicznej.Jest to okazja do zbadania różnych rodzajów uczenia się, takich jak uwrażliwianie. Ilościowe spostrzeżenia na temat uczenia się pojedynczych komórek, zebrane dzięki naszym metodom, mogą zainspirować inne sposoby przeprogramowania komórek w tkankach wielokomórkowych. Kolejny potencjalny sposób walki z chorobami.

studying-habituation-in-stentor-coeruleus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę rejestracji aktywności motorycznej, zsynchronizowaną z elektrycznie rejestrowanym sygnałem kontaktu stopowego u uwięzionego owada chodzącego po śliskiej powierzchni. Metoda ta jest wykorzystywana do badania neuronalnych podstaw adaptacyjnego zachowania przy zredukowanym wpływie oddziaływań mechanicznych między odnóżami a podłożem.

Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Habituacja oraz hamowanie reakcji orientacyjnej przez impuls poprzedzający (PPI) są operacyjnymi miarami bramkowania sensorycznego. Bramkowanie sensoryczne jest zaburzone w schizofrenii, a także w niektórych innych zaburzeniach psychicznych i chorobach neurodegeneracyjnych. W niniejszym materiale opisujemy standardowy protokół oceny krótkoterminowej i długoterminowej habituacji, a także hamowania akustycznej reakcji orientacyjnej przez impuls poprzedzający u szczurów i myszy.

Habituacja i hamowanie przedbodźcowe odruchu zaskoczenia akustycznego u gryzoni

Ten film przedstawia test habituacji dotyku, behawioralną metodę C. elegans służącą do oceny mechanosensacji i ilościowego określania czasu do przyzwyczajenia.

Test habituacji dotyku: metoda badania uczenia się bez skojarzeń u C. elegans

Hormony gonadalne, takie jak estrogen, modulują tworzenie pamięci w wielu eksperymentalnych paradygmatach, w tym w pamięci wygaszania strachu. Protokół ten opisuje zestaw metod badania wpływu hormonów gonad, szczególnie podczas wymierania u naturalnie zmieniających się na cyklach samic, w tym monitorowanie cyklu rujowego i egzogenne podawanie estrogenów.

Protokół badania wygaszania uwarunkowanego strachu u naturalnie jeżdżących na rowerze samic szczurów

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Przedstawiono protokół badania desensytyzacji i odzyskiwania wrażliwości fotoreceptorów raków w funkcji czasu okołodobowego.

Odczulanie i odzyskiwanie fotoreceptorów raków po dostarczeniu bodźca świetlnego

Aby sprawdzić, czy wpływ trójdzielny na wydajność poznawczą obejmuje aktywność miejsca sinawego, przedstawiono dwa protokoły, które mają na celu ocenę możliwych korelacji między wydajnością a związanymi z zadaniem zmianami wielkości źrenic wywołanymi przez żucie. Protokoły te mogą być stosowane w stanach, w których podejrzewa się udział locus coeruleus.

Ocena zmian związanych ze źrenicami w pobudzeniu za pośrednictwem miejsca sinawy, wywołanym stymulacją nerwu trójdzielnego

Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Agresja jest wrodzonym zachowaniem, które wyewoluowało w ramach obrony lub zdobywania zasobów. To złożone zachowanie społeczne jest kształtowane przez...

Badanie agresji u Drosophila (muszek owocówek)

Poznaj metodę badania habituacji u jednokomórkowego organizmu Stentor coeruleus przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia z mikrokontrolerem. Technika ta pozwala analizować mechanizmy uczenia się na poziomie komórkowym.

Badanie habituacji u stentora coeruleus

Przeglądaj więcej filmów