Badanie habituacji u stentora coeruleus
6 stycznia 2023
Wprowadzamy metodę ilościowego określania habituacji Stentora za pomocą urządzenia połączonego z płytką mikrokontrolera, które może dostarczać impulsy mechaniczne o określonej sile i częstotliwości. Uwzględniamy również metody montażu aparatury i ustawienia eksperymentu w sposób minimalizujący perturbacje zewnętrzne.
Badanie habituacji na poziomie pojedynczej komórki pomoże scharakteryzować paradygmaty uczenia się, które są niezależne od złożonych obwodów neuronowych, pomagając nam w ten sposób zrozumieć pochodzenie inteligencji. Technika ta pozwala na zmianę siły i częstotliwości stymulacji mechanicznej dostarczanej do komórek pod automatyczną kontrolą komputerową, co znacznie zwiększa różnorodność sekwencji wejściowych. Wykorzystanie tych metod do badania habituacji komórkowej pomoże nam dowiedzieć się więcej o stanach takich jak ADHD i zespół Tourette'a, w których habituacja jest upośledzona.
Aby rozpocząć, podłącz sterownik silnika do silnika, łącząc dwa przewody oznaczone literą A z płyty sterownika do niebieskiego i czerwonego przewodu na silniku. Następnie podłącz dwa przewody oznaczone literą B z płyty sterownika do zielonego i czarnego przewodu na silniku. Po zbudowaniu obwodu płytki stykowej ze szczególną starannością, aby podłączyć diody LED we właściwej polaryzacji, podłącz VCC z płytki sterownika do górnej szyny białej płytki stykowej.
I ziemia od płyty sterownika do dolnej szyny płytki stykowej. Następnie podłącz masę płytki stykowej do bolca uziemiającego płytki mikrokontrolera. Następnie podłącz zieloną diodę LED, czerwoną diodę LED, przewody przełącznika i przycisku odpowiednio do pinów cyfrowych 8, 9, 10 i 11 płytki mikrokontrolera.
Podłącz piny cyfrowe płytki mikrokontrolera dwa i trzy do przewodów płytki sterownika, krok i kierunek. Następnie podłącz pin czwarty do MS1, pin piąty do MS2, pin szósty do MS3 i pin siódmy, aby włączyć. Aby zasilić płytę sterownika, podłącz zasilacz 12 V do czarno-zielonej wtyczki adaptera, podłączonej dwoma czerwonymi przewodami do płyty sterownika silnika.
Pobierz program sterujący na płytę mikrokontrolera. Użyj USB, aby podłączyć płytkę mikrokontrolera do komputera, który będzie również służył jako źródło zasilania płytki mikrokontrolera. Po uzyskaniu Stentora pokryj 35-milimetrową płytkę, dodając do niej trzy mililitry 0,01% roztworu poliornityny i pozostaw na noc.
Umyj talerz dwukrotnie ultraczystą wodą i raz pasteryzowaną wodą źródlaną. Następnie dodaj 3,5 mililitra pasteryzowanej wody źródlanej do 35-milimetrowej płytki. Dodaj trzy mililitry pasteryzowanej wody źródlanej do pierwszej studzienki i pięć mililitrów do drugiej i trzeciej studzienki.
Używając pipety P1000, dodaj dwa mililitry Stentora z naczynia hodowlanego do pierwszego dołka z sześciodołkowej płytki. Zidentyfikuj pojedynczy Stentor za pomocą mikroskopu stereoskopowego, a następnie użyj pipety P20, aby przenieść 100 Stentor z pierwszego dołka do drugiego dołka. Podobnie, po zidentyfikowaniu pojedynczego Stentora za pomocą mikroskopu stereoskopowego, jak pokazano wcześniej, przenieś 100 Stentor z drugiego dołka do trzeciego dołka za pomocą pipety P20.
Następnie za pomocą pipety P200 przenieś 100 Stentor w całkowitej objętości 500 mikrolitrów z trzeciego dołka płytki sześciodołkowej do płytki 35 milimetrów, tak aby końcowa objętość wynosiła cztery mililitry. Przyklej kawałek białego papieru do metalowej linijki na urządzeniu habituacyjnym, upewniając się, że lewa krawędź papieru znajduje się dwa centymetry od końca linijki znajdującej się najbliżej zwory. Za pomocą taśmy dwustronnej przyklej dolną część płytki o grubości 35 milimetrów do środka papieru o wymiarach dwa na dwa cale na linijce na urządzeniu do habituacji.
Pozostaw 35-milimetrową płytkę na urządzeniu do habituacji na co najmniej dwie godziny z zamkniętą pokrywką. Wyśrodkuj kamerę mikroskopu USB bezpośrednio nad 35-milimetrową płytką Stentora. Aby zainstalować aplikację do nagrywania kamery internetowej, otwórz aplikację do nagrywania kamery internetowej i wybierz mikroskop USB z menu rozwijanego.
Dostosuj ostrość w kamerze mikroskopu USB tak, aby komórki były wyraźnie widoczne, a pozycja kamery maksymalizowała liczbę komórek w polu view. Po otwarciu monitora szeregowego płytki mikrokontrolera należy wybrać brak zakończenia linii i ustawić go na 9 600 bodów. Użyj polecenia L na płytce mikrokontrolera, aby opuścić zworę, aż ledwo dotknie linijki, i polecenia R, aby podnieść ramię, jeśli to konieczne, aby dostosować dokładną pozycję.
Użyj polecenia I, aby zainicjować tryb automatyczny na urządzeniu habituacyjnym. Wprowadź kroki, rozmiar i czas między impulsami w minutach w wierszu poleceń. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą aplikacji do nagrywania kamery internetowej, naciskając czerwony przycisk nagrywania.
Następnie przestaw przełącznik na aparacie habituacyjnym, aby rozpocząć eksperyment z pierwszym zautomatyzowanym mechanicznym dostarczaniem impulsów. Bezpośrednio przed pojawieniem się pierwszego impulsu mechanicznego na filmie, zatrzymaj się i policz liczbę Stentora, które są zarówno zakotwiczone na dnie 35-milimetrowej płyty, jak i rozciągnięte w wydłużony kształt przypominający trąbkę. Podobnie, po pierwszym impulsie policz liczbę Stentora, które są zarówno zakotwiczone na dnie płytki, jak i skurczone w kształt kuli.
Podziel drugie liczenie przez pierwsze, aby określić frakcję Stentora, która skurczyła się w odpowiedzi na bodziec mechaniczny, powtarzając procedurę dla wszystkich impulsów mechanicznych w eksperymencie. Prawdopodobieństwo skurczu Stentora było monitorowane, a wyniki wykazały, że stopniowo maleje w ciągu jednej godziny. Po otrzymaniu czwartego poziomu impulsów mechanicznych z częstotliwością jednego stuknięcia na minutę, wskazujących na przyzwyczajenie.
Zmiana siły lub częstotliwości dostarczania impulsów mechanicznych może zmienić dynamikę przyzwyczajenia Stentora. Korzystanie z zestawu impulsów drugiego poziomu o częstotliwości jednego stuknięcia na minutę wyklucza przyzwyczajenie w ciągu jednej godziny. Możemy badać różne rodzaje dynamiki habituacji, zmieniając siłę i częstotliwość stymulacji mechanicznej.
Jest to okazja do zbadania różnych rodzajów uczenia się, takich jak uwrażliwianie. Ilościowe spostrzeżenia na temat uczenia się pojedynczych komórek, zebrane dzięki naszym metodom, mogą zainspirować inne sposoby przeprogramowania komórek w tkankach wielokomórkowych. Kolejny potencjalny sposób walki z chorobami.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę ilościowego pomiaru habituacji u jednokomórkowego organizmu Stentor, wykorzystującą aparat oparty na mikrokontrolerze do generowania kontrolowanych impulsów mechanicznych. Podejście to ma na celu pogłębienie zrozumienia prostych mechanizmów uczenia się, co może dostarczyć cennych informacji na temat takich schorzeń jak ADHD i zespół Tourette'a.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Neurobiologia
- Komórkowe mechanizmy uczenia się
- Badania pojedynczych komórek
Wstęp
- Habituacja jest podstawową formą uczenia się i pamięci.
- Zrozumienie zachowania pojedynczej komórki może ujawnić fundamentalne paradygmaty uczenia się.
- Niniejsze badanie bezpośrednio ocenia reakcję skurczową Stentor na bodźce mechaniczne.
Zastosowane metody
- Automatyzacja dostarczania bodźców oparta na mikrokontrolerze
- Stentor, organizm jednokomórkowy
- Generowanie impulsów mechanicznych i monitorowanie wideo
Główne wyniki
- Wykazano postępujący spadek prawdopodobieństwa skurczu Stentora w ciągu godziny przy zastosowaniu stymulacji mechanicznej.
- Zmiany siły lub częstotliwości stymulacji znacząco wpłynęły na dynamikę habituacji.
- Opracowano metodę badania różnych rodzajów zachowań uczenia się w pojedynczych komórkach.
Wnioski
- Badanie dostarcza wiedzy na temat habituacji komórkowej i jej zmienności w zależności od różnych warunków stymulacji.
- Praca ta ma znaczenie dla szerszych badań biologicznych, szczególnie w zakresie zrozumienia procesów uczenia się w bardziej złożonych systemach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza ilościowa habituacji w Stentor coeruleus zapewnia unikalną platformę do analizy mechanizmów uczenia się na poziomie pojedynczych komórek, niezależnie od obwodów neuronalnych. Możliwość ta umożliwia badaniom w obszarze biofarmacji R&Zespoły D do badania fundamentalnych zachowań adaptacyjnych, wspierając mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania. Podejście to dostarcza wglądu translacyjnego w procesy uczenia się komórkowego, istotne dla neurobiologii oraz portfolio modelowania chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie adaptacyjnych odpowiedzi behawioralnych w kontrolowanym, mierzalnym systemie.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację zjawisk uczenia się od złożonych sieci neuronowych.
- Ułatwia badanie procesów obliczeń komórkowych i procesów przypominających pamięć w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, zautomatyzowaną platformę do dostarczania i pomiaru bodźców mechanicznych.
- Generuje powtarzalne, ilościowe dane dotyczące prawdopodobieństwa skurczu do analizy porównawczej.
- Umożliwia skalowalny rozwój testów do przesiewania związków wpływających na habituację komórkową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje model do badania zaburzeń uczenia się istotnych w kontekście zaburzeń neurorozwojowych.
- Umożliwia zachowanie ciągłości między badaniami nad adaptacją komórkową a badaniami nad systemami wielokomórkowymi.
- Pozwala na dostosowany do ryzyka postęp w badaniach nad celami terapeutycznymi zaangażowanymi w patologie związane z habituacją.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnych badań mechanistycznych po rozwój modeli przedklinicznych, zapewniając wielokrotnego użytku platformę do analizy zachowań adaptacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie uczenia się i adaptacji pojedynczych komórek, co pozwala na wyjaśnienie hipotez na poziomie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia zautomatyzowaną, powtarzalną stymulację mechaniczną w celu uzyskania wiarygodnych wyników analiz.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie prawdopodobieństwa skurczu w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wiedzę na temat uczenia się komórkowego z modelowaniem systemów istotnych w kontekście chorobowym.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia elastyczną aparaturę do różnorodnych badań nad uczeniem się i adaptacją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmów odpowiedzi adaptacyjnej i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie bodźców i kwantyfikację odpowiedzi w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności w modelach uczenia komórkowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków powiązanych z uczeniem się i habituacją z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w programowaniu mikrokontrolerów oraz w ilościowej analizie behawioralnej.
- Wymaga aparatury do zautomatyzowanej stymulacji mechanicznej i rejestracji wideo o wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga standaryzacji parametrów stymulacji i oceny odpowiedzi pomiędzy zespołami badawczymi.
- Możliwość adaptacji do innych jednokomórkowych lub prostych wielokomórkowych układów wykazujących odpowiedź mechaniczną.
- Ograniczenie do zachowań mierzalnych poprzez skurcz lub podobne obserwowalne parametry wyjściowe.
