Name: Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę różnicowania funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ krwi obwodowej przy użyciu M-CSF i ligandu RANK. Protokół umożliwia generowanie aktywnych komórek w ciągu tygodnia do badań biologii kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Flow Core Facility oraz Glasgow Imaging Facility (GIF) w ramach School of Infection and Immunity za ich wsparcie i pomoc w tej pracy.

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Łatwa hodowla i izolacja dużej liczby funkcjonalnych OC in vitro są ważne dla lepszego zrozumienia biologii kości i chorób zależnych od OC. Klasycznie OC generowano w kokulturach z osteoblastami lub komórkami zrębu i komórkami krwiotwórczymi ze śledziony lub szpiku kostnego38,39. Znaczącym przełomem w zrozumieniu osteoklastogenezy była identyfikacja RANKL jako głównego regulatora powstawania, różnicowania i przeżycia OC40. Wczesne protokoły systemów hodowli zależnych od RANKL wykorzystywały PBMC do generowania OC 21,41,42. Jednak te mieszane kultury są długotrwałe i zawierają wiele czynników zakłócających, które ograniczają możliwość testowania bezpośredniego wpływu na różnicowanie i funkcję OC. Protokół ten opisuje skuteczny i wiarygodny model osteoklastogenezy in vitro z ludzkich obwodowych monocytów CD14 +, w którym optymalną osteoklastogenezę można uzyskać w ciągu 7 dni (ryc. 1 i ryc. 2), co jest znacznie szybsze w porównaniu z niektórymi innymi protokołami 43,44,45,46. Głównymi cechami wyróżniającymi ten protokół są: (1) zastosowanie oczyszczonych monocytów CD14 +, (2) przygotowanie monocytów M-CSF przed ekspozycją na RANKL, (3) długość hodowli (<7 dni) oraz (4) niezawodne wykrywanie hamowania tworzenia OC (barwienie TRAP) i funkcji (resorpcja, produkcja ATP, reorganizacja pierścienia aktynowego) za pomocą inhibitorów. 
W trakcie optymalizacji metodyki zidentyfikowano kilka punktów krytycznych. Zaobserwowano, że różnicowanie OC in vitro jest w dużej mierze zależne od gęstości wysiewu monocytów CD14+. Tak więc w tym protokole komórki są wysiewane w dużej gęstości (1 x 105 komórek/dołek 96-dołkowej płytki, w 100 μl pożywki), ponieważ ważne jest, aby komórki mogły wchodzić ze sobą w interakcje i znajdować się w pobliżu, aby połączyć się i stać się dojrzałymi OC. Podobnie, wysiewanie komórek przy zbyt dużej gęstości ogranicza ich różnicowanie i wzrost ze względu na ograniczenia podłoża i brak wymaganej przestrzeni. Ponadto, aby osiągnąć maksymalny sukces w tym protokole, ważne jest, aby dokładnie przeprowadzić separację gradientu gęstości i upewnić się, że wzbogacona populacja komórek CD14 + jest tak czysta, jak to tylko możliwe. Na przykład nieodpowiednie etapy mycia skutkują brakiem usuwania płytek krwi, co w konsekwencji hamuje różnicowanie OC47,48. Podobnie, obecność niewielkiego zanieczyszczenia limfocytów T w izolowanych preparatach CD14 + stymulowanych samym M-CSF może powodować różnicowanie OC, potencjalnie poprzez wydzielanie RANKL przez limfocyty T49. Dlatego ważne jest, aby dołączyć kontrolę M-CSF do każdego eksperymentu. Rutynowa kontrola czystości, zwłaszcza w przypadku korzystania z nowego zestawu do izolacji, jest również zalecana w celu zapewnienia czystości próbki.
Optymalne wartości OC (zakres: ~200-1 600 OC/dołek) uzyskuje się przy użyciu pożywki α-MEM wzbogaconej o nukleozydy i L-glutaminę. Inne konwencjonalne podłoża hodowlane, w tym zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) i pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, wpływają na wydajność OC. Źródło FBS może również wpływać na osteoklastogenezę. Różne partie FBS mogą prowadzić do zmniejszenia osteoklastogenezy pochodzącej z RANK-L, a także do pojawienia się małej liczby komórek wielojądrowych TRAP + w kontrolach M-CSF (rysunek uzupełniający 3). Dlatego, aby osiągnąć spójne wyniki, zaleca się testowanie nowych partii FBS przed użyciem i kontynuowanie tej samej partii przez cały czas trwania eksperymentów, aby zminimalizować różnice w procesie różnicowania. Ponadto zmienność między dawcami, pod względem całkowitej liczby zróżnicowanych OC uzyskanych w końcowym punkcie czasowym, stanowi ograniczenie przy stosowaniu tego protokołu do porównywania, na przykład, zdrowych dawców z pacjentami. W takich przypadkach konieczne jest użycie dokładnie tych samych warunków i tej samej partii pożywki, FBS i innych odczynników.
Kolejnym niezbędnym krokiem dla optymalnego różnicowania i dojrzewania OC jest zaszczepienie monocytów M-CSF przed dodaniem RANKL. Ekspozycja komórek na M-CSF 18-24 godziny przed RANKL przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Dodanie RANKL w tym punkcie czasowym zapewnia optymalne różnicowanie OC w sposób zależny od dawki. Stopień zróżnicowania OC różni się w zależności od dawcy; jednak 25 ng / ml RANKL jest zwykle wystarczające do różnicowania dużej liczby OC u większości dawców. Dodatkowo, 25 ng/ml RANKL może być stosowany w testach do wstępnych badań przesiewowych związków, ponieważ ułatwia ocenę zarówno wzmacniającego, jak i hamującego działania badanych związków. Inne systemy hodowli wykorzystywały dłuższe czasy preinkubacji M-CSF przed dodaniem RANKL, ale skutkuje to dłuższym czasem hodowli osteoklastogenezy50. Ponadto pozostawienie przygotowanych monocytów do inkubacji przez noc pozwala im przyczepić się do płytki, choć nie w stanie w pełni przylegającym. Dlatego, gdy RANKL jest wprowadzany po raz pierwszy, pożywka musi być bardzo ostrożnie zmieniona w połowie, a nie całkowicie zmieniona, aby zapobiec oderwaniu i utracie przygotowanych monocytów. Pożywkę należy również odświeżać co 3-4 dni, aby uniknąć wyczerpania pożywki i zapobiec śmierci komórki. Ponadto, ze względu na małą objętość użytą w tym teście (100 μl/studzienkę na płytce 96-dołkowej), niezwykle ważne jest, aby wokół studzienek testowych znajdowała się rama z pustych studzienek, które są wypełnione roztworem wodnym (tj. sterylnym destylowanymH2Olub PBS). Zapobiega to parowaniu medium i efektom krawędziowym.
Wreszcie, w przypadku testów metabolicznych (np. Testów ATP), konieczne jest, aby komórki były żywotne, aby uniknąć ogromnego odchylenia standardowego między kontrpróbami (ryc. 5). Wysoka żywotność komórek jest również ważna dla sortowania komórek i dalszej hodowli posortowanych OC (ryc. 4). Ta metoda ma jednak kilka ograniczeń. W pełni dojrzałe OC są bardzo przylegające i trudne do oderwania od płytek. Większe OC są często niemożliwe do odłączenia, co może prowadzić do niższej wydajności ogniw. W związku z tym komórki należy policzyć po sortowaniu, a przed posiewem w wymaganym stężeniu. Ponadto w niniejszym protokole stosuje się metodę nieenzymatyczną (akutazę) do odłączania OC w celu zapobieżenia zmianom błony w dalszym barwieniu powierzchni do cytometrii przepływowej. Przetestowano również użycie skrobaków komórkowych (zarówno z miękkimi, jak i twardymi końcami), które doprowadziło do wysokiej śmierci komórek. Oddzielenie enzymatyczne przy użyciu 0,05% roztworów trypsyny/EDTA może być stosowane w celu uzyskania wyższej wydajności oderwanych OC, gdy integralność membrany nie jest wymagana w dalszych zastosowaniach. Dodatkowo, aby zapobiec zlepianiu się OC, zdecydowanie zaleca się stosowanie wysokiego stężenia EDTA we wszystkich po odłączeniu komórek, a także odpowiednie filtrowanie przed akwizycją cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że kultury OC to niejednorodna populacja komórek składająca się z dojrzałych OC, prekursorów OC i makrofagów. Makrofagi można łatwo odróżnić od OC, chociaż zarówno jednojądrzaste pre-OC, jak i wielojądrowe OC wyrażają OSCAR i nie można ich odróżnić za pomocą obecnej metody (ryc. 4). To ostatnie zagadnienie stanowi bowiem główne ograniczenie tej metody. Ponadto niska ekspresja OSCAR jest również obecna w kulturach M-CSF (Figura 4B) i może wskazywać na makrofagi, które są przygotowane do zaangażowania w linię OC. Ważne jest, aby ustawić bramkę dla komórek OSCAR+ w oparciu o sygnał barwienia FMO, jak pokazano na rysunku 4B.
Podsumowując, protokół ten opisuje zoptymalizowaną i solidną metodę wydajnej produkcji aktywnych i funkcjonalnie dojrzałych OC z krążących pierwotnych ludzkich monocytów. Mocną stroną tego protokołu jest jego zdolność do generowania OC w krótkim czasie i uzyskiwania dużej liczby zróżnicowanych OC. Metoda ta otwiera drogę do zbadania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw różnicowania i funkcji OC.

Osteoklasty (OC) to wielojądrowe gigantyczne komórki linii krwiotwórczej z unikalną zdolnością do resorpcji kości. Są one odpowiedzialne za rozwój i ciągłą przebudowę skeletonu1,2. W kostnych fazach rozwoju OC i makrofagi rezydujące w tkankach pochodzą z erytro-szpikowych komórek progenitorowych i kolonizują niszę kostną i tkanki narządów. W warunkach fizjologicznych erytro-szpikowe komórki progenitorowe są niezbędne do prawidłowego rozwoju kości i wyrzynania się zębów, podczas gdy napływ krążących monocytów krwi do niszy kostnej zapewnia poporodowe utrzymanie OC, masy kostnej i jamy szpiku kostnego3. W warunkach patologicznych monocyty są rekrutowane do miejsc aktywnego stanu zapalnego i mogą przyczyniać się do patologicznego niszczenia kości4,5.
Pacjenci z kilkoma formami zapalenia stawów doświadczają zapalenia stawów, co prowadzi do postępującego niszczenia stawów spowodowanego przez OCs6. Na przykład w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS) nadmiernie aktywowane OC są odpowiedzialne za patologiczną erozję kości i niszczenie stawów7,8, a obecne leczenie często nie poprawia ani nie zatrzymuje uszkodzenia kości9,10,11. Zmiany w krążących monocytach, zarówno pod względem rozmieszczenia populacji, jak i sygnatur transkryptomicznych i epigenetycznych, odnotowano u pacjentów z RZS12,13,14. Ponadto doniesiono, że zmienione odpowiedzi monocytów na stymulację zapalną wpływają na osteoklastogenezę u pacjentów z RZS z aktywną chorobą15,16,17.
Różnicowanie OC to złożony, wieloetapowy proces polegający na zaangażowaniu komórek prekursorowych szpiku w prekursory OC. Podczas osteoklastogenezy OC stają się gigantyczne i wielojądrzaste poprzez fuzję komórka-komórka, niepełną cytokinezę i proces recyklingu jądrowego opisany jako rozszczepienie i fuzja18,19,20. Zdolność do różnicowania OC in vitro pozwoliła na znaczący postęp w zrozumieniu biologii kości21. OC odróżniają się od prekursorów po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). To ostatnie jest niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania OC in vitro i in vivo, nawet w warunkach zapalnych6,22,23. RANKL jest prezentowany przez osteoblasty i osteocyty, a także przez aktywowane limfocyty T i fibroblasty w zapalnym RZS synovium2,24,25. Podczas procesu różnicowania OC monocyty wystawione na działanie M-CSF zwiększają ekspresję receptora czynnika jądrowego kappa-B (RANK) na błonie komórkowej i pod wpływem późniejszej stymulacji RANKL różnicują się w oporne na winian fosfatazy kwasowej (TRAP)-dodatnie jednojądrzaste pre-OC, a następnie w wielojądrowe OCs15,26. OC wytwarzają kilka enzymów, z których najważniejszym jest TRAP, który umożliwia degradację fosfoprotein w obrębie bone27. Regulatorem i markerem różnicowania OC jest receptor związany z OC (OSCAR). Jest regulowany w górę wcześnie w komórkach prekursorowych, które zobowiązują się do linii OC28. Dojrzałe gigantyczne wielojądrowe OC mogą degradować (resorbować) macierz szkieletową, generując dużą strefę uszczelniającą, która jest wykonana z pierścienia aktynowego otaczającego pofałdowaną granicę21,29,30. Zdolność OC do resorpcji kości wymaga reorganizacji cytoszkieletu, a w konsekwencji polaryzacji i powstania pofałdowanej błony, która jest tak zwaną pofałdowaną granicą. Pofałdowana granica otoczona jest dużym okrągłym pasmem o strukturze bogatej w F-aktynę, który jest pierścieniem aktynowym lub strefą uszczelniającą. Integralność pierścienia aktynowego jest niezbędna, aby OC resorpowały kość zarówno in vitro, jak i in vivo, a wadliwe tworzenie pofałdowanych granic jest związane z ekspresją trifosfatazy adenozynowej (V-ATPazy) w dolnej wakuoli31,32,33. Co więcej, OC są komórkami bogatymi w mitochondria, a trifosforan adenozyny (ATP) wiąże się ze strukturami podobnymi do mitochondriów w OC zlokalizowanych na pofałdowanej granicy31,32,33. Rotenon działa jako silny inhibitor kompleksu mitochondrialnego I i wpływa na produkcję ATP. Wykazano również, że rotenon hamuje różnicowanie i funkcję OC34.
Ten protokół opisuje skuteczną i zoptymalizowaną metodę osteoklastogenezy in vitro z próbek ludzkiej krwi obwodowej. W ludzkiej krwi obwodowej monocyty CD14+ są głównym źródłem OCs15,35,36. W tym protokole kinetyka ekspozycji oraz stężenia M-CSF i RANKL zostały dostosowane w celu uzyskania optymalnej osteoklastogenezy. Komórki jednojądrzaste są najpierw oddzielane od erytrocytów i granulocytów obecnych we krwi pełnej za pomocą gradientu gęstości; następnie są wzbogacane o monocyty CD14 + za pomocą pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane monocyty CD14 + są następnie inkubowane przez noc z M-CSF. To przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Późniejsze dodanie RANKL indukuje osteoklastogenezę i wielojądrowość w sposób zależny od czasu. OC z aktywną resorpcją pokazują charakterystyczny rozkład pierścieni F-aktyny na krawędzi błony komórkowej30,32 i barwienie dla TRAP. Dojrzałe OC analizuje się poprzez ilościowe określenie komórek wielojądrowych TRAP+ (więcej niż trzy jądra). Zdolność funkcjonalną dojrzałych OC można ocenić na podstawie ich resorpcji, integralności pierścienia aktynowego i produkcji ATP. Co więcej, zróżnicowane OC CD14− OSCAR+ mogą być wzbogacane i wykorzystywane do oceny wpływu niektórych związków na funkcjonalność OC poprzez resorpcję minerałów (lub zębiny) i organizację F-aktyny. Dodatkowo w niniejszej pracy wykorzystano znany inhibitor OC, rotenon, jako przykład związku wpływającego na funkcjonalność OC. Zmniejszona aktywność resorpcyjna OC pod wpływem rotenonu wiąże się ze zmniejszoną produkcją ATP i fragmentacją pierścienia aktynowego. Podsumowując, protokół ten ustanawia solidny test, który może być wykorzystany jako metoda referencyjna do badania kilku biologicznych aspektów różnicowania i funkcji OC in vitro. 
Ta metodologia może być użyta do oceny (1) potencjału krążących monocytów do różnicowania się w OC w zdrowiu i chorobach, a także (2) wpływu kandydatów terapeutycznych na różnicowanie i funkcję OC. Ten solidny protokół osteoklastogenezy umożliwia określenie skuteczności i mechanizmów terapii ukierunkowanych na kości zarówno w odniesieniu do różnicowania OC z komórek prekursorowych, jak i funkcji dojrzałych OC.

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide 18-dołkowe szkiełka komorowe</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szklane szkiełka komorowe&nbsp;</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80807&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka TC&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy test kostno-ościowy Stripwell Plate&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3989&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór octanu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>386-3</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>20066.330&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy kwasowej, leukocytów (TRAP)&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp;</td><td>387A-1KT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Theremo Fisher - Invitrogen&nbsp;</td><td>A12379&nbsp;</td><td>AF488&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher - Invitrogen</td><td>A22287</td><td>AF647</td></tr><tr><td>Alfa Aesar 2-Deoksy-D-glukoza&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>11321867&nbsp;</td><td>2DG, 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Minimum alfa niezbędne podłoże&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>22571-020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite 1krok&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td>6016731&nbsp;</td><td>System oznaczania luminescencji ATP&nbsp;</td></tr><tr><td>Sortownik komórek BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9418-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96-dołkowa, PS, F-bottom&nbsp;</td><td>Greiner bio-one&nbsp;</td><td>655083&nbsp;</td><td>Płyty z białym dnem&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór cytrynianu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91-5</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Corning 6ml probówki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa Corning do badania kości kości</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3989</tr><tr><td>Test kostny Corning Powierzchniowa płytka wielodołkowa 1 x 8 paskowa</td><td>Corning</td><td>CLS3989-2EA</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Theremo Fisher &nbsp;</td><td>D3571&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pozytywnej selekcji człowieka EasySep CD14&nbsp;</td><td>Technologie STEMCELL&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 17858&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek EasySep (10x)</td><td>Technologie komórek macierzystych&nbsp;</td><td>20110</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience utrwalany barwnik żywotności eFluor 780</td><td>Theremo Fisher - Invitrogen&nbsp;</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E7889-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System automatycznego obrazowania EVOS FL</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32678</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe probówki polipropylenowe Falcon z nakrętką</td><td>Fisher Scientific</td><td>10314791</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 15 ml</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 430790&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 mL&nbsp;</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>430828&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szybki granat GBC roztwór bazowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-2</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 10500-064&nbsp;</td><td>FBS (Sieć Usługowa</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>cytiva&nbsp;</td><td>17144003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F-8775&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki ligand sRANK&nbsp;</td><td>PEPROTECH&nbsp;</td><td>310-01-100UG&nbsp;</td><td>Aktywator receptora czynnika jądrowego liganda kappa-B&nbsp; (RANGL)</td></tr><tr><td>ImageJ Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Image J</td><td>wersja 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25030-024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z heparyną litową (9 ml)&nbsp;</td><td>ODKURZACZ&nbsp;</td><td>455084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów&nbsp;</td><td>PEPROTECH&nbsp;</td><td>300-25-100UG&nbsp;</td><td>&nbsp; M-CSF</td></tr><tr><td>Napthol AS-BI roztwór kwasu fosforowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-1</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Komora zliczająca hemacytometr Neubauer&nbsp;</td><td>Camlab</td><td>SKU 1127885</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna ze Streptomyces Diastatochromogenes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Q4876-5MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało OSCAR, anty-ludzkie, Vio Bright FITC, REAfinit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-661 i 130-107-617</td><td>Klon REA494</td></tr><tr><td>PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-ludzkie CD14</td><td>Biolegend</td><td>325618</td><td>Klon HCD14&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicyna/streptomycyna&nbsp;</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>P0781&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna i oprogramowanie PHERAstar</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (DPBS, 1x)&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 14190-094&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kontrolne REA (S), ludzkie IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-443</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu, roztwór &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 425044-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór azotynu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91-4</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Roztwór winianu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-3</td><td>z zestawu Nr kat. 387A-1KT</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>9002-93-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154-100ML&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów cd14+ ludzkiej krwi obwodowej

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklasty (OC) to komórki resorpujące kości, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju szkieletu i przebudowie kości u dorosłych. Kilka zaburzeń kości jest spowodowanych zwiększonym różnicowaniem i aktywacją OC, więc hamowanie tej patobiologii jest kluczową zasadą terapeutyczną. Dwa kluczowe czynniki napędzające różnicowanie OC od prekursorów szpiku: czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). Od dawna wiadomo, że ludzkie krążące monocyty CD14 + różnicują się w OC in vitro. Jednak czas ekspozycji i stężenie RANKL wpływają na skuteczność różnicowania. Rzeczywiście, opisano protokoły generowania ludzkich OC in vitro, ale często skutkują one słabym i długotrwałym procesem różnicowania. W tym celu zapewniony jest solidny i ustandaryzowany protokół do generowania funkcjonalnie aktywnych, dojrzałych ludzkich OC w odpowiednim czasie. Monocyty CD14 + są wzbogacone z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i zaszczepione M-CSF w celu zwiększenia RANK. Późniejsza ekspozycja na RANKL generuje OC w sposób zależny od dawki i czasu. OC są identyfikowane i oznaczane ilościowo przez barwienie fosfatazą kwasoodporną winianu (TRAP) i analizę mikroskopową światła. Barwienie immunofluorescencyjne jąder i F-aktyny służy do identyfikacji funkcjonalnie aktywnych OC. Ponadto dojrzałe OC OSCAR+CD14− są dodatkowo wzbogacane poprzez sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i ilościowe określanie funkcjonalności OC za pomocą testów resorpcji minerałów (lub zębiny/kości) i tworzenia pierścieni aktynowych. Wreszcie, znany inhibitor OC, rotenon, jest stosowany w dojrzałych OC, co pokazuje, że produkcja adenozynotrifosforanu (ATP) jest niezbędna dla integralności pierścienia aktynowego i funkcji OC. Podsumowując, w niniejszej pracy ustanowiono solidny test do różnicowania dużej liczby OC, który w połączeniu z barwieniem pierścieni aktynowych i testem ATP stanowi użyteczny model in vitro do oceny funkcji OC i badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych związków terapeutycznych, które mogą modulować proces różnicowania.

Generowanie OC z monocytów CD14+ 
Celem tej metody było łatwe różnicowanie dużej liczby OC z ludzkich monocytów CD14+ krwi obwodowej in vitro, zazwyczaj w ciągu 1 tygodnia. Najpierw monocyty CD14+ zostały wzbogacone z PBMC i poddane primingu za pomocą M-CSF przez noc w celu upregulacji RANK, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami15. Po primingu monocytów, w celu określenia optymalnego stężenia RANKL dla różnicowania i dojrzewania OC, zastosowano stężenia RANKL wynoszące 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL oraz 100 ng/mL, wraz z 25 ng/mL M-CSF. Dodatek RANKL spowodował wzrost liczby dużych, TRAP-dodatnich, wielojądrowych OC w sposób zależny od dawki, co oceniono za pomocą barwienia TRAP. Dojrzałe OC definiuje się jako komórki TRAP-dodatnie z wieloma jądrami (zazwyczaj więcej niż trzy; Rycina 2A,B oraz Rycina uzupełniająca 1). Ponadto zbadano kinetykę różnicowania OC z monocytów za pomocą barwienia TRAP i mikroskopii świetlnej w okresie hodowli od 2 do 14 dni. W tym przypadku, aby ocenić szybkość różnicowania OC w hodowli, wybrano różnicowanie OC z użyciem pośredniego stężenia 50 ng/mL RANKL. W tych warunkach hodowli wielojądrowe OC były widoczne od 5. dnia, a optymalne różnicowanie osiągnięto w 7. dniu (Rycina 2C). Przedłużona inkubacja hodowli na tworzywach sztucznych powyżej 10 dni prowadziła do powstania nieprawidłowo wielkich komórek zlanej formy. W tym protokole dni 6-8 są zazwyczaj uznawane za optymalny punkt końcowy generowania OC. Komórki OC mogą być ilościowo oznaczane lub wykorzystywane w dalszych analizach.
Ocena funkcjonalna zróżnicowanych OC 
Aby określić aktywność funkcjonalną wygenerowanych OC, przebadano ich aktywność resorpcyjną poprzez różnicowanie OC na zmineralizowanej powierzchni. Ponieważ duże OC powstają dopiero po 7-dniowym okresie hodowli, a aby zapewnić wystarczający czas na resorpcję podłoża mineralnego, hodowle utrzymywano do 10. dnia. Powstawanie okrągłych otworów, czyli lakunek resorpcyjnych, obserwowano wyłącznie na zmineralizowanych powierzchniach studzienek zawierających komórki traktowane zarówno M-CSF, jak i RANKL (Rysunek 3). W związku z tym procent rozpuszczonej zmineralizowanej powierzchni (lakun resorpcyjnych) pozwala na określenie zdolności resorpcyjnej OC. Dodatkowo, OC zróżnicowane zgodnie z tym protokołem do 7. dnia, zarówno na plastikowych, jak i szklanych szkiełkach przedmiotowych z komorami, wykazywały dobrze zorganizowaną strukturę pierścienia aktynowego, którą można było zwizualizować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (Rysunek dodatkowy 2).
Wpływ inhibitora na funkcję dojrzałych OC 
Powyższe warunki hodowli wykorzystano do określenia zdolności funkcjonalnej in vitro generowane OC w obecności znanego inhibitora OC, rotenonu34Komórki OC różnicowano przez okres od 6 do 8 dni, a CD14−OSCAR+ Wzbogacono OC i prekursory OC poprzez cytometria przepływowa (Rycina 4). Wzbogacone komórki wysiano następnie w gęstości 50 000 komórek na studzienkę na mineralną płytkę 96-dołkową w pożywce proosteoklastogennej (25 ng/ml M-CSF i RANKL) na 3 dni. Traktowanie rotenonem (Rycina 5A,B) hamowało w sposób zależny od dawki resorpcję zmineralizowanej powierzchni w porównaniu z nieleczoną kontrolą, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami34Dodatkowo oceniono funkcjonalność OC poprzez Produkcja ATP i tworzenie pierścienia aktynowego. Zależne od rotenonu hamowanie resorpcji OC wiązało się z zahamowaniem produkcji ATP (Rycina 5C). Resorbujące osteoklasty (OC) są komórkami silnie spolaryzowanymi, które regulują swoją zdolność resorpcyjną poprzez promowanie organizacji cytoszkieletu. Do znakowania cytoszkieletu aktynowego (F-aktyny) dojrzałych OC hodowanych w obecności lub w nieobecności rotenonu użyto faloidyny sprzężonej z Alexa Fluor 647. Rotenon spowodował fragmentację pierścienia aktynowego indukowanego przez RANKL w dojrzałych OC (Rysunek 5D).
<img alt="Równowaga statyczna, różnicowanie TRAP+; wykres i obrazy mikroskopowe pokazują efekty działania M-CSF/RANKL w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Efektywne różnicowanie się OC z prekursorów monocytów CD14+. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone magnetycznie, wysiane w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/studzienkę na płytkach 96-dołkowych i inkubowane przez noc z 25 ng/mL M-CSF. (A) Monocyty przygotowane za pomocą M-CSF stymulowano rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL i 100 ng/mL), a następnie utrwalono i barwiono na TRAP w 7. dniu. Wykonano obrazowanie i policzono wielojądrowe komórki (MNCs) TRAP+. Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP przedstawiono na Rycini Uzupełniającej 1. Słupki błędu przedstawiają średnią ± SD (n = 3). Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu wielokrotnych porównań Holma-Sidaka dla danych sparowanych; * P ≤ 0,05 oraz ** P ≤ 0,005. (B) Reprezentatywny obraz zabarwionej na TRAP studzienki płytki 96-dołkowej, pokazujący typową oczekiwaną liczbę OC/studzienkę oraz ich morfologię przy 25 ng/mL RANK-L w porównaniu do makrofagów pochodzenia M-CSF w 7. dniu. Paski skali: 1000 µm. (C) Reprezentatywne obrazy tworzenia się OC przy 50 ng/mL RANKL oceniane via barwienie TRAP od 2. do 14. dnia. OC są widoczne od 5. dnia. Gigantyczne, nieprawidłowo połączone OC występują po 10 dniach. Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat resorpcji kości; M-CSF sam w sobie vs M-CSF z RANKL, wykres porównawczy danych dotyczących % resorpcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Resorpcyjne osteoklasty zróżnicowane z komórek CD14++ monocyty. CD14+ komórki wyizolowane z PBMC różnicowano przez 10 dni do postaci OCs w obecności 25 ng/mL M-CSF (M) i RANKL (R) na płytkach do analizy mineralizacji (osteo-assay).A) Obrazy reprezentatywnych zrekonstruowanych studzienek wykonane przy 10-krotnym powiększeniu w celu analizy resorpcji w 10. dniu (podłoże mineralne w kolorze szarym; wgłębienia resorpcyjne w kolorze białym). Paski skali: 1000 µm. (B) Ilościowe określenie procentowej powierzchni resorpcji. Dane dotyczące resorpcji przeanalizowano za pomocą testu Wilcoxona dla prób zależnych. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający sortowanie komórek; wykresy FSC, SSC; analiza CD14, OSCAR; żywotność komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wzbogacanie osteoklastów (OC) CD14−OSCAR+ za pomocą cytometrii przepływowej. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone z PBMC, a następnie zróżnicowano je na OC zgodnie z wcześniejszym opisem. Przyległe kultury OC ododerwano za pomocą accutase i wybarwiono do analizy cytometrii przepływowej. (A-C) OC w 8. dniu zostały posortowane na podstawie ekspresji CD14 i OSCAR. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania podczas sortowania. Wyłoniono singlety, komórki negatywne pod kątem barwienia martwych komórek, a następnie posortowano subpopulacje CD14+OSCAR+ (czerwona) i CD14−OSCAR+ (niebieska). (B) Reprezentatywne wykresy pokazujące nakładające się barwienie OSCAR dla OC pochodzących z RANKL (cyjan) oraz kontrolnych makrofagów pochodzących z M-CSF (pomarańczowy). Kolor czerwony oznacza kontrolę izotypową OSCAR dla OC pochodzących z RANKL. (C) Posortowane populacje wysiano na plastik i pozostawiono do adhezji przez 2 h w medium pro-OC (25 ng/mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL), a następnie przeprowadzono barwienie TRAP i wizualizację. Reprezentatywne obrazy pokazują brak komórek TRAP+ w subpopulacji CD14+ (czerwona) oraz jedno- i wielojądrzaste pre-OC i OC TRAP+ w subpopulacji CD14− (niebieska). Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza resorpcji kości; Efekt rotenonu; Diagram, wykres, mikroskopia; Badanie aktywności osteoklastów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Testy oceniające funkcję dojrzałych osteoklastów. Aby ocenić funkcję dojrzałych osteoklastów (OC), CD14+ komórki wyizolowane z PBMC hodowano przez 7 dni albo z samym M-CSF (M), albo w połączeniu z RANKL (R), w celu wzbogacenia populacji OC poprzez cytometrią przepływową, a następnie OC traktowano inhibitorem rotenonem przez 24 h. (ADojrzałe osteoklasty (OC) zostały wyselekcjonowane poprzez cytometria przepływowa (CD14)−OSCAR+) i hodowano na mineralnej powierzchni testowej w obecności lub w nieobecności rotenonu przez 3 dni, po czym komórki poddano odbarwianiu i obrazowaniu przy powiększeniu 10x w celu uwidocznienia obszaru resorpcji (dołki resorpcyjne w kolorze białym). (A) Reprezentatywne zrekonstruowane obrazy studzienek. Paski skali: 1000 µm. (B) Ilościowe oznaczenie procentowej powierzchni resorpcji. Dane w (B) przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Dunna (n = 7); * P ≤ 0,05 oraz** P ≤ 0,01. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD. (C) Całkowita wewnątrzkomórkowa zawartość ATP w niedróżnicowanych oraz dojrzałych, zróżnicowanych w 7. dniu osteoklastach (OC), których różnicowanie indukowano RANKL i które poddano działaniu nośnika lub rotenonu (10 nM i 30 nM). W badaniu tym 2DG oraz oligomycynę zastosowano jako kontrole pozytywne; dodano je na 30 min przed lizą komórek i kwantyfikacją ATP. Słupki błędu przedstawiają średnią ± SD (n = 4). Dane przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu porównań wielokrotnych Dunnetta dla danych sparowanych. ** P ≤ 0.01. (D) Reprezentacyjny obraz przy powiększeniu 20x dojrzałych osteoklastów barwionych w celu wykazania tworzenia pierścienia aktynowego (czerwony) i jąder komórkowych (niebieski), przedstawiający zanik pierścienia aktynowego pod wpływem inhibitora. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Format płytki</td>
			<td>płytka 96-dołkowa</td>
			<td>płytka 48-dołkowa</td>
			<td>płytka 24-dołkowa</td>
			<td>płytka 12-dołkowa</td>
			<td>płytka 6-dołkowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objętość</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>225–250 µL</td>
			<td>450–500 µL</td>
			<td>0.8–1 mL</td>
			<td>1.8–2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętość zawiesiny komórkowej dla różnych formatów płytek. Objętości zostały obliczone na podstawie roztworu o stężeniu 1 x 106 komórek/mL i zapewniają optymalną gęstość dla fuzji komórka-komórka.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>fluorofor, klon  </td>
			<td>Objętość (μL) na 106 komórki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>PE/Cyanine7, HCD14 </td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do sortowania komórek </td>
			<td></td>
			<td>80 μL </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2 : Roztwór master mix przeciwciał. 
Rysunek uzupełniający 1: Barwienie TRAP w odpowiedzi na dawkę RANKL. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone magnetycznie, wysiane w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/studzienkę w płytkach 96-dołkowych i inkubowane przez noc z 25 ng/mL M-CSF, zgodnie z Rysunkiem 2. Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP przedstawiają monocyty przygotowane za pomocą MCSF i stymulowane rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL i 100 ng/mL), utrwalone i zabarwione na TRAP w 7. dniu. Paski skali: 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Barwienie pierścienia aktynowego w w pełni zróżnicowanych komórkach osteoklastów (OC). (A) Powiększenie 10x komórek OC zróżnicowanych na plastiku TC i zabarwionych falloidyną AF647 (kolor czerwony). Pasek skali: 400 µm. (B) Powiększenie 40x komórek OC zróżnicowanych na szkiełkach komorowych i zabarwionych falloidyną AF488 (kolor żółty). Pasek skali: 100 µm. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI, co przedstawiono w kolorze niebieskim w (A) oraz w kolorze cyjanowym w (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Wpływ różnych partii FBS na wydajność różnicowania OC. OC różnicowano z monocytów CD14+ w obecności 25 ng/mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL (MR) przez 7 dni. Do studni kontrolnych dodano wyłącznie M-CSF (M). (A) Reprezentatywne powiększenia 10x (paski skali: 400 µm) oraz (B) ilościowe oznaczenie OC barwionych TRAP, różnicowanych od jednego dawcy w dwóch różnych partiach FBS. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD z trzech powtórzeń technicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. Nasz protokół opisuje zoptymalizowaną i powtarzalną metodę generowania osteoklastów in vitro, która może być wykorzystana do zbadania mechanizmów leżących u podstaw procesu różnicowania i funkcjonalności. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do generowania dużej liczby funkcjonalnie aktywnych osteoklastów w ciągu zaledwie tygodnia. Wysoką wydajność różnicowania uzyskuje się dzięki zastosowaniu oczyszczonych monocytów i dodaniu cytokin na czas.Osteoklasty są odpowiedzialne za niszczenie kości we wszystkich formach zapalenia stawów, a ta metoda zapewnia narzędzia do badań przesiewowych nowych związków terapeutycznych, które mogą modulować ich różnicowanie i/lub funkcje. Procedurę zademonstruje Patricia Riedlova, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek wyizoluj PBMC, przenosząc krew do nowej 50-mililitrowej probówki.Rozcieńczyć go sterylnym PBS w równej objętości dla świeżej krwi lub w stosunku 1:3 dla czopków leukocytów i kożuchówki. Delikatnie wymieszaj krew przez odwrócenie. Przygotuj 15-mililitrowe probówki zawierające trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości i powoli ułóż od ośmiu do 10 mililitrów rozcieńczonej krwi na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości, unikając mieszania.Wirować probówkę o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca. Następnie ostrożnie wyrzuć wierzchnią warstwę za pomocą pipety Pasteura. Zbierz znajdującą się pod spodem warstwę międzyfazową zawierającą PBMC i przenieś tę warstwę do nowej 50-mililitrowej rurki.Zawiesić komórki do 50 mililitrów sterylnym PBS i zmyć pożywkę o gradiencie gęstości resztkowej, wirując przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z pełnym hamulcem. Aby usunąć resztki płytek krwi, powtórzyć proces wirowania zgodnie z opisem w manuskrypcie, ponownie zawiesić wyizolowane i oczyszczone PBMC w 20 mililitrach PBS i policzyć je za pomocą hemacytometru zgodnie ze standardową metodą. Aby wzbogacić monocyty CD14 +, przenieś 1 x 10 do siódmych PBMC do odpowiedniej probówki z polistyrenu okrągłodennego i osadzaj komórki w 300 x g przez pięć minut.Po odrzuceniu supernatantu i ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w buforze do separacji komórek, inkubować komórki z 10 mikrolitrami koktajlu przeciwciał na 100 mikrolitrów pod pokrywką przez 10 minut. Pod koniec inkubacji dodać 10 mikrolitrów kulek nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów i inkubować przez trzy minuty pod pokrywką. Uzupełnij objętość do 2,5 mililitra za pomocą bufora do separacji komórek.Umieść probówkę w magnesie i inkubuj przez trzy minuty bez pokrywki. Teraz odrzuć populację komórek ujemnych jednym ciągłym ruchem przez odwrócenie, gdy rurka jest nadal w magnesie. Wyjmij rurkę z magnesu, umyj wzbogacone monocyty CD14 + przyczepione do kulek magnetycznych poprzez ponowne zawieszenie ich w 2,5 mililitra buforu zawiesiny komórek i umieść rurkę z powrotem w magnesie.Policz izolowane komórki, jak pokazano wcześniej. Odwirować zebrane komórki przy 300 x g przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki w ilości 1 miliona komórek na mililitr w kompletnym minimalnym podstawowym podłożu alfa z 10% FBS.Aby zróżnicować osteoklast, dodaj M-CSF w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mililitr do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszaj, pipetując, aby homogenizować zawiesinę komórkową. Płytka 100 mikrolitrów zawiesiny na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Następnie dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej na studzienkę wokół posianych komórek, aby zapobiec parowaniu podłoża i efektom krawędzi w systemie hodowli.Inkubuj komórki przez noc przez około 18 do 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Przygotuj świeże podłoża z dodatkiem M-CSF i liganda RANK. Po inkubacji ostrożnie usunąć połowę pożywki przez aspirację za pomocą pipety P200 i zastąpić ją świeżą, ciepłą, kompletną pożywką uzupełnioną M-CSF i ligandem RANK w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mililitr.Różnicuj komórki w osteoklasty przez siedem do 14 dni z całkowitą wymianą pożywki co trzy dni. Po usunięciu pożywki utrwalić zróżnicowane przylegające osteoklasty za pomocą 100 mikrolitrów na studzienkę przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubować przez jedną minutę. Nie dotykaj dna studzienek, aby uniknąć zarysowania przylegających komórek.Po trzykrotnym umyciu studzienek 300 mikrolitrami sterylnej wody destylowanej, wystukaj płytki do sucha i dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwiącego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Po inkubacji usunąć roztwór barwiący przez odwrócenie i umyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami na studzienkę wody destylowanej.Usuń nadmiar wody, stukając talerzami o ręczniki papierowe, a następnie pozostaw talerze otwarte i chronione przed światłem do wyschnięcia na powietrzu. Korzystając z mikroskopu jasnego pola z opcją kafelków, wykonuj zdjęcia z powiększeniem 10x lub 20x, aby uchwycić całą powierzchnię studni. Ręcznie policz osteoklasty zidentyfikowane jako TRAP + fioletowe barwione komórki z więcej niż trzema jądrami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu z wtyczką licznika komórek.Płytka 100 mikrolitrów izolowanych monocytów CD14 + na studzienkę w 18-dołkowym szkiełku komorze o gęstości komórek 1 x 10 do piątej komórki na studzienkę. Różnicować osteoklasty w obecności liganda M-CSF i RANK, jak wykazano wcześniej, z całkowitą zmianą pożywki co trzy dni. W końcowym punkcie czasowym delikatnie usuń pożywkę i umyj każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego PBS o pH 7,4.Nie pozwól, aby studzienki wyschły między stopniami. Utrwalić próbkę za pomocą 100 mikrolitrów na studzienkę 4% roztworu formaldehydu w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym wstrząsaniem. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę.Przeniknąć komórki 100 mikrolitrami na studzienkę 0,1% roztworu Triton x-100 rozcieńczonego w PBS i inkubować przez 10 minut, jak pokazano wcześniej. Umyć dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie i zwiększyć sygnał, dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego wykonanego z 2% albuminy surowicy bydlęcej i roztworu PBS.Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, delikatnie wstrząsając. Po usunięciu roztworu blokującego dodaj 100 mikrolitrów fluorescencyjnie sprzężonego roztworu falloidyny rozcieńczonego w 2% roztworze BSA/PBS do każdej studzienki. Umyć dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę.Wybarwić jądra roztworem PBS zawierającym 300 nanomolowych DAPI w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Po 10 do 15 minutach usuń roztwór DAPI i zastąp go PBS o pojemności 100 mikrolitrów na studzienkę. Wizualizację barwienia za pomocą odpowiednich mikroskopów immunofluorescencyjnych lub konfokalnych przy powiększeniu od czterech do 40x.Dojrzałe osteoklasty definiuje się jako TRAP + wiele komórek jądrowych. Dodanie liganda RANK spowodowało wzrost liczby dużych wielojądrowych osteoklastów TRAP+ w sposób zależny od dawki. Kinetykę różnicowania osteoklastów od monocytów badano w okresie hodowli trwającym od dwóch do 14 dni.Wielojądrzaste osteoklasty były widoczne od piątego dnia, a optymalne różnicowanie osiągnięto w siódmym dniu. Różnicowanie osteoklastów na powierzchniach zmineralizowanych pozwala ocenić ich aktywność resorpcyjną poprzez analizę powstawania okrągłych otworów lub dołów resorpcyjnych. Procent resorpcji znacznie wzrasta w obecności M-CSF i liganda RANK w porównaniu z samym M-CSF.Co więcej, leczenie rotenonem w zależności od dawki hamowało resorpcję zmineralizowanej powierzchni w porównaniu z nieleczoną studnią kontrolną. Zależne od rotenonu hamowanie resorpcji osteoklastów było związane z hamowaniem produkcji ATP. W obecności rotenonu zaobserwowano fragmentację pierścienia aktynowego pochodzącego z ligandu RANK dojrzałego OCS.Ważne jest, aby upewnić się, że wzbogacone monocyty nie zawierają płytek krwi, że komórki są posiane w odpowiedniej gęstości i że otaczające studzienki są wypełnione wodą, aby uniknąć efektu krawędzi. Protokół ten jest szczególnie przydatny do mechanicznego badania, w jaki sposób powstają osteoklasty i co wpływa na ich funkcjonalność zarówno w naukach podstawowych, jak i translacyjnych. Na przykład za pomocą związków lub białek, które mogą modulować te procesy.

differentiation-functional-osteoclasts-from-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Aplikacja egzosomów to nowe narzędzie do opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. Ustanawiamy protokół izolacji egzosomów o wysokiej czystości, aby wyizolować egzosomy z nowo zidentyfikowanych komórek macierzystych zwanych CB-SC do badań mechanistycznych. Zajmujemy się również wspólną hodowlą egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami, co prowadzi do ich różnicowania w fenotypowo odrębne makrofagi.

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

Tutaj prezentujemy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnego przylegania.<br...

Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ krwi obwodowej przy użyciu M-CSF i ligandu RANK. Protokół umożliwia generowanie aktywnych komórek w ciągu tygodnia do badań biologii kostnej.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14⁺ ludzkiej krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów