Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14⁺ ludzkiej krwi obwodowej

0. Nasz protokół opisuje zoptymalizowaną i powtarzalną metodę generowania osteoklastów in vitro, która może być wykorzystana do zbadania mechanizmów leżących u podstaw procesu różnicowania i funkcjonalności. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do generowania dużej liczby funkcjonalnie aktywnych osteoklastów w ciągu zaledwie tygodnia. Wysoką wydajność różnicowania uzyskuje się dzięki zastosowaniu oczyszczonych monocytów i dodaniu cytokin na czas.

Osteoklasty są odpowiedzialne za niszczenie kości we wszystkich formach zapalenia stawów, a ta metoda zapewnia narzędzia do badań przesiewowych nowych związków terapeutycznych, które mogą modulować ich różnicowanie i/lub funkcje. Procedurę zademonstruje Patricia Riedlova, doktorantka z naszego laboratorium. Na początek wyizoluj PBMC, przenosząc krew do nowej 50-mililitrowej probówki.

Rozcieńczyć go sterylnym PBS w równej objętości dla świeżej krwi lub w stosunku 1:3 dla czopków leukocytów i kożuchówki. Delikatnie wymieszaj krew przez odwrócenie. Przygotuj 15-mililitrowe probówki zawierające trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości i powoli ułóż od ośmiu do 10 mililitrów rozcieńczonej krwi na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości, unikając mieszania.

Wirować probówkę o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca. Następnie ostrożnie wyrzuć wierzchnią warstwę za pomocą pipety Pasteura. Zbierz znajdującą się pod spodem warstwę międzyfazową zawierającą PBMC i przenieś tę warstwę do nowej 50-mililitrowej rurki.

Zawiesić komórki do 50 mililitrów sterylnym PBS i zmyć pożywkę o gradiencie gęstości resztkowej, wirując przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z pełnym hamulcem. Aby usunąć resztki płytek krwi, powtórzyć proces wirowania zgodnie z opisem w manuskrypcie, ponownie zawiesić wyizolowane i oczyszczone PBMC w 20 mililitrach PBS i policzyć je za pomocą hemacytometru zgodnie ze standardową metodą. Aby wzbogacić monocyty CD14 +, przenieś 1 x 10 do siódmych PBMC do odpowiedniej probówki z polistyrenu okrągłodennego i osadzaj komórki w 300 x g przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu i ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w buforze do separacji komórek, inkubować komórki z 10 mikrolitrami koktajlu przeciwciał na 100 mikrolitrów pod pokrywką przez 10 minut. Pod koniec inkubacji dodać 10 mikrolitrów kulek nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów i inkubować przez trzy minuty pod pokrywką. Uzupełnij objętość do 2,5 mililitra za pomocą bufora do separacji komórek.

Umieść probówkę w magnesie i inkubuj przez trzy minuty bez pokrywki. Teraz odrzuć populację komórek ujemnych jednym ciągłym ruchem przez odwrócenie, gdy rurka jest nadal w magnesie. Wyjmij rurkę z magnesu, umyj wzbogacone monocyty CD14 + przyczepione do kulek magnetycznych poprzez ponowne zawieszenie ich w 2,5 mililitra buforu zawiesiny komórek i umieść rurkę z powrotem w magnesie.

Policz izolowane komórki, jak pokazano wcześniej. Odwirować zebrane komórki przy 300 x g przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki w ilości 1 miliona komórek na mililitr w kompletnym minimalnym podstawowym podłożu alfa z 10% FBS.

Aby zróżnicować osteoklast, dodaj M-CSF w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mililitr do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszaj, pipetując, aby homogenizować zawiesinę komórkową. Płytka 100 mikrolitrów zawiesiny na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Następnie dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej na studzienkę wokół posianych komórek, aby zapobiec parowaniu podłoża i efektom krawędzi w systemie hodowli.

Inkubuj komórki przez noc przez około 18 do 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Przygotuj świeże podłoża z dodatkiem M-CSF i liganda RANK. Po inkubacji ostrożnie usunąć połowę pożywki przez aspirację za pomocą pipety P200 i zastąpić ją świeżą, ciepłą, kompletną pożywką uzupełnioną M-CSF i ligandem RANK w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mililitr.

Różnicuj komórki w osteoklasty przez siedem do 14 dni z całkowitą wymianą pożywki co trzy dni. Po usunięciu pożywki utrwalić zróżnicowane przylegające osteoklasty za pomocą 100 mikrolitrów na studzienkę przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubować przez jedną minutę. Nie dotykaj dna studzienek, aby uniknąć zarysowania przylegających komórek.

Po trzykrotnym umyciu studzienek 300 mikrolitrami sterylnej wody destylowanej, wystukaj płytki do sucha i dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwiącego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 20 minut. Po inkubacji usunąć roztwór barwiący przez odwrócenie i umyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami na studzienkę wody destylowanej.

Usuń nadmiar wody, stukając talerzami o ręczniki papierowe, a następnie pozostaw talerze otwarte i chronione przed światłem do wyschnięcia na powietrzu. Korzystając z mikroskopu jasnego pola z opcją kafelków, wykonuj zdjęcia z powiększeniem 10x lub 20x, aby uchwycić całą powierzchnię studni. Ręcznie policz osteoklasty zidentyfikowane jako TRAP + fioletowe barwione komórki z więcej niż trzema jądrami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu z wtyczką licznika komórek.

Płytka 100 mikrolitrów izolowanych monocytów CD14 + na studzienkę w 18-dołkowym szkiełku komorze o gęstości komórek 1 x 10 do piątej komórki na studzienkę. Różnicować osteoklasty w obecności liganda M-CSF i RANK, jak wykazano wcześniej, z całkowitą zmianą pożywki co trzy dni. W końcowym punkcie czasowym delikatnie usuń pożywkę i umyj każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego PBS o pH 7,4.

Nie pozwól, aby studzienki wyschły między stopniami. Utrwalić próbkę za pomocą 100 mikrolitrów na studzienkę 4% roztworu formaldehydu w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym wstrząsaniem. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę.

Przeniknąć komórki 100 mikrolitrami na studzienkę 0,1% roztworu Triton x-100 rozcieńczonego w PBS i inkubować przez 10 minut, jak pokazano wcześniej. Umyć dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie i zwiększyć sygnał, dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego wykonanego z 2% albuminy surowicy bydlęcej i roztworu PBS.

Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, delikatnie wstrząsając. Po usunięciu roztworu blokującego dodaj 100 mikrolitrów fluorescencyjnie sprzężonego roztworu falloidyny rozcieńczonego w 2% roztworze BSA/PBS do każdej studzienki. Umyć dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS na studzienkę.

Wybarwić jądra roztworem PBS zawierającym 300 nanomolowych DAPI w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Po 10 do 15 minutach usuń roztwór DAPI i zastąp go PBS o pojemności 100 mikrolitrów na studzienkę. Wizualizację barwienia za pomocą odpowiednich mikroskopów immunofluorescencyjnych lub konfokalnych przy powiększeniu od czterech do 40x.

Dojrzałe osteoklasty definiuje się jako TRAP + wiele komórek jądrowych. Dodanie liganda RANK spowodowało wzrost liczby dużych wielojądrowych osteoklastów TRAP+ w sposób zależny od dawki. Kinetykę różnicowania osteoklastów od monocytów badano w okresie hodowli trwającym od dwóch do 14 dni.

Wielojądrzaste osteoklasty były widoczne od piątego dnia, a optymalne różnicowanie osiągnięto w siódmym dniu. Różnicowanie osteoklastów na powierzchniach zmineralizowanych pozwala ocenić ich aktywność resorpcyjną poprzez analizę powstawania okrągłych otworów lub dołów resorpcyjnych. Procent resorpcji znacznie wzrasta w obecności M-CSF i liganda RANK w porównaniu z samym M-CSF.

Co więcej, leczenie rotenonem w zależności od dawki hamowało resorpcję zmineralizowanej powierzchni w porównaniu z nieleczoną studnią kontrolną. Zależne od rotenonu hamowanie resorpcji osteoklastów było związane z hamowaniem produkcji ATP. W obecności rotenonu zaobserwowano fragmentację pierścienia aktynowego pochodzącego z ligandu RANK dojrzałego OCS.

Ważne jest, aby upewnić się, że wzbogacone monocyty nie zawierają płytek krwi, że komórki są posiane w odpowiedniej gęstości i że otaczające studzienki są wypełnione wodą, aby uniknąć efektu krawędzi. Protokół ten jest szczególnie przydatny do mechanicznego badania, w jaki sposób powstają osteoklasty i co wpływa na ich funkcjonalność zarówno w naukach podstawowych, jak i translacyjnych. Na przykład za pomocą związków lub białek, które mogą modulować te procesy.