Analiza i obrazowanie osteocytów

Postuluje się, że naprężenie ścinające przepływ płynu jest mechanostymulatorem osteocytów. Ponieważ pomiar bezpośredni nie jest opcją, modele osteocytów pochodzące z obrazu konfokalnego są cennym narzędziem do przeprowadzania analizy obliczeniowej dynamiki płynów w celu oceny naprężeń samych przepływu płynów na błonach dendrytycznych osteocytów. Niektóre z prac wykonanych w naszym laboratorium odpowiadają najnowszym osiągnięciom w dziedzinie, w której rzeczywista morfologia luk osteocytów, w tym krętość i gęstość dendrytów, są wykorzystywane wraz z siecią kostną i lacunarno-kanałową w celu numerycznego określenia naprężenia ścinającego przepływu płynu i lokalizacji w strukturze dendrytycznej osteocytów, w których naprężenie jest wysokie.

Obecne technologie obejmują różne modelowania obliczeniowe, takie jak analiza elementów końcowych, obliczeniowa dynamika płynów, interakcja ze strukturą płynu, modelowanie oparte na obrazie, w tym mikroskop rentgenowski lub konfokalny w celu uzyskania dokładnych modeli 3D oraz systemy testowania mechanicznego w celu walidacji modeli poprzez pomiar reakcji kości, takich jak odkształcenia w warunkach obciążenia kontrolnego. Nasze odkrycia wskazują, że utrata dendrytów spowodowana starzeniem się lub chorobą kości jest czynnikiem, który powoduje, że kości stają się mniej wrażliwe na aktywność fizyczną. Przewidywaliśmy, że osteocyty wykrywają obciążenia mechaniczne poprzez obszary naprężeń ścinających o wysokim przepływie płynu, które są dendrytami.

Naprężenie ścinające przepływu płynu jest skorelowane z morfologią lakunarną, zwłaszcza z powierzchnią. Wraz z ustanowieniem tego protokołu, pracujemy obecnie nad projektem NIH mającym na celu zbadanie naprężeń ścinających przepływ płynu w dendrytach osteocytów kości myszy w różnym wieku i płci. Badanie to pomoże określić, w jaki sposób starzenie się i różnice płci wpływają na transdukcję mechano w kości pod wpływem obciążenia.

Na początek utrwal kość udową pobraną od myszy w zimnym 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc. Następnego dnia opłucz kość i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i szybko zanurz ją w szybko polimeryzującym akrylu. Wytnij grube poprzeczne plastry o grubości 300 mikrometrów nad trzecim krętarzem.

Za pomocą papieru ściernego wypoleruj skrawki kości do ostatecznej grubości od 90 do 100 mikrometrów. Następnie płucz wypolerowane sekcje w 70%95% i 100% etanolu przez pięć minut każda. Zabarwić skrawki w 1% w 100% etanolu przez cztery godziny w ciemności z umiarkowanym potrząsaniem.

Następnie dokładnie umyj sekcje w 100% etanolu. I wysusz je na powietrzu przez noc przed umieszczeniem ich w kropli nośnika montażowego na szklanym szkiełku. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na próbce.

Na mikroskopie konfokalnym ustaw laser o długości 488 nm do wzbudzenia i okno zbierania emisji od 496 do 596 nanometrów. Najpierw uchwyć obraz o niskiej mocy całego przekroju kości za pomocą obiektywu 5x. Następnie zrób zdjęcia trzech obszarów zainteresowania za pomocą obiektywu 20x.

Użyj obiektywu olejowego z aperturą numeryczną 100x, zoomem cyfrowym 1,7 i krokiem 0,126 mikrometra, aby zebrać szczegółowe stosy Z składające się z 400 płaszczyzn Z o rozdzielczości 1024 na 1024 piksele i rozdzielczości 0,089 mikrometra. Aby modelować komputerowo osteocyty myszy, otwórz oprogramowanie ImageJ po zaimportowaniu zebranych obrazów stosu Z kości udowej myszy w formacie TIFF, dostosuj próg w menu sekcji, aby zmienić limity intensywności pikseli do włączenia do maski. Korzystając z operacji maski uprawy, przytnij jedną lukę wraz z kanalikami jako obszarem zainteresowania.

Zamknij lukę w wyimaginowanym większym sześcianie o długości boków 21, 14 i 19 mikrometrów. Wykonaj operację powiększania regionu, aby wybrać połączone regiony pikseli w celu wygenerowania jednolitej sieci lacunarno-kanalikularnej lub LCN. Następnie, korzystając z operacji na części obliczeniowej, przekształć maskę lacunarno-kanalikową w obiekt.

Zmniejsz objętość LCN za pomocą operacji wygładzania w celu budowy osteocytów i błon dendrytycznych. Następnie wyeksportuj obiekty. Połącz dwie powierzchnie LCN i błon dendrytycznych osteocytów w jedną powierzchnię.

Teraz użyj operacji remesh, aby utworzyć model wolumetryczny przestrzeni kanałowej lacunar. Wyeksportuj model jako plik STL i dostosuj skalę obiektu do mikrometrów. W oprogramowaniu do przetwarzania obrazów trójwymiarowych wybierz model wolumetryczny mysiej przestrzeni lacunarno-kanalicznej jako model podstawowy, aby zbudować odrębne modele osteocytów.

Wybierz niższy próg, aby zmniejszyć natężenie światła na obrazie i uzyskać lukę z mniejszą liczbą kanalików. Następnie opracuj modele osteocytów o różnych grubościach przestrzeni lacunarno-kanałowej lub średnicach kanałów dendrytowych. Buduj większe lub mniejsze modele osteocytów, używając odpowiednio operacji owijania lub wygładzania.

Aby utworzyć przepływ płynu w oprogramowaniu symulacyjnym, należy zaimportować opracowane geometrie oparte na obrazie konfokalnym do oprogramowania CFX. Ustaw wymiary jednostki na nanometry. Następnie kliknij odejmij, aby uzyskać pojedynczą przestrzeń kanikularną lakunarną.

Kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowaną fasetkę i przekonwertuj ją z fasetek na domenę bryły bez scalania powierzchni. Kliknij na siatkę i wybierz liniowe elementy czworościenne o rozmiarze elementu 0,06 mikrometra. Udoskonalić siatkę za pomocą badania zbieżności siatki.

Teraz wybierz powierzchnię i wybierz kanaliki na górnej stronie wyimaginowanego sześcianu jako wloty płynu. Korzystając z pudełka, wybierz kanaliki na pozostałych pięciu ścianach jako wyloty płynu. Następnie wyeksportuj siatkę.

Po utworzeniu kolejnego przepływu płynu zaimportuj płynną siatkę do sekcji ustawień programu CFX. Korzystając z opcji wstawienia obwiedni, zdefiniuj dwa warunki brzegowe wlotów i wylotów dla ścian. Wywieraj ciśnienie wlotowe płynu 300 i zero paskali odpowiednio na wlotach i wylotach.

Pozostałe powierzchnie należy traktować jako ściany o stanie antypoślizgowym. Z biblioteki materiałów traktuj śródmiąższowy płyn laminarny jako wodę. Ustaw sekcje wymiany ciepła, spalania i promieniowania cieplnego na brak.

Wybierz turbulencję jako charakterystykę płynu w LCN. Następnie uruchom oprogramowanie przy użyciu podwójnej precyzji i bezpośredniego startu jako typu przesyłania. Wstaw nowy kontur w sekcji wyników oprogramowania CFD.

Utwórz naprężenie ścinające przepływu płynu lub kontur FFSS, wybierając ścinanie ścian błon dendrytycznych osteocytów jako zmienną w domenie. Następnie wstaw kontur opływowy prędkości wewnątrz domeny lacunarno-kanalikowanej, zaczynając od wlotów. Średni FFSS na osteocytach i błonach dendrytycznych w modelu młodych osteocytów wynosił 0,42 Pascal, który był znacznie wyższy niż 0,13 Pascala w modelu starzejących się osteocytów.

FFSS zwiększył się w osteocytach z większą przestrzenią kanalików lakunarnych, jak widać w modelu siódmym i modelu ósmym, w którym model ósmy wykazywał najwyższy FFSS. Najniższe wartości FFSS wynoszące 0,19 Pascala i 0,13 Pascala zaobserwowano odpowiednio w modelu drugim i czwartym o najniższej gęstości kanałów. Nie zaobserwowano znaczącej zmiany w FFSS przy zwiększonej średnicy dendrytu, jak obserwowano w modelach piątym i szóstym.