Name: Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj test sedymentacyjny z konkanawaliną A do pomiaru wiązania substratów przez fosfatazy glukanu. Ta metoda pozwala wykrywać słabe interakcje białko-węglowodanowe w zakresie milimolarnym i charakteryzować mutanty SEX4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez nagrodę National Science Foundation MCB-2012074. Autorzy dziękują dr Craigowi W. Vander Kooi z Wydziału Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Florydy za cenne dyskusje i wsparcie. Autorzy dziękują również dr Matthew S. Gentry'emu z Wydziału Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Florydy za jego wsparcie. Chcielibyśmy podziękować dr Sarze Lagalwar, przewodniczącej programu Skidmore College Neuroscience, za umożliwienie nam użycia skanera C-digit blot LICOR do obrazowania western blot.

1. Przygotowanie kulek ConA-Sepharose
<ol>
	<li>Przygotować 250 mL buforu wiążącego zawierającego 67 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl2 oraz 0,2 mM CaCl2. pH skorygować za pomocą 1 M roztworu NaOH.</li>
	<li>Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL pipetować 250 μL zawiesiny kulek ConA-Sepharose. Wirować zawartość z prędkością 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz. 
	UWAGA: Dla każdego stężenia amylopektyny użytego w analizie wymagane jest 250 µL kulek ConA-Sepharose w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Do każdej probówki zawierającej 250 µL kulek ConA-Sepharose dodać 750 µL buforu wiążącego. Wirować probówki z prędkością 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz. Powtórzyć ten krok 2 razy, aby upewnić się, że kulki zostały odpowiednio wypłukane i zrównoważone z buforem wiążącym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów amylopektyny
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór stokowy amylopektyny ziemniaczanej o stężeniu 10 mg/mL. Amylopektyna jest nierozpuszczalna w wodzie i można ją rozpuścić za pomocą ciepła. Aby ją rozpuścić, dodaj 0,1 g amylopektyny ziemniaczanej do 10 mL wody destylowanej. Podgrzewaj zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 80 °C przez 1 h lub do momentu, aż roztwór przestanie być mętny.</li>
	<li>Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT), powtarzając mieszanie w wortexie, aby uniknąć tworzenia się grudek.</li>
	<li>Alternatywną metodą rozpuszczania podłoży amylopektynowych jest traktowanie alkoholowo-alkaliczne. Aby rozpuścić substrat tą metodą, wykonaj poniższe kroki.
	<ol>
		<li>Zawieś 0,5 g podłoża amylopektynowego w 5 mL 20% etanolu i 5 mL 2 M NaOH. Intensywnie mieszaj zawartość przez 15-20 min w RT.</li>
		<li>Następnie dodaj 10 mL wody i skoryguj pH roztworu do 6,5, dodając 2 M HCl. Uzupełnij objętość otrzymanego roztworu do 50 mL wodą destylowaną, aby przygotować roztwór amylopektyny o stężeniu 10 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór rozpuszczonej amylopektyny o stężeniu 10 mg/mL, aby przygotować serię 2 mL rozcieńczonych roztworów amylopektyny. Przykładowo, wykonaj rozcieńczenia dwukrotne stężenia 10 mg/mL, aby przygotować serię stężeń amylopektyny (5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL, 0,3125 mg/mL, 0,156 mg/mL, 0,078 mg/mL, 0,039 mg/mL, 0,019 mg/mL oraz 0 mg/mL).</li>
</ol>
3. Przygotowanie ConA-Sepharose: paciorki amylopektynowe
<ol>
	<li>Do probówek mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierających 250 µL kulek ConA-Sepharose uprzednio równoważonych w buforze wiążącym, dodać 250 µL każdego z rozcieńczonych roztworów amylopektyny. Dobrze wymieszać zawartość. Oznaczyć probówki odpowiednim stężeniem amylopektyny.</li>
	<li>Inkubować zawartość na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Po 20 minutach nie obserwuje się już zmian w kompleksie ConA-Sepharose:amylopektyna. Czas inkubacji 30 min wybrano poprzez testowanie czasu inkubacji od 10 min do 1 h, aby zapewnić osiągnięcie stanu równowagi.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 10,000 x g przez 1 min. Zebrać nadsącz do nowo oznaczonej probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Przechowywać te frakcje nadsączu do przeprowadzenia oznaczenia D-glukozy12 (hydroliza kwasowa amylopektyny, a następnie oznaczenie glukozy metodą UV via test enzymatyczny). Krok ten jest niezbędny, aby upewnić się, że cała amylopektyna związała się z kulkami.</li>
	<li>Do kulek ConA-Sepharose:amylopektyna dodać 750 µL buforu wiążącego. Wirować probówki z prędkością 10,000 x g przez 1 min. Odlać nadsącz, aby usunąć wszelkie niezwiązane cząsteczki amylopektyny.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.4, aby zapewnić wystarczające przemycie. Każda probówka zawiera teraz kulki ConA-Sepharose związane z różnymi ilościami substratów amylopektyny.</li>
</ol>
4. Inkubacja SEX4 z koralikami ConA-Sepharose:amylopektyna
<ol>
	<li>Wymieszać 250 µL kulek ConA-Sepharose:amylopektyna z 100 µL buforu wiążącego zawierającego 10 µg białka SEX4, 10 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 10 µM koktajlu inhibitorów proteaz (PIC). Należy pamiętać, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 350 µL. 
	UWAGA: Koktajl inhibitorów proteaz dodaje się jako środek ostrożności, aby uniknąć niepotrzebnej degradacji białka SEX4. Jest to krok opcjonalny. W tym teście zastosowano rekombinowane białko Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4). Oczyszczone białko posiada N-terminalny znacznik histydynowy, niezbędny do detekcji białka via chemiluminescencja. Szczegółowe informacje na temat oczyszczania fosfatazy glukanu opisano w poprzednich publikacjach14,20,24.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę białka i kulek ConA-Sepharose:amylopektyna w temperaturze 4 °C przez 45 min przy łagodnym obracaniu. 
	UWAGA: Czas inkubacji wynoszący 45 min wybrano, aby zapewnić osiągnięcie stanu równowagi dla kompleksu.</li>
	<li>Wirować probówki przy 10 000 x g przez 1 min. Ostrożnie odpipetować 50 µL supernatantu za pomocą końcówki do nakładania żelu do nowej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki zawierającej 50 µL zebranych frakcji supernatantu dodać 20 µL barwnika do SDS-PAGE 4x oraz 10 µL wody. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 min. Przechowywać te próbki do przeprowadzenia elektroforezy SDS-PAGE. Upewnić się, że 10 nowych probówek oznaczonych jako „supernatant (S)” posiada odpowiadające im stężenia substratu.</li>
	<li>Dodać 750 µL buforu wiążącego do kulek ConA-Sepharose:amylopektyna:SEX4, aby usunąć z kulek wszelkie niezwiązane białka. Wirować probówki przy 10 000 x g przez 1 min. Powtórzyć ten krok jeszcze raz, aby zapewnić dokładne przemycie. Odrzucić supernatantu.</li>
	<li>Dodać 20 µL barwnika do SDS-PAGE 4x i 80 µL wody destylowanej do probówek zawierających przemyte kulki ConA-Sepharose:amylopektyna:SEX4. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 min i wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odrzucić osad i zachować supernatantu do przeprowadzenia elektroforezy SDS-PAGE. Odpipetować 80 µL supernatantu do nowych probówek i oznaczyć je jako „pellet (P)”.</li>
</ol>
5. Przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE
<ol>
	<li>Nanieś 40 µL próbek białek nie związanych (przygotowanych w kroku 2.3, oznaczonych jako S) do studzienek gotowego żelu poliakrylamidowego 4%-12%, zaczynając od najniższego do najwyższego stężenia substratu, pozostawiając pierwszą ścieżkę wolną na marker masy cząsteczkowej białek. Użyj drugiego żelu do naniesienia 10 próbek białek związanych przygotowanych w kroku 2.5 (oznaczonych jako P).</li>
	<li>Do obu komór aparatury wlej świeżo przygotowany 1x bufor do elektroforezy SDS-PAGE. Prowadź elektroforezę przy napięciu 150 V przez 35 min lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
	<li>Wyjmij żel z aparatury, a następnie usuń dystanse i płytki szklane. Oddzielony żel wykorzystaj do analizy western blot.</li>
</ol>
6. Western blotting z detekcją chemiluminescencyjną14,15
UWAGA: Metodę tę można łatwo zmodyfikować lub dostosować w zależności od sprzętu do western blossomingu dostępnego w laboratorium.
<ol>
	<li>Przygotować 1 L buforu do transferu zawierającego 5,8 g Tris base, 2,9 g glicyny, 0,37 g SDS oraz 200 mL metanolu.</li>
	<li>Przenieść rozdzielone według wielkości białka z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową. Złożyć gąbki, papierki filtracyjne, żel i membranę nitrocelulozową zgodnie z protokołem transferu western14,15. Prowadzić proces przy napięciu 70 V przez 1 h.</li>
	<li>Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek, inkubować membranę nitrocelulozową z roztworem białka zawierającym 1%-5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) lub białek mleka w 50 mL buforu TBST (20 mM Tris [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) przez 1 h. Przemyć membranę 3x buforem TBST, aby usunąć niezwiązanąt rozwiązanie blokujące.</li>
	<li>Inkubować membranę z przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP), specyficznym dla białek z tagiem His, przez 1 h. Przemyć membranę 3x w buforze TBST, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. W celu uzyskania optymalnej powtarzalności i czułości zastosować rozcieńczenie przeciwciała w buforze TBST w stosunku 1:2 000.</li>
	<li>Przeciwciało sprzężone z enzymem HRP wiąże się specyficznie z tagiem histydynowym białka SEX4, co daje prążek w obecności reagentów chemiluminescencyjnych. Do obrazowania cyfrowego przygotować w probówce 1,5 mL roztwór składający się z równych części roztworów substratów chemiluminescencyjnych (po 750 µL każdego). Inkubować membranę w roztworze przez co najmniej 5 min.</li>
	<li>Położyć membranę stroną z białkami do dołu na skanerze do blotów i uruchomić oprogramowanie do akwizycji w celu ilościowego oznaczenia białek w frakcjach osadu i nadsączu.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeprowadź ilościowe pomiary sygnału za pomocą oprogramowania akwizycyjnego i skanera do blotów. Znormalizuj wszystkie pomiary ilościowe w frakcjach nadsączu i osadu do całkowitej ilości naniesionego białka. 
	UWAGA: Oprogramowanie umożliwia ilościowe określenie intensywności każdego prążka białkowego w frakcjach nadsączu i osadu.</li>
	<li>W eksperymencie wiązania nasycającego wykreśl procent białka związanego w funkcji stężenia amylopektyny. Dopasuj dane do równania Y = Bmax x X/(KD + X), wykorzystując oprogramowanie do analizy danych w celu obliczenia KD. 
	​UWAGA: Bmax to maksymalne wiązanie specyficzne, oś Y przedstawia procent związanego białka, a oś X stężenie amylopektyny.</li>
</ol>
<img alt="Schemat przygotowania próbek: wiązanie amylopektyny, wirowanie; konfiguracja SDS-PAGE i transferu Western." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64700/64700fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd schematu analizy sedymentacji z użyciem ConA-Sepharose. (A) Przygotowanie kulek ConA-Sepharose. (B) Inkubacja z podłożem amylopektynowym. (C) Inkubacja z białkiem SEX4. (D) Rozdzielenie frakcji białek związanych i niezwiązanych poprzez wirowanie. (E) Rozdzielenie białek za pomocą SDS-PAGE. (F) Analiza Western-blot. (G) Detekcja chemiluminescencyjna białka SEX4 z tagiem His. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64700/64700fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li>
<li>Gentry, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+laforin+crosses+evolutionary+boundaries+and+links+carbohydrate+metabolism+to+neuronal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).</li>
<li>Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laforin%2C+a+dual+specificity+phosphatase+that+dephosphorylates+complex+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).</li>
<li>Gentry, M. S., Pace, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+glucan+phosphatase+laforin+is+linked+to+rates+of+molecular+evolution+and+the+glucan+metabolism+of+the+organism%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism.</a> BMC Evolutionary Biology. 9, 138(2009).</li>
<li>Niittyla, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+protein+phosphatases+control+starch+metabolism+in+plants+and+glycogen+metabolism+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).</li>
<li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STARCH-EXCESS4+is+a+laforin-like+Phosphoglucan+phosphatase+required+for+starch+degradation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).</li>
<li>Comparot-Moss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+phosphatase%2C+LSF1%2C+is+required+for+normal+starch+turnover+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves.</a> Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).</li>
<li>Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+starch-accumulating+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+deficient+in+a+chloroplastic+starch-hydrolysing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).</li>
<li>Kotting, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+enzyme+required+for+starch+metabolism+in+Arabidopsis+leaves.+The+phosphoglucan%2C+water+dikinase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase.</a> Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).</li>
<li>Tagliabracci, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laforin+is+a+glycogen+phosphatase%2C+deficiency+of+which+leads+to+elevated+phosphorylation+of+glycogen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).</li>
<li>Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lafora+disease+offers+a+unique+window+into+neuronal+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).</li>
<li>Brewer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+pathogenic+lafora+bodies+in+lafora+disease+using+an+antibody-enzyme+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).</li>
<li>Santelia, D., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Arabidopsis+starch+research+and+potential+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).</li>
<li>Raththagala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+laforin+function+in+glycogen+dephosphorylation+and+lafora+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease.</a> Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglucan-bound+structure+of+starch+phosphatase+Starch+Excess4+reveals+the+mechanism+for+C6+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).</li>
<li>Vander Kooi, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glucan+phosphatase+activity+of+Starch+Excess4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Arabidopsis+glucan+phosphatase+like+sex+four2+reveals+a+unique+mechanism+for+starch+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation.</a> The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch%3A+A+flexible%2C+adaptable+carbon+store+coupled+to+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).</li>
<li>Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+in+rice+and+other+starches%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Foods+World%22%5BJournal%5D)">Phosphorus in rice and other starches.</a> Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).</li>
<li>Mak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+kinetics+of+the+glucan+phosphatase+starch+excess4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4.</a> Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).</li>
<li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+53%2C000-dalton+glycoprotein+from+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum.</a> The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).</li>
<li>Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+calsequestrin+from+canine+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+and+identification+of+the+53%2C000+dalton+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).</li>
<li>Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+fibroblast+interferon+to+concanavalin+A-agarose.+Involvement+of+carbohydrate+recognition+and+hydrophobic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction.</a> Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).</li>
<li>Meekins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+glucan+phosphatase+activity+against+polyglucan+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).</li>
<li>Wilkens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+%CE%B1-glucan+phosphatases+SEX4+and+LSF2+display+different+affinity+for+amylopectin+and+amylose%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose.</a> FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).</li>
<li>Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+glycobiology+in+the+age+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).</li>
<li>Doyle, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+binding+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badanie to wykazało pomyślne opracowanie nowego testu sedymentacji in vitro , który umożliwia określenie powinowactwa wiązania interakcji fosfatazy glukan-glukan. Projekt testu wykorzystuje specyficzne wiązanie lektyny ConA z glukanami poprzez reszty hydroksylowe glukozy w celu pośredniego wychwytywania rozpuszczonych substratów węglowodanowych na kulkach sefalozy. Pozwala to na oddzielenie związanych i niezwiązanych frakcji białkowych poprzez odwirowanie i określenie powinowactwa wiązania rozp...

Fosfatazy glukanu należą do funkcjonalnie zróżnicowanej podrodziny fosfataz o podwójnej specyficzności (DSP) w nadrodzinie białkowej fosfatazy tyrozynowej (PTP)1. Znaleziono je w większości form życia, w tym w bardzo rozbieżnych organizmach fotosyntetyzujących, ludziach, kręgowcach oraz niektórych bezkręgowcach i protistach2,3,4. Rośliny zawierają trzy znane fosfatazy glukanowe: Skrobia Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) i Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Rośliny, które nie mają fosfataz glukanowych, wykazują zmniejszone tempo przejściowej degradacji skrobi i akumulacji skrobi w liściach8,9. Laforyna jest członkiem-założycielem rodziny fosfatazy glukanowej, która defosforyluje glikogen u kręgowców i ludzi3,10. Mutacje laforyny prowadzą do neurodegeneracyjnej choroby Lafora, śmiertelnej autosomalnej recesywnej postaci padaczki11. Fosfatazy glukanu są niezbędne do metabolizmu glikogenu i skrobi i stały się ważnymi enzymami do modulowania zawartości skrobi w roślinach i leczenia neurodegeneracyjnej choroby Lafora12,13. Ostatnie badania krystalografii rentgenowskiej fosfataz glukanu z modelowymi substratami glukanu rzuciły światło na wiązanie substratu i katalityczny mechanizm defosforylacji glukanu14,15,16,17. Jednak obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób fosfatazy glukanu wiążą się ze swoimi fizjologicznymi substratami, jest niekompletna.
Skrobia to nierozpuszczalny polimer glukozy składający się z 80%-90% amylopektyny i 10%-20% amylozy18. Substratami fosfataz glukanu roślinnego są fosforylowane cząsteczki węglowodanów, takie jak glikogen i granulki skrobi. Fosforylowane reszty glukozylowe są obecne w stosunku 1:600 fosforan do reszty glukozylowej. Co ciekawe, fosforany są obecne tylko w cząsteczkach amylopektyny19. Główna roślinna fosfataza glukanowa SEX4 działa na granulki skrobi w celu defosforylacji cząsteczek amylopektyny. Rentgenowska struktura krystaliczna SEX4 w połączeniu z badaniami mutagenezy sterowanej strukturą wykazała unikalną specyficzność substratu SEX4 dla różnych pozycji w strukturze glukanu15. Niedawno wykazaliśmy, że biologicznie istotną aktywność SEX4 można zaobserwować tylko wtedy, gdy działa ona na jego rozpuszczone substraty amylopektyny20. Jednak zrozumienie interakcji glukan-SEX4 okazało się trudne ze względu na złożoność strukturalną substratu, szerszą specyfikę wiązania i niskie powinowactwo wiązania między białkiem a jego substratami. Problemy te utrudniły wykorzystanie metod powszechnie stosowanych w interakcjach białko-ligand, takich jak kalorymetria miareczkowania izotermicznego (ITC), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i testy oparte na testach immunoenzymatycznych (ELISA).
Ciekawe, większość naszej wiedzy na temat interakcji węglowodanów z białkami pochodzi z badania lektyn. Concanavalin A (ConA) to rodzina białek z rodziny lektyn roślin strączkowych, pierwotnie ekstrahowana z fasoli jack. ConA wiąże węglowodany o wysokiej specyficzności, co jest korzystne dla jego stosowania w zastosowaniach związanych z celowaniem i dostarczaniem leków. Wiązanie ConA z różnymi substratami zawierającymi nieredukujący α-D-mannozyl i α-D-glukozyl zostało szeroko zbadane19,20. Dostępne na rynku kulki sefarozy związane z ConA są powszechnie stosowane do oczyszczania glikoprotein i glikolipidów21. ConA wiąże się z tymi gluknami poprzez grupy hydroksylowe C3, C4 i C6 reszt glukozy. Kulki ConA-Sepharose zostały również z powodzeniem wykorzystane do pomiaru wiązania interakcji glikogen-białko i skrobia-białko22,23. W tym badaniu użyliśmy kulek ConA-Sepharose do opracowania testu wiązania w celu zmierzenia specyficzności wiązania interakcji fosfatazy-amylopektyny glukanu.
Poprzednio, test sedymentacji oparty na ConA był stosowany do oceny zdolności wiązania substratu fosfatazy glukanowej14,20,24. W tym badaniu ta sama strategia została wykorzystana do opracowania nowej metody określania powinowactwa wiązania fosfatazy glukan-glukan i interakcji węglowodanowych. Metoda ta ma również zaletę w badaniu różnych rozpuszczonych interakcji węglowodanowo-białkowych.

<table><tbody><tr><td>6x-His Tag przeciwciało monoklonalne (HIS. H8), zestaw do</td> elektroforezy żelowej i Western blot HRP <td>Therm Fisher Scientific</td><td>MA1-21315-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Biorad</td><td></td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208291</td><td></td></tr><tr><td>C-cyfrowy skaner plam</td><td>LICOR</td><td>3600-00</td><td>Skaner plam</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A-sefaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9017</td><td>Ten produkt zawiera&nbsp; w 0,1 M buforze octanowym o pH 6 zawierającym 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 1 mM MgCl2 w 20% etanolu&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism 8.0</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td>Wersja 8.0</td><td>Oprogramowanie do analizy danych&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8651</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>3600-501</td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28312</td><td></td></tr><tr><td>Amylopektyna ziemniaczana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele SDSPAGE</td><td>Genscript</td><td>M00653S</td><td></td></tr><tr><td>baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP1TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne premium Westernsure&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>&nbsp; 926-95000</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny a do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Fosfatazy glukanowe należą do większej rodziny fosfataz o podwójnej specyficzności (DSP), które defosforylują substraty glukanu, takie jak glikogen u zwierząt i skrobia u roślin. Struktury krystaliczne fosfatazy glukanowej z modelowymi substratami glukanu ujawniają wyraźne interfejsy wiążące glukan zbudowane z DSP i domen wiążących węglowodany. Jednak ilościowe pomiary interakcji fosfatazy glukan-glukan z fizjologicznie istotnymi substratami mają fundamentalne znaczenie dla biologicznego zrozumienia rodziny enzymów fosfatazy glukanowej i regulacji metabolizmu energetycznego. Niniejszy manuskrypt przedstawia test sedymentacji in vitro oparty na konkanawalinie A (ConA), przeznaczony do wykrywania powinowactwa fosfataz glukanu do wiązania substratu w stosunku do różnych substratów glukanu. Jako dowód słuszności koncepcji określono stałą dysocjacji (KD) fosfatazy glukanowej, Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) i amylopektyny. Charakterystyka mutantów SEX4 i innych członków rodziny enzymów fosfatazy glukanowej dodatkowo pokazuje przydatność tego testu do oceny zróżnicowanego wiązania interakcji białko-węglowodan. Dane te wskazują na przydatność tego testu do scharakteryzowania szerokiego zakresu białek oddziałujących ze skrobią i glikogenem.

Jedną z kluczowych cech rodziny białek fosfataz glukanowych jest ich zdolność do wiązania się z substratami glukanowymi. W pierwszej kolejności za pomocą SDS-PAGE przeanalizowano zdolność wiązania SEX4 do kulek ConA-Sepharose:amylopektyna (Rysunek 2A). Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) użyto jako kontroli negatywnej w celu wykrycia ewentualnego nieswoistego wiązania białek z kulkami ConA-Sepharose:amylopektyna. Analiza białek metodą SDS-PAGE wykazała obecność białka SEX4 we frakcji osadu oraz...

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Ten test sedymentacji in vitro na bazie konkanawaliny A jest przeznaczony do pomiaru powinowactwa wiązania fosfataz glukanu do różnych substratów STA. Informacje, które uzyskujemy dzięki tej metodzie, mają fundamentalne znaczenie dla naszego zrozumienia rodziny enzymów fosfatazy glukanowej. Interakcje z białkami węglowodanowymi są stosunkowo słabe, dlatego obecne metody nie są w stanie wykryć fosfatazy glukanu i interakcji glukanu.Nasz test kosedymentacyjny oparty na lektynie może wykryć powinowactwo wiązania w zakresie milimolowym. Charakterystyka mutantów SEX4, jak również innych członków rodziny enzymów fosfatazy glukanowej, pokazuje zdolność tego testu do ilościowego określania interakcji białkowo-węglowodanowych. Jednym z najtrudniejszych elementów testu jest optymalizacja zakresu stężeń substratu.Zalecamy rozpoczęcie od szerszego zakresu, aby uzyskać pomysł, a następnie zawężenie do określonego zakresu. Na początek odpipetuj 250 mikrolitrów zawiesiny kulek ConA-sefarozy do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować zawartość w temperaturze 10 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu dodać 750 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej probówki zawierającej 250 mikrolitrów kulek ConA-sefarozy. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć sklarowany nad osadem. Następnie przygotuj dwukrotne rozcieńczenia rozpuszczonego roztworu amylopektyny, aby uzyskać serię dwóch mililitrów rozcieńczonych roztworów amylopektyny.Aby przygotować kulki amylopektyny ConA-sepharozy, dodaj 250 mikrolitrów każdego rozcieńczonego roztworu amylopektyny do probówek zawierających 250 mikrolitrów kulek ConA-sefarozy wstępnie zrównoważonych i wiążących bufor. Dobrze wymieszaj zawartość i oznacz probówki odpowiednim stężeniem amylopektyny. Inkubować zawartość probówki na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut i odwirowywać probówki w temperaturze 10 000 G przez jedną minutę.Wymieszaj 250 mikrolitrów kulek amylopektyny ConA-sepharose ze 100 mikrolitrami buforu wiążącego zawierającego 10 mikrogramów nadmiaru skrobi cztery lub białka SEX4, 10 milimoli ditiotreitolu i 10 mikromoli koktajlu inhibitorów proteazy. Inkubować zawartość w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut, delikatnie obracając. Następnie odwirować probówki o stężeniu 10 000 G przez jedną minutę i ostrożnie odpipetować 50 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 20 mikrolitrów barwnika stronicowego 4X SDS i 10 mikrolitrów wody destylowanej do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów zebranych frakcji supernatantu i oznacz je jako S. Podobnie dodaj 20 mikrolitrów barwnika stronicowego 4X SDS i 80 mikrolitrów wody destylowanej do probówek zawierających przemyte kulki ConA-sepharozy amylopektyny SEX4. Po dodaniu barwnika i wody podgrzej wszystkie próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu kulek ConA-sepharozy amylopektyny SEX4 w temperaturze 10 000 G przez jedną minutę, zachowaj supernatant i oznacz go jako P. Załaduj 40 mikrolitrów niezwiązanych próbek białka oznaczonych jako S do 4 do 12% prefabrykowanych studzienek żelu poliakryloamidowego od najniższego stężenia substratu do najwyższego, rezerwując pierwszy pas dla markera masy cząsteczkowej białka.Użyj drugiego żelu, aby załadować próbki białek związanych z glukanem oznaczone P. Dodaj świeżo przygotowany bufor do biegania ze stroną SDS do obu komór aparatu i uruchom żel pod napięciem 150 V przez 35 minut lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu. Następnie wyjmij kasetę z żelem z aparatu i usuń przekładki i szklane płytki, aby oddzielić żel do analizy western blot. Przygotuj jeden litr buforu transferowego zawierającego 5,8 grama zasady tris, 2,9 grama glicyny, 0,37 grama SDS i 200 mililitrów metanolu.Aby przenieść oddzielone wielkością białka z żelu poliakryloamidowego do membrany nitrocelulozowej, zmontuj gąbki, bibuły filtracyjne, żel i membranę nitrocelulozową zgodnie z zachodnim protokołem transferu i pracuj pod napięciem 70 woltów przez godzinę. Po uruchomieniu żelu należy inkubować błonę nitrocelulozową w roztworze białkowym zawierającym od 1 do 5% albuminy surowicy bydlęcej lub białka mleka w 50 mililitrach buforu TBST przez jedną godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek. Przemyć membranę trzykrotnie za pomocą buforu TBST w celu usunięcia niezwiązanego roztworu blokującego.Następnie inkubuj błonę przez godzinę z rozcieńczonym przeciwciałem połączonym z peroksydazą chrzanową specyficznym dla białka znakowanego histydyną. Następnie przemyj membranę trzykrotnie w buforze TBST, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. W przypadku obrazowania cyfrowego należy przygotować roztwór równych części roztworów substratów chemiluminescencyjnych, po 750 mikrolitrów każdy w probówce o pojemności 1,5 mililitra i inkubować membranę przez co najmniej pięć minut w roztworze.Umieść białko błonowe stroną do dołu na skanerze blot i uruchom oprogramowanie do akwizycji, aby określić ilościowo białko zarówno we frakcji osadu, jak i supernatantu. Aby uzyskać dane, należy rozpocząć ilościowe pomiary sygnału za pomocą oprogramowania akwizycyjnego ze skanerem blotów. Znormalizować wszystkie pomiary ilościowe we frakcjach supernatantu i osadu do całkowitego załadowanego białka.W eksperymencie wiązania nasycającego wykreśl procent związanego białka w stosunku do stężenia amylopektyny i dopasuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych, aby obliczyć stałą dysocjacji, Kd. Zdolność wiązania SEX4 do kulek amyloktyny ConA-sepharozy analizowano za pomocą strony SDS. Stwierdzono obecność białka SEX4 we frakcji osadu oraz albuminy surowicy bydlęcej we frakcji supernatantu. W278A, znany mutant SEX4 o znacznie zmniejszonej zdolności wiązania glukanu, pojawił się we frakcji supernatantu, co wskazuje na użyteczność i swoistość tego testu.Analiza Western blot wykazała znaczny wzrost wykrywalności SEX4, a metoda jest specyficzna dla wykrywania fosforanów glukanu ze znacznikiem histydyny na końcu końcówki. Test kosedymentacji został przetestowany przy trzech różnych stężeniach SEX4. Podczas gdy dwa mikrogramy SEX4 wystarczą do wizualizacji poprzez detekcję chemiluminescencyjną, użycie pięciu lub 10 mikrogramów SEX4 pozwala na dokładniejsze wykrywanie.Stwierdzono również zwiększone wiązanie SEX4 ze zwiększonym stężeniem amylopektyny. Określono powinowactwo wiązania amylopektyny i białka typu dzikiego SEX4 w różnych stężeniach, a dane dotyczące procentowego wiązania białka ze specyficznym modelem wiązania w jednym miejscu dały Kd około 1,03 miligrama na mililitr. Oceniono przydatność tej metody do pomiaru wiązania laforyny, LSF2, SEX4 kukurydzianego i SEX4 ziemniaka z amylopektyną ziemniaczaną.Wyniki wykazały, że badane białka z upraw ważnych z agronomicznego punktu widzenia są również w różny sposób związane z amylopektyną. Bardzo ważne jest, aby pamiętać o normalizacji wszystkich pomiarów ilościowych we frakcjach osadu i supernatantu do całkowitego załadowanego białka. Aby upewnić się, że cała amylopektyna jest związana z kulkami, zachowaj frakcje supernatantu, aby później przeprowadzić głęboki test glukozy.Fosfataza glukanowa wykorzystuje różne mechanizmy wiązania, lokalizowania i defosforylacji węglowodanów. Metoda ta pozwala na badanie wiązania fosfatazy glukanowej z różnymi domenami strukturalnymi w dużych kompleksach polimerowych w celu defosforylacji specyficznej dla położenia.

concanavalin-based-sedimentation-assay-to-measure-substrate-binding

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda pomiaru aktywności chitynazy w płynach biologicznych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub surowica.

Pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Obecny protokół opisuje procedury używane do badania i charakteryzowania enzymów związanych ze ścianą komórkową, głównie β-1,3-glukanazy i peroksydazy, w roślinach pszenicy. Ich poziom aktywności wzrasta podczas interakcji pszenica - RWA i bierze udział w odpowiedzi obronnej roślin poprzez wzmocnienie ścian komórkowych, co zniechęca mszyce do żerowania.

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Poznaj test sedymentacyjny z konkanawaliną A do pomiaru wiązania substratów przez fosfatazy glukanu. Ta metoda pozwala wykrywać słabe interakcje białko-węglowodanowe w zakresie milimolarnym i charakteryzować mutanty SEX4.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Przeglądaj więcej filmów