Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Ten test sedymentacji in vitro na bazie konkanawaliny A jest przeznaczony do pomiaru powinowactwa wiązania fosfataz glukanu do różnych substratów STA. Informacje, które uzyskujemy dzięki tej metodzie, mają fundamentalne znaczenie dla naszego zrozumienia rodziny enzymów fosfatazy glukanowej. Interakcje z białkami węglowodanowymi są stosunkowo słabe, dlatego obecne metody nie są w stanie wykryć fosfatazy glukanu i interakcji glukanu.

Nasz test kosedymentacyjny oparty na lektynie może wykryć powinowactwo wiązania w zakresie milimolowym. Charakterystyka mutantów SEX4, jak również innych członków rodziny enzymów fosfatazy glukanowej, pokazuje zdolność tego testu do ilościowego określania interakcji białkowo-węglowodanowych. Jednym z najtrudniejszych elementów testu jest optymalizacja zakresu stężeń substratu.

Zalecamy rozpoczęcie od szerszego zakresu, aby uzyskać pomysł, a następnie zawężenie do określonego zakresu. Na początek odpipetuj 250 mikrolitrów zawiesiny kulek ConA-sefarozy do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować zawartość w temperaturze 10 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu dodać 750 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej probówki zawierającej 250 mikrolitrów kulek ConA-sefarozy. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć sklarowany nad osadem. Następnie przygotuj dwukrotne rozcieńczenia rozpuszczonego roztworu amylopektyny, aby uzyskać serię dwóch mililitrów rozcieńczonych roztworów amylopektyny.

Aby przygotować kulki amylopektyny ConA-sepharozy, dodaj 250 mikrolitrów każdego rozcieńczonego roztworu amylopektyny do probówek zawierających 250 mikrolitrów kulek ConA-sefarozy wstępnie zrównoważonych i wiążących bufor. Dobrze wymieszaj zawartość i oznacz probówki odpowiednim stężeniem amylopektyny. Inkubować zawartość probówki na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut i odwirowywać probówki w temperaturze 10 000 G przez jedną minutę.

Wymieszaj 250 mikrolitrów kulek amylopektyny ConA-sepharose ze 100 mikrolitrami buforu wiążącego zawierającego 10 mikrogramów nadmiaru skrobi cztery lub białka SEX4, 10 milimoli ditiotreitolu i 10 mikromoli koktajlu inhibitorów proteazy. Inkubować zawartość w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut, delikatnie obracając. Następnie odwirować probówki o stężeniu 10 000 G przez jedną minutę i ostrożnie odpipetować 50 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 20 mikrolitrów barwnika stronicowego 4X SDS i 10 mikrolitrów wody destylowanej do każdej probówki zawierającej 50 mikrolitrów zebranych frakcji supernatantu i oznacz je jako S. Podobnie dodaj 20 mikrolitrów barwnika stronicowego 4X SDS i 80 mikrolitrów wody destylowanej do probówek zawierających przemyte kulki ConA-sepharozy amylopektyny SEX4. Po dodaniu barwnika i wody podgrzej wszystkie próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu kulek ConA-sepharozy amylopektyny SEX4 w temperaturze 10 000 G przez jedną minutę, zachowaj supernatant i oznacz go jako P. Załaduj 40 mikrolitrów niezwiązanych próbek białka oznaczonych jako S do 4 do 12% prefabrykowanych studzienek żelu poliakryloamidowego od najniższego stężenia substratu do najwyższego, rezerwując pierwszy pas dla markera masy cząsteczkowej białka.

Użyj drugiego żelu, aby załadować próbki białek związanych z glukanem oznaczone P. Dodaj świeżo przygotowany bufor do biegania ze stroną SDS do obu komór aparatu i uruchom żel pod napięciem 150 V przez 35 minut lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu. Następnie wyjmij kasetę z żelem z aparatu i usuń przekładki i szklane płytki, aby oddzielić żel do analizy western blot. Przygotuj jeden litr buforu transferowego zawierającego 5,8 grama zasady tris, 2,9 grama glicyny, 0,37 grama SDS i 200 mililitrów metanolu.

Aby przenieść oddzielone wielkością białka z żelu poliakryloamidowego do membrany nitrocelulozowej, zmontuj gąbki, bibuły filtracyjne, żel i membranę nitrocelulozową zgodnie z zachodnim protokołem transferu i pracuj pod napięciem 70 woltów przez godzinę. Po uruchomieniu żelu należy inkubować błonę nitrocelulozową w roztworze białkowym zawierającym od 1 do 5% albuminy surowicy bydlęcej lub białka mleka w 50 mililitrach buforu TBST przez jedną godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek. Przemyć membranę trzykrotnie za pomocą buforu TBST w celu usunięcia niezwiązanego roztworu blokującego.

Następnie inkubuj błonę przez godzinę z rozcieńczonym przeciwciałem połączonym z peroksydazą chrzanową specyficznym dla białka znakowanego histydyną. Następnie przemyj membranę trzykrotnie w buforze TBST, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. W przypadku obrazowania cyfrowego należy przygotować roztwór równych części roztworów substratów chemiluminescencyjnych, po 750 mikrolitrów każdy w probówce o pojemności 1,5 mililitra i inkubować membranę przez co najmniej pięć minut w roztworze.

Umieść białko błonowe stroną do dołu na skanerze blot i uruchom oprogramowanie do akwizycji, aby określić ilościowo białko zarówno we frakcji osadu, jak i supernatantu. Aby uzyskać dane, należy rozpocząć ilościowe pomiary sygnału za pomocą oprogramowania akwizycyjnego ze skanerem blotów. Znormalizować wszystkie pomiary ilościowe we frakcjach supernatantu i osadu do całkowitego załadowanego białka.

W eksperymencie wiązania nasycającego wykreśl procent związanego białka w stosunku do stężenia amylopektyny i dopasuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych, aby obliczyć stałą dysocjacji, Kd. Zdolność wiązania SEX4 do kulek amyloktyny ConA-sepharozy analizowano za pomocą strony SDS. Stwierdzono obecność białka SEX4 we frakcji osadu oraz albuminy surowicy bydlęcej we frakcji supernatantu. W278A, znany mutant SEX4 o znacznie zmniejszonej zdolności wiązania glukanu, pojawił się we frakcji supernatantu, co wskazuje na użyteczność i swoistość tego testu.

Analiza Western blot wykazała znaczny wzrost wykrywalności SEX4, a metoda jest specyficzna dla wykrywania fosforanów glukanu ze znacznikiem histydyny na końcu końcówki. Test kosedymentacji został przetestowany przy trzech różnych stężeniach SEX4. Podczas gdy dwa mikrogramy SEX4 wystarczą do wizualizacji poprzez detekcję chemiluminescencyjną, użycie pięciu lub 10 mikrogramów SEX4 pozwala na dokładniejsze wykrywanie.

Stwierdzono również zwiększone wiązanie SEX4 ze zwiększonym stężeniem amylopektyny. Określono powinowactwo wiązania amylopektyny i białka typu dzikiego SEX4 w różnych stężeniach, a dane dotyczące procentowego wiązania białka ze specyficznym modelem wiązania w jednym miejscu dały Kd około 1,03 miligrama na mililitr. Oceniono przydatność tej metody do pomiaru wiązania laforyny, LSF2, SEX4 kukurydzianego i SEX4 ziemniaka z amylopektyną ziemniaczaną.

Wyniki wykazały, że badane białka z upraw ważnych z agronomicznego punktu widzenia są również w różny sposób związane z amylopektyną. Bardzo ważne jest, aby pamiętać o normalizacji wszystkich pomiarów ilościowych we frakcjach osadu i supernatantu do całkowitego załadowanego białka. Aby upewnić się, że cała amylopektyna jest związana z kulkami, zachowaj frakcje supernatantu, aby później przeprowadzić głęboki test glukozy.

Fosfataza glukanowa wykorzystuje różne mechanizmy wiązania, lokalizowania i defosforylacji węglowodanów. Metoda ta pozwala na badanie wiązania fosfatazy glukanowej z różnymi domenami strukturalnymi w dużych kompleksach polimerowych w celu defosforylacji specyficznej dla położenia.