Name: Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę generowania sferoidów wątroby z autologicznych komórek krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badania toksykologiczne, odkrywanie leków oraz zastosowania w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są szczególnie wdzięczni za pomoc techniczną udzieloną przez Oksanę i Johna Greenacre. Prace te były wspierane przez ACA CELL Biotech GmbH z Heidelbergu w Niemczech.

Uzyskano zgodę etyczną (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) na przeprowadzenie tych eksperymentów, a wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę przed pobraniem krwi, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych (MNC) z ludzkiej krwi obwodowej (PB)
<ol>
	<li>Pobrać 30 ml krwi od zdrowych dawców z pomocą przeszkolonego personelu medycznego zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
	<li>Wyizoluj PBMNC za pomocą pożywki o gradiencie gęstości zgodnie z protokołem opublikowanym przez Becker-Kojić et al.13. Wyizolować, pipetując, warstwę interfazową między osoczem a pożywką o gradiencie gęstości i użyć sterylnego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) do przemycia wyizolowanych komórek.</li>
	<li>Użyj komory liczącej i policz liczbę komórek przy użyciu standardowych metod.</li>
</ol>
2. Dedyferencjacja MNC po aktywacji za pomocą ludzkiej glikoproteiny zakotwiczonej w GPI
<ol>
	<li>Umieścić 6 x 106 komórek jednojądrzastych w PBS/1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w probówce polistyrenowej (15 ml) i inkubować ze specyficznym przeciwciałem przez 30 minut w temperaturze 37 °C zgodnie z Becker-Kojić i wsp.13.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej i zastąpić PBS/BSA zmodyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Hoduj komórki w probówkach polistyrenowych o pojemności 15 ml w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 8-10 dni, jak opisano w Becker-Kojić et al.13. W dniu 5 (D5) dodaj 1-2 ml pożywki Iscove uzupełnionej o 10% FBS do każdej probówki o pojemności 15 ml.</li>
</ol>
3. Sortowanie nowo wygenerowanych komórek odróżnicowanych
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek hodowlanych w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 300 x g i odessać sterylną pipetą otrzymany supernatant zgodnie z Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Zawiesić osad otrzymany przez odwirowanie w 90 μl zimnego buforu PBS (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA i 2 mM EDTA) i dodać 10 μl dodatnich kulek magnetycznych o rozmiarach nano CD45 i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć zawiesinę komórek 2 ml buforu PBS, odwirować ją przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodać 500 μl buforu PBS do komórek i dokładnie zawiesić.</li>
	<li>Odpipetować 500 μl wstępnie schłodzonego buforu PBS do kolumny, aby przepłukać i umieścić go w polu magnetycznym za pomocą podstawki magnetycznej.</li>
	<li>Przemyć komórki umieszczone na kolumnie dwukrotnie 500 μl buforu PBS i zebrać przepływowe komórki zawierające ujemne CD45 w pożywce Iscove'a uzupełnionej 10% FBS.</li>
	<li>Użyj komory zliczającej, aby określić liczbę przeprogramowanych komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do produkcji ludzkich hepatocytów
<ol>
	<li>Oddziel szkiełka nakrywkowe (14 mm) i inkubuj je w niejonowym detergencie przez 10 minut. Umyj szkiełka nakrywkowe w wodzie dejonizowanej, aż nie pozostaną pęcherzyki i inkubuj je w 1M HCl przez 30 minut (na podstawie Marchenko et al.14).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy umyć wodą dejonizowaną co najmniej 3x i wysuszyć przez noc w temperaturze pokojowej. Wysuszone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w autoklawie w odpowiednim pojemniku.</li>
</ol>
5. Powlekanie płytek hodowli komórkowych biolamininą w celu 2D wątrobowego różnicowania BD-PSC
<ol>
	<li>Umieść autoklawizowane szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej pęsety w 4-dołkowych płytkach i włącz lampy UV na 30 minut, aby zapewnić sterylne warunki.</li>
	<li>Rozmrozić porcje biolamininy i dodać 120 μl 5 μg/ml biolamininy do każdego szklanego szkiełka nakrywkowego. Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć nadmiar biolamininy i dodać 200 μl pożywki do różnicowania hepatocytów, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
6. Przygotowanie pożywki do różnicowania hepatocytów
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki zastępczej surowicy nokautującej hepatoblasty (KSR)/dimetylosulfotlenku (DMSO) składającej się z 76,4% nokautującego DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 0,1% β-merkaptoetanolu, 1% DMSO i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep).</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 1% L-glutaminy, 10 μM soli sodowej 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu (HCC) i 1% pióra/paciorkowca.</li>
	<li>Podwielokrotną pożywkę z podstawowego roztworu i dodać świeży czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) i onkostatynę M (OSM) w końcowych stężeniach 10 ng/ml i/lub 20 ng/ml dla każdej zmiany pożywki. 
	UWAGA: Onkostatyna M jest cytokiną należącą do grupy cytokin interleukiny 6, ważną dla hematopoezy, a także dla rozwoju wątroby.</li>
</ol>
7. Hodowla komórek wątroby różnicowanych od BD-PSC
<ol>
	<li>Umieść 3 x 105 komórek BD-PSCS w każdym dołku 4-dołkowej płytki pokrytej biolamininą.</li>
	<li>Umieścić 4-dołkowe płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hodować komórki przez 5 dni w pożywce KSR/DMSO, która wspomaga różnicowanie endodermalne i zmieniać pożywkę co drugi dzień.</li>
	<li>Przejść na pożywkę do dojrzewania hepatocytów w 5 dniu i hodować komórki przez dodatkowe 7-10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 48 godzin.</li>
</ol>
8. 3D sferoidalne różnicowanie wątroby
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek zderóżnicowaną BD w sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki odróżnicowane BD w pożywce KSR/DMSO w ilości 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 μm, aby zapewnić zawiesinę pojedynczych komórek i usunąć wszelkie dodatkowe zanieczyszczenia.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej i przygotuj wystarczającą objętość dla każdej gęstości wysiewu komórek, aby dozować wymaganą objętość na studzienkę. Przygotuj gradient z górnym wysiewem 1 x 106 komórek do niskiej gęstości wysiewu 4000 komórek.</li>
	<li>Dozować 100 μl pożywki KSR/DMSO do 96 płytek mocujących o bardzo niskim poziomie i dodać 100 μl rozcieńczonego wysiewu komórek.</li>
	<li>Umieścić niską płytkę mocującą w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i hodować je przez 5 dni.</li>
	<li>Zmień 50% podłoża od 3 do 4 dni po wysianiu, gdy sferoidy są wystarczająco zwarte.</li>
	<li>W 5 dniu zmień pożywkę na pożywkę do dojrzewania hepatocytów i hoduj komórki przez dodatkowe 7-10 dni w celu dalszego dojrzewania. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
</ol>
9. Analiza immunofluorescencyjna nowo wygenerowanych kultur komórek wątroby 2D
<ol>
	<li>Hodować komórki zgodnie z opisaną powyżej metodą różnicowania przez 4, 8, 15 i 24 dni i usunąć pożywkę.</li>
	<li>Inkubować komórki z podgrzanym utrwalaczem składającym się z 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 min. Wyrzuć utrwalacz i myj komórki 2x PBS przez 5 min każda. Natychmiast dodaj 0,1% roztwór trytonu X-100 i przepuszczaj komórki przez 5 minut. Umyj 2x PBS.</li>
	<li>Dodać roztwór blokujący z PBS i 5% BSA i umieścić na płycie kołyskowej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze rozcieńczonym 1% BSA/PBS w następujący sposób: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteina (AFP) 1:250, cytokeratyna 18 (CK18) 1:50, czynnik jądrowy hepatocytów 4 alfa (HNF4α) 1:1000 i transtyretyna (TTR) 1:50. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć roztwór przeciwciała, myj komórki przez 5 minut i powtórz etap płukania 3 razy.</li>
	<li>Przygotować następujące przeciwciała drugorzędowe w buforze rozcieńczającym: królicze przeciwciała anty-kurze IgG (czerwień teksana) 1:1000, kozie anty-mysie IgG (488) 1:1000 i kozie anty-królicze (488) 1:500. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki 3x PBS przez 5 minut każde i zamontować szkiełka nakrywkowe z mediami montażowymi zawierającymi DAPI do analizy mikroskopowej.</li>
</ol>
10. Żywe barwienie nowo powstałych sferoidów wątroby
<ol>
	<li>Ostrożnie wyrzuć pożywkę hodowlaną, nie dotykając sferoid, dodaj świeżo przygotowany PBS z 0,1% roztworem trytonu X-100 i inkubuj przez 5 minut, aby przepuszczalność komórek.</li>
	<li>Przemyć sferoidy pożywką powoli pipetując przez 5 minut, powtórzyć 2x.</li>
	<li>Inkubować sferoidy z pierwszorzędowymi przeciwciałami ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) i CYP3A4 (1:200) przygotowanymi w PBS z 1% BSA przez 1 godzinę w 5% inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar roztworu przeciwciał i przemyj sferoidy pożywką 3x.</li>
	<li>Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe kozie anty-mysie IgG (Cy3), kozie anty-mysie IgG (488) i królicze przeciwciała anty-kurze IgG (czerwień teksana) w rozcieńczeniu 1:1000 i 1:500 dla koziego anty-królika (488) w PBS w 1% BSA. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę i inkubować przez 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Ostrożnie przemyć 3x pożywką i pozostawić płytkę na 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed wykonaniem mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
11. Badanie sferoid za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Włącz fluorescencyjne źródło światła 10 minut przed użyciem, włącz komputer i otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Użyj obiektywu z 4-krotnym powiększeniem, kliknij przycisk 4x na pasku narzędzi, aby wybrać odpowiednią podziałkę, a następnie umieść 96-dołkową płytkę na środkowej płycie sceny.</li>
	<li>Włącz źródło światła LED, użyj filtra jasnego pola i umieść płytkę w interesującej Cię studni za pomocą osi x-y stage pokrętło regulacji ostrości.</li>
	<li>Zmień na ścieżkę światła kamery, kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do obrazowania, aby zobrazować obraz na ekranie, i upewnij się, że sferoida jest wyśrodkowana za pomocą pokręteł osi x-y i ustaw ostrość za pomocą pokrętła zgrubnego/precyzyjnego ustawiania ostrości. 
	UWAGA: Kształt sferoid pozostaje niezmienny po zastosowaniu barwienia na żywo.</li>
	<li>Wybierz metodę obserwacji w jasnym polu na pasku narzędzi, ustaw ekspozycję na automatyczną i kliknij przycisk Migawka na panelu sterowania aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie zapisz obraz jako plik .vsi używając odpowiedniej nazwy w interesującym Cię folderze.</li>
	<li>Umieść płytkę ekranującą światło otoczenia, aby wyłączyć światło LED, zmień na filtr wzbudzenia B, wybierz metodę obserwacji 488 na pasku narzędzi, otwórz migawkę, zrób zdjęcie, klikając przycisk Migawka, zamknij migawkę, a następnie zapisz file zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Powtórz to z filtrem do wzbudzenia G, stosując odpowiednią metodę obserwacji (czerwień teksańska lub CY3). Następnie powtórz całą procedurę dla każdego interesującego Cię dołka.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C i hodować ją w sposób opisany powyżej.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620(2019).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li>
<li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signalling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhanna%2C+S+%22Animal+Biotechnology+%28Second+Edition%29%22">Animal Biotechnology (Second Edition)</a>. , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+stem+cells+into+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).</li>
<li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-fetoprotein%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li>
<li>Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transthyretin+in+cell+biology%3A+impact+on+human+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+2021%22%5BJournal%5D)">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li>
<li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li>
<li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li>
<li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).</li>
<li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects%3A+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li>
<li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li>
<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+liver+diseases+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li>
<li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).</li>
</ol>

Autor korespondencyjny oświadcza, że jest posiadaczem patentu związanego z nowym ludzkim białkiem sprzężonym z GPI. Jest współzałożycielką i współpracowniczką ACA CELL Biotech GmbH. Pozostali autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Wątroba jest głównym organem w ludzkim ciele o wielu podstawowych funkcjach biologicznych, takich jak detoksykacja metabolitów. Z powodu ciężkiej niewydolności wątroby, takiej jak marskość wątroby i/lub wirusowe zapalenie wątroby, na całym świecie umiera prawie 2 miliony osób. Przeszczepy wątroby zajmują drugie miejsce wśród przeszczepów narządów litych na świecie, ale tylko około 10% obecnego zapotrzebowania jest zaspokajane22.
Pierwotne ludzkie hepatocyty (PHH) są czę...

W ostatnich latach trójwymiarowe (3D) systemy hodowli sferoidów stały się ważnym narzędziem do badania różnych obszarów badań nad rakiem, odkrywania leków i toksykologii. Takie hodowle cieszą się dużym zainteresowaniem, ponieważ wypełniają lukę między dwuwymiarowymi (2D) monowarstwami hodowli komórkowych a złożonymi narządami1.
W przypadku braku powierzchni adhezyjnej, w porównaniu do hodowli komórkowej 2D, tworzenie sferoid opiera się na naturalnym powinowactwie tych komórek do grupowania w formie 3D. Komórki te organizują się w grupy składające się z jednego lub więcej typów dojrzałych komórek. Wolne od ciał obcych komórki oddziałują ze sobą tak, jak w swoim pierwotnym mikrośrodowisku. Komórki w hodowli 3D są znacznie bliżej siebie i mają odpowiednią orientację względem siebie, z wyższą produkcją macierzy zewnątrzkomórkowej niż hodowle 2D i stanowią środowisko bliskie naturalnemu 2.
Modele zwierzęce są używane od dawna do badania ludzkiej biologii i chorób3. Pod tym względem istnieją wewnętrzne różnice między ludźmi a zwierzętami, co sprawia, że modele te nie do końca nadają się do badań ekstrapolacyjnych. Sferoidy i organoidy z hodowli 3D stanowią obiecujące narzędzie do badania tkankowej architektury, interakcji i przesłuchów między różnymi typami komórek, które występują in vivo i mogą przyczynić się do zmniejszenia lub nawet zastąpienia modeli zwierzęcych. Są one szczególnie interesujące dla badań nad patogenezą chorób wątroby, a także platform badań przesiewowych leków4.
3D hodowla sferoidalna ma szczególne znaczenie dla badań nad rakiem, ponieważ może wyeliminować nieciągłość między komórkami a ich środowiskiem, zmniejszając potrzebę trypsynizacji lub leczenia kolagenazą potrzebną do przygotowania monowarstw komórek nowotworowych do hodowli 2D. Sferoidy nowotworowe umożliwiają badanie, w jaki sposób normalne i złośliwe komórki odbierają i reagują na sygnały z otoczenia5 i są ważną częścią badań nad biologią nowotworów.
W porównaniu do monowarstwy, kultury 3D składające się z różnych typów komórek przypominają tkanki nowotworowe pod względem właściwości strukturalnych i funkcjonalnych, dlatego nadają się do badania przerzutów i inwazji komórek nowotworowych. Właśnie dlatego takie modele sferoidalne przyczyniają się do przyspieszenia badań nad rakiem6.
Sferoidy również pomagają rozwijać technologię tworzenia ludzkich organoidów, ponieważ biologia tkanek i organów jest bardzo trudna do zbadania, szczególnie u ludzi. Postęp w hodowli komórek macierzystych umożliwia rozwój kultur 3D, takich jak organoidy składające się z komórek macierzystych i komórek progenitorowych tkanek, a także różnych typów dojrzałych komórek (tkankowych) z narządu o pewnych cechach funkcjonalnych, takich jak prawdziwy narząd, który można wykorzystać do modelowania rozwoju narządów, chorób, ale można je również uznać za przydatne w medycynie regeneracyjnej7.
Podstawowe ludzkie hepatocyty są zwykle używane do badania in vitro biologii ludzkich hepatocytów, funkcji wątroby i toksyczności wywołanej przez leki. Hodowle ludzkich hepatocytów mają dwie główne wady, po pierwsze, ograniczoną dostępność tkanek pierwotnych, takich jak ludzkie hepatocyty, a po drugie, tendencję hepatocytów do szybkiego deróżnicowania w hodowli 2D, tracąc w ten sposób swoją specyficzną funkcję hepatocytów8. Hodowle wątroby 3D są lepsze pod tym względem i zostały ostatnio wykonane ze zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)9. Bioinżynieryjne sferoidy wątrobowe 3D są szczególnie interesujące dla badań nad rozwojem, toksycznością, genetycznymi i zakaźnymi chorobami wątroby, a także w odkrywaniu leków do leczenia chorób wątroby10. Wreszcie, mają one również potencjał do wykorzystania klinicznego, wiedząc, że ostra choroba wątroby ma śmiertelność prawie 80%, biosztuczne sferoidy wątroby i/lub wątroby mogą potencjalnie uratować tych pacjentów, zapewniając częściową czynność wątroby do czasu znalezienia odpowiedniego dawcy11.
Ustaliliśmy protokół generowania ludzkich sferoidów wątrobowych przy użyciu pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi (BD-PSC) do przygotowania różnej wielkości sferoid zawierających 4000 do 1 x 106 komórek i przeanalizowaliśmy je za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofluorescencji. Przetestowaliśmy również zdolność funkcji specyficznej dla hepatocytów, oceniając ekspresję enzymów cytochromu P450 3A4 (CYP3A4) i 2E1 (CYP2E1) należących do rodziny cytochromów P450, które odgrywają ważną rolę w metabolizmie komórkowym i lekowym w procesie detoksykacji12.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało albuminowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>wytwarzane w kurczaku</td></tr><tr><td>Albumina Frakcja V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoprotein</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>królik poliklonalny IgG</td></tr><tr><td>Biolamina 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>ludzkie rekombinowane</td></tr><tr><td>mikrokulki CD45</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>nano-rozmiarowe kulki magnetyczne</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 well</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dostępny w handlu detergent</td><td>Procter & Gamble</td><td></td><td>niejonowy detergent</td></tr><tr><td>Przeciwciało specyficzne dla CYP2E1</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>królicze przeciwciało poliklonalne IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>mysie przeciwciało monoklonalne IgG1</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>mysie przeciwciało monoklonalne IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Wycofane z produkcji. Dostępne pod: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG Cy3</td><td>online</td><td>ABIN1673767</td><td>poliklonalne</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG DyLight 488</td><td>Przeciwciała online</td><td>ABIN1889284</td><td>poliklonalny</td></tr><tr><td>kozioł anty-królik IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>pożywka do dojrzewania hepatocytów</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>ludzkie rekombinowane</td></tr><tr><td>przeciwciało HNF4 i alfa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>klon 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon 21-hemibursztynian (sól sodowa)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej - Multi Species Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>wycofany z produkcji. Dostępne pod numerem katalogowym 10-828-010</td></tr><tr><td>Bufor MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>stojak magnetyczny</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>kolumny MiniMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>Płytki 4-dołkowe</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>ludzki rekombinowany</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterylne</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS 15ml probówki sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-kurczak IgG Texas red</td><td>Przeciwciała online</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 człowiek</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało transtyretynowe&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>produkowany z kurczaka</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Ludzkie komórki wątroby mogą tworzyć trójwymiarową (3D) strukturę zdolną do wzrostu w kulturze przez kilka tygodni, zachowując swoją funkcjonalną zdolność. Ze względu na ich naturę grupowania się w szalkach hodowlanych o niskiej lub zerowej przyczepności, tworzą agregaty wielu komórek wątroby, które nazywane są sferoidami ludzkiej wątroby. Tworzenie sferoid wątroby 3D opiera się na naturalnej tendencji komórek wątroby do agregacji przy braku podłoża adhezyjnego. Te struktury 3D mają lepsze reakcje fizjologiczne niż komórki, które są bliższe środowisku in vivo. Korzystanie z hodowli hepatocytów 3D ma wiele zalet w porównaniu z klasycznymi hodowlami dwuwymiarowymi (2D), w tym bardziej istotne biologicznie mikrośrodowisko, morfologię architektoniczną, która ponownie składa naturalne narządy, a także lepsze przewidywanie stanu chorobowego i reakcji in vivo na leki. Do generowania sferoid można wykorzystać różne źródła, takie jak pierwotna tkanka wątroby lub unieśmiertelnione linie komórkowe. Tkanka wątroby 3D może być również modyfikowana przy użyciu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do pozyskiwania hepatocytów. Uzyskaliśmy sferoidy ludzkiej wątroby przy użyciu pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzenia krwi (BD-PSC) generowanych z niemanipulowanej krwi obwodowej przez aktywację ludzkiego białka połączonego z błoną GPI i różnicowanych do ludzkich hepatocytów. Ludzkie komórki wątroby i sferoidy ludzkiej wątroby pochodzące z BD-PSC analizowano za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofenotypowania przy użyciu ludzkich markerów hepatocytów.

Z sukcesem zróżnicowaliśmy ludzkie BD-PSC w komórki endodermy/progenitory wątroby oraz hepatocyty, stosując dwuetapowy protokół. Zmiany morfologiczne podczas procesu różnicowania wątrobowego przedstawiono na Rycynie 1. BD-PSC różnicują się w hepatocyty, przechodząc przez trzy różne stadia. Pierwszym etapem jest różnicowanie w komórki endodermalne L4, drugim różnicowanie w komórki progenitorowe wątroby (hepatoblasty) L8 wykazujące typową morfologię poligonalną, a trzecim dojrzewanie do hepato...

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Wytwarzanie sferoid ludzkiej wątroby przy użyciu źródeł autologicznych może przyczynić się do różnych obszarów badań, takich jak toksykologia, rak i odkrywanie leków. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie ludzkich hepatocytów pochodzących z BDPC do inżynierii sferoid ludzkiej wątroby, omijając niedobór pierwotnych ludzkich hepatocytów lub PHH. Autologiczne ludzkie sferoidy można rozszerzyć na medycynę regeneracyjną i terapię, szczególnie u pacjentów z ostrą niewydolnością wątroby.Procedurę zademonstruje dr Anne-Katherin Schott, kierownik projektu w moim laboratorium. Zacznij od przygotowania 500 mililitrów substytucji surowicy hepatobblastów KnockOut, dimetylosulfotlenku lub pożywki KSR DMSO i pożywki do dojrzewania hepatocytów. Podwielokrotnić pożywkę z podstawowego materiału i dodać świeży czynnik wzrostu hepatocytów lub HGF oraz onkostatynę M lub OCM w końcowych stężeniach 10 lub 20 nanogramów na mililitr dla każdej zmiany podłoża.Przenieś trzy razy 10 do piątych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi lub komórek BD-PSC na czterodołkową płytkę pokrytą biolamininą i inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni. Aby wspomóc różnicowanie endodermalne, należy hodować komórki przez pięć dni w pożywce KSR DMSO i zmieniać pożywkę co 48 godzin. W piątym dniu dodaj pożywkę do dojrzewania hepatocytów i hoduj komórki przez dodatkowe siedem do 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zapewniając zmianę pożywki co 48 godzin.Policz komórki za pomocą komory liczącej i odwiruj odwirowaną zawiesinę komórek odróżnicowaną BD w temperaturze 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś zdedyferencjowane komórki BD w pożywce KSR DMSO w stężeniu dwa razy 10 z sześciu komórek na mililitr. Po upewnieniu się o zawieszeniu pojedynczej komórki usuń wszelkie dodatkowe zanieczyszczenia, przepuszczając komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów.Ponownie policz komórki za pomocą komory liczącej i przygotuj wystarczającą objętość każdej gęstości wysiewu komórek, aby dozować wymaganą objętość na dołek. Przygotuj gradient z górnym wysiewem miliona komórek do niskiej gęstości wysiewu wynoszącej 4 000 komórek. Następnie dozuj 100 mikrolitrów pożywki KSR DMSO do 96-dołkowych płytek o niskim mocowaniu i dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczenia do wysiewu komórek.Inkubuj niską płytkę mocującą przez pięć dni. Zmienić 50% podłoża trzeciego lub czwartego dnia po wysiewie, gdy sferoidy są wystarczająco zwarte. Piątego dnia zmień pożywkę na pożywkę do dojrzewania hepatocytów i hoduj w niej komórki przez dodatkowe siedem do 10 dni, zmieniając pożywkę co 48 godzin.Po hodowli komórek przez 4, 8, 15 i 24 dni przy użyciu opisanej wcześniej metody różnicowania, usuń pożywkę. Inkubować komórki z podgrzanymi utrwalaczami zawierającymi 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut. Następnie wyrzuć utrwalacz i przemyj komórki PBS dwa razy przez pięć minut każda.Natychmiast dodaj 0,1% roztwór Triton X-100 i przepuszczaj komórki przez pięć minut przed dwoma płukaniami PBS. Dodać roztwór blokujący wykonany z PBS i 5% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA przed umieszczeniem komórek na szalce kołyskowej na godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze rozcieńczania 1% BSA PBS i dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała na studzienkę.Roztwór przeciwciał należy odrzucić po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej i wykonać trzy pięciominutowe płukania przy użyciu PBS. Dodać 50 mikrolitrów przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w buforze rozcieńczającym do każdej studzienki i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS przez pięć minut każde, zamontuj szkiełka nakrywkowe z materiałem montażowym zawierającym DAPI do analizy mikroskopowej.Ostrożnie wyrzucić pożywkę hodowlaną, nie dotykając sferoid i dodać świeżo przygotowany PBS z 0,1% roztworem Triton X-100 i inkubować przez pięć minut, aby przepuszczalność komórek. Przemyć sferoidy dwa razy pożywką, powoli pipetując pożywkę. Następnie inkubuj sferoidy z 50 mikrolitrami przeciwciał pierwszorzędowych przez godzinę.Po zakończeniu ostrożnie usuń nadmiar roztworu przeciwciał i przepłucz trzy płuczki pożywką. Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe, takie jak kozia anty-mysia IgG Cy3, kozia anty-mysia IgG 488 i królicza anty-kurczak IgG Texas Red w PBS z 1% BSA i dodać 50 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciała na studzienka przed 20 minutami inkubacji w inkubatorze dwutlenku węgla. Ponownie przemyć trzykrotnie pożywką przed 30 minutami inkubacji w inkubatorze.Włącz fluorescencyjne źródło światła 10 minut przed użyciem. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Użyj obiektywu z powiększeniem 4X, klikając przycisk 4X na pasku narzędzi, aby wybrać odpowiednią podziałkę.Następnie umieść 96-dołkową płytkę na środkowej płycie sceny. Włącz źródło światła LED, użyj filtra jasnego pola i ustaw płytkę w interesującej Cię studni za pomocą pokrętła regulacji stopnia osi XY. Zmień na ścieżkę światła kamery i kliknij przycisk na żywo w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyświetlić obraz na ekranie.Upewnij się, że sferoida jest wyśrodkowana za pomocą pokręteł osi XY i ustaw ostrość za pomocą pokrętła zgrubnego lub precyzyjnego ustawiania ostrości. Następnie wybierz metodę obserwacji w jasnym polu na pasku narzędzi, ustaw ekspozycję na automatyczną i kliknij przycisk migawki na panelu sterowania aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie zapisz zdjęcie jako plik vsi używając odpowiedniej nazwy w interesującym Cię folderze.Umieść płytkę ekranującą światło otoczenia, aby wyłączyć światło LED i wymień filtr na wzbudzenie B. Następnie wybierz metodę obserwacji 488. Otwórz migawkę, zrób zdjęcie, klikając przycisk migawki i zamknij migawkę i zapisz plik jako vsi.Powtórz proces z filtrem wzbudzenia G, aby powtórzyć proces dla każdego interesującego Cię dołka. Zmiany morfologiczne zachodzące w procesie różnicowania wątroby wykazały, że BD-PSC różnicują się w hepatocyty w trzech etapach. Pierwszy etap polegał na różnicowaniu się w komórki endodermalne.Drugie różnicowanie w komórkach progenitorowych wątroby wykazujących typową morfologię wielokątną. I trzecia, dojrzewanie do hepatocytów. Analiza immunofluorescencyjna wykazała silną ekspresję markerów progenitorowych ludzkiej wątroby endodermy, takich jak alfa fetoproteina lub APF i transtyretyna lub TTR w komórkach na pierwszym etapie procesu różnicowania wątroby w dniu od L4 do L8.Jednak ich ekspresja zmniejszyła się w L15 dniu. Ekspresja albuminy lub ALB i czynnika jądrowego hepatocytów czwartego alfa lub HNF4 alfa pojawiła się najpierw w L4, wzrosła w czasie różnicowania L4 do L15 i osiągnęła silną i stabilną ekspresję w czasie dojrzewania L15 do L24. Spontaniczną agregację komórek obserwowano na płytkach o niskim przyleganiu zawierających indukcję hepatocytów lub pożywkę dojrzewającą inicjowaną tworzeniem sferoidów.Zaobserwowano stałą korelację między sferoidą steroidową a zmienną liczbą komórek. Sferoidy uformowane i zróżnicowane w L14 i żywe barwione przeciwciałami ujawniły potencjalną aktywność funkcjonalną wątroby sferoidów pochodzących z BD-PSC. Przygotowanie komórek jednojądrzastych do przeprogramowania jest najważniejszym krokiem w tej procedurze.Generowanie sferoid ludzkiej wątroby jest pierwszym krokiem do stworzenia uproszczonej wersji narządu in vitro w 3D z mikroanatomią podobną do tej in vivo. Organoidy stworzone w laboratorium są wykorzystywane do badania organogenezy, rozwoju chorób i składników odżywczych.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Polega na przeszczepieniu ludzkich komórek wątroby oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych transgenicznej myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dośledzionowe, co prowadzi do wszczepienia komórek wątroby i rozwoju ludzkich komórek odpornościowych.

Opracowanie humanizowanego modelu myszy z ludzkimi komórkami wątroby i komórkami odpornościowymi

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Poznaj metodę generowania sferoidów wątroby z autologicznych komórek krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badania toksykologiczne, odkrywanie leków oraz zastosowania w medycynie regeneracyjnej.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Przeglądaj więcej filmów