Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Wirowanie laboratoryjne jest otwartym i ręcznym procesem, który jest trudny do skalowania. Nasz protokół pokazuje, jak zamknąć i zautomatyzować dysocjację, mycie i pobieranie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w jednym przebiegu. Konfiguracja jest prosta.

Cały proces może być przeprowadzony na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego w obiekcie klasy cGMP. Zamknięte, zautomatyzowane przetwarzanie komórek zmniejsza liczbę czynności związanych z ręczną obsługą, które mogą być podatne na ryzyko, i umożliwia zgodność z cGMP. Metoda ta może być stosowana do innych typów komórek ekspandowanych w wielowarstwowych systemach hodowli.

System wirowania przeciwprądowego umożliwia modyfikację dowolnych kroków protokołu dla różnych zastosowań. Procedurę tę zademonstruje dr Alan Lam, naukowiec z grupy bioprzetwarzania komórek macierzystych w Instytucie Technologii Bioprzetwarzania, A star w Singapurze. Aby rozpocząć montaż jednorazowego zestawu do wirowania przeciwprądowego, połącz zestaw jednorazowego użytku z jednorazowymi workami transferowymi z PVC za pomocą spawania rurowego, jak pokazano na rysunku.

Następnie, wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, przymocuj 10-warstwową wielowarstwową kolbę zawierającą zlewające się ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z galaretki Whartona lub HMSC Wharton's Jelly do niestandardowego zespołu rurek. Przenieś dołączone 10-warstwowe naczynie hodowlane z niestandardowym zespołem przewodów na stół i przyspawaj je do linii E zestawu jednorazowego użytku. Też. przyspawać sterylny port próbki do linii G zestawu jednorazowego użytku o wysokim przepływie.

Następnie podłącz linię żniwną H do sterylnej przynęty, wyposażonej w 50-mililitrową strzykawkę. Aby skonfigurować działanie instrumentu, włącz go za pomocą przełącznika z tyłu instrumentu i podłącz laptopa do portu USBC w instrumencie za pomocą dostarczonego USBC. Uruchom graficzny interfejs użytkownika wirówki przeciwprądowej lub oprogramowanie GUI z pulpitu lub menu Start i zaloguj się.

Następnie załaduj protokół, klikając przycisk Wybierz protokół na głównej stronie powitalnej. Następnie naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na przyrządzie i otwórz szklane drzwiczki, aby załadować zmontowany zestaw jednorazowego użytku do systemu wirowania przeciwprądowego. Zacznij od zawieszenia toreb na haczykach wieszaków w kolejności, która najlepiej pokrywa je z portami rurkowymi na paskach czujnika pęcherzykowego, z 10-warstwową wielowarstwową kolbą umieszczoną pod kątem.

Dopasuj zestaw do dwóch przycisków lokalizacji zestawu. Rozciągnij rurkę pompy wokół pompy perystaltycznej i wciśnij białe złącze w kształcie bańki na miejsce. Zamocuj komorę wirówki, podnosząc srebrną dźwignię wspornika komory wirówki przeciwprądowej i zabezpieczając ją, ustawiając dźwignię w pozycji pionowej.

Wciśnij rurkę z każdego portu w zestawie do ścieżek wzdłuż pasków czujnika pęcherzykowego. Zamknij drzwi, naciskając zatrzask drzwi. Naciśnij przycisk Inicjuj w graficznym interfejsie użytkownika.

Pojawi się lista kontrolna. Pierwsze cztery elementy to kontrole instrumentów, podczas gdy ostatnie dwa to kontrole użytkownika. W tym momencie upewnij się, że worki i połączenia są zgodne z obrazem zestawu, a ręczna zaciski są otwarte.

Naciśnij przycisk Potwierdź, aby wyświetlić ekran Wejścia protokołu. Ustaw wartość w oknie dialogowym wprowadzania danych lub objętości zbioru na 45 mililitrów i naciśnij Potwierdź. Naciśnij zielony przycisk start na instrumencie, aby rozpocząć działanie protokołu.

Po zakończeniu wstępnego zalewania upewnij się, że zużyte podłoże zostało całkowicie wypompowane do worka na odpady. W krokach pauzy, jak zaznaczono w tabeli przepływu pracy, podnieś wielowarstwową kolbę do góry i potrząśnij nią, aby równomiernie rozprowadzić bufor na wszystkie tace. Po zakończeniu umieść 10-warstwową wielowarstwową kolbę z powrotem w pierwotnej pozycji rysowania, aby przejść do następnych kroków.

W krokach 20 i 23 upewnij się, że trypsynizowane komórki zostały całkowicie przeniesione do worka pośredniego. Dobrze wymieszaj worek pośredni ręcznie w kroku 25. W kroku 26 użyj dwumililitrowej strzykawki z przynętą, aby pobrać próbkę przez port pobierania próbek.

W krokach 29 i 30 sprawdź stabilne tworzenie się fluidyzacyjnego łoża komórek. Powinno być jak pokazane tutaj fluidalne złoże komórkowe. Przebieg jest zakończony na rampie do zatrzymania, a wszystkie wartości szczypania w systemie wirowania przeciwprądowego zamkną się automatycznie.

Po zakończeniu działania protokołu naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na instrumencie i otwórz szklane drzwi. Aseptycznie uszczelnić linię pobierania za pomocą ręcznej zgrzewarki do probówek i ostrożnie przenieść szczelnie zapieczętowaną strzykawkę wypełnioną skoncentrowanym pobraniem komórek do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu zliczenia komórek i kriokonserwacji. Ponownie odłącz komorę za pomocą dźwigni.

Wyciągnij złącze żarówki z oprawy i ostrożnie wyjmij zestaw i wrzuć go do torby na wypadek zagrożenia biologicznego. Wyczyść instrument chusteczkami na etanol i zamknij drzwi. Na koniec najpierw zamknij aplikację GUI, a nie wyłącz przełącznik z tyłu instrumentu.

M.d.com Wharton's Jelly rozmnażały się dobrze, gdy były rozprężane zarówno w pożywkach zawierających surowicę, jak i bezzawierających surowicy, wolnych od kseno. Jednak osoby w pożywce wolnej od surowicy i ksenotypu wykazywały nieco dłuższą morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą fibroblasty, z większą średnią wielkością komórek wynoszącą 17 mikronów, w porównaniu do 15 mikronów w pożywce surowicy. W obu pożywkach we wszystkich trzech przejściach, HMSC Wharton's Jelly konsekwentnie osiągały maksymalną gęstość komórek około 23 000 komórek na centymetr kwadratowy i czas podwojenia populacji wynoszący 34 godziny.

Kiedy HMSC Wharton's Jelly zostały rozprężone w 10-warstwowych naczyniach hodowlanych przy użyciu zademonstrowanego wirowania przeciwprądowego, osiągnięto dziesięciokrotne zmniejszenie objętości, generując stężenie komórek sięgające 5,3 miliona komórek na mililitr. Protokół konsekwentnie osiągał wysoką regenerację komórek wynoszącą około 98% i wysoką żywotność komórek wynoszącą około 99% przez trzy niezależne serie. HMSC Wharton's Jelly zebrane przy użyciu obu metod wykazywały charakterystyczne profile markerów powierzchniowych, które są dodatnie CD73, CD90 i CD105, a także ujemne CD34 i CD45.

Komórki zebrane z wirowania przeciwprądowego wykazywały podobny test fibroblastów tworzących kolonie lub potencjał CFU, w porównaniu z tymi zebranymi przez wirowanie ręczne. W obu metodach komórki zachowały zdolność różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty. Profile wydzielania cytokin w komórkach po odwirowaniu przeciwprądowym były porównywalne z wirowaniem przed przepływem.

Upewnij się, że zestaw jednorazowego użytku został skompletowany w odniesieniu do konfiguracji łóżka, umieść go w tym konstruktorze protokołu systemu centryfuzji przeciwprądowej. Protokół wymywania zanieczyszczeń resztkowych z produktu końcowego może być stosowany w zastosowaniach klinicznych w celu wsparcia użytkowników w spełnieniu kryteriów dopuszczenia partii do obrotu. Aby przyspieszyć proces przenoszenia płynów do przetwarzania na dużą skalę, można użyć zewnętrznych pomp do przeniesienia trypsynizowanej zawartości do worka transferowego, zamiast bezpośredniego zbierania z wielowarstwowej kolby.