Name: Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj protokół zamkniętego, zautomatyzowanego pobierania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu systemu kontrprądowej wirówki. Metoda zapewnia 98% odzysk komórek i 99% żywotność, spełniając standardy cGMP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony funduszy Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 i H18/AH/a0/001) z A*STAR, Singapur.

<ol><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24(2021).</li>
<li>García-Bernal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+status+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+Controversies%2C+unresolved+issues+and+some+promising+solutions+to+improve+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664(2021).</li>
<li>Mastrolia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+clinical+development+of+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%3A+Concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+overview+of+global+trends+in+MSC-based+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).</li>
<li>Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC+manufacturing+for+academic+clinical+trials%3A+From+a+clinical-grade+to+a+full+GMP-compliant+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process.</a> Cells. 10, 1320(2021).</li>
<li>Fernández-Santos, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mesenchymal+stromal+cell+%28MSC%29+manufacturing+processes+for+a+better+therapeutic+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome.</a> Frontiers in Immunology. 13, 918565(2022).</li>
<li>Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+human+mesenchymal+stem+cells+at+clinical+scale%3A+Process+and+regulatory+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).</li>
<li>Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+translational+mesenchymal+stromal+cell+therapy+through+consistent+quality+GMP+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472(2021).</li>
<li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), (2020).</li>
<li>Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+translational+considerations+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease.</a> npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20(2020).</li>
<li>Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hurdles+to+uptake+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+progenitors+in+therapeutic+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products.</a> Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li>
<li>Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+automation+for+the+production+of+clinical-grade+mesenchymal+stromal+cells%3A+The+AUTOSTEM+robotic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform.</a> Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).</li>
<li>Doulgkeroglou, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%2C+monitoring%2C+and+standardization+of+cell+product+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).</li>
<li>Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy%3A+Achievements+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).</li>
<li>Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouto%2C+PS+%22Engineering+Strategies+for+Regenerative+Medicine%22">Engineering Strategies for Regenerative Medicine</a>. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).</li>
<li>Tsai, A. -C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells%3A+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96(2021).</li>
<li>Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+considerations+in+scaling+up+therapeutic+cell+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 654(2020).</li>
<li>Mizukami, A., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+From+discovery+to+manufacturing+and+commercialization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization.</a> Stem Cells International. 2018, 4083921(2018).</li>
<li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2020, 9529465(2020).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+automated+cell+washing+and+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Advances in automated cell washing and concentration.</a> Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).</li>
<li>Mehta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+centrifugation+solution+for+volume+reduction+and+cell+washing+process+in+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing.</a> Cytotherapy. 16, Supplement 101(2014).</li>
<li>Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy%3A+cGMP+facilities+and+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Muscles+Ligaments+and+Tendons+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing.</a> Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).</li>
<li>Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing%3A+From+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Li, A., James, D., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gibco%E2%84%A2+CTS%E2%84%A2+Rotea%E2%84%A2+system+story-A+case+study+of+industry-academia+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration.</a> Gene Therapy. , (2021).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+viability+using+counterflow+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation.</a> Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+counterflow+centrifugal+system+for+small-scale+cell+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60423(2019).</li>
<li>Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NucleoCounter-An+efficient+technique+for+the+determination+of+cell+number+and+viability+in+animal+cell+culture+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes.</a> Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).</li>
<li>Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+flow+cytometry+for+the+characterisation+of+extracellular+markers+on+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).</li>
<li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+manufacturing+for+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Hematologic+Malignancy+Reports%22%5BJournal%5D)">Towards automated manufacturing for cell therapies.</a> Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).</li>
<li>Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+cell+therapy+manufacturing%3B+it%27s+not+for+everyone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34(2022).</li>
</ol>

P.J., A.B., R.L. i J.N. są pracownikami Thermo Fisher Scientific. A.L. i S.O. nie pozostają w konflikcie interesów.

W tej pracy wykazaliśmy zdolność do zamykania i półautomatyzacji dysocjacji hMSC oraz mycia i zbioru na stole za pomocą przyrządu do wirowania przeciwprądowego. Jednym z krytycznych kroków w całym przepływie pracy jest upewnienie się, że rurki są podłączone zgodnie z wstępnie ustawionym protokołem zdefiniowanym w konstruktorze protokołów systemu wirowania przeciwprądowego. Konfiguracja i obsługa są proste, a czas potrzebny na przetworzenie około 2 litrów kultury z 10-warstwowej kolby od montażu zestawu do zbioru komórek wynosił około 60 minut. Jednym z etapów ograniczających w tym przepływie pracy jest przenoszenie płynu z wielowarstwowej kolby do worków transferowych połączonych z przyrządem do wirowania przeciwprądowego. Jednorazowy zestaw o wysokim przepływie może pracować tylko przy maksymalnym natężeniu przepływu 165 ml/min, co może być trudne w przypadku przetwarzania, na przykład kolby 40-warstwowej. Aby przyspieszyć proces przenoszenia płynu, można użyć zewnętrznych pomp o dużym przepływie, aby najpierw przenieść trypsynizowaną zawartość do worka transferowego, a następnie umyć/zagęścić i zebrać komórki z worka transferowego za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Co więcej, protokół ten może być również stosowany do pasażowania komórek od 4-warstwowych do 10-warstwowych kolb wielowarstwowych. W dalszej części łańcucha dostaw system wirowania przeciwprądowego można również zoptymalizować pod kątem mycia rozmrożonych hMSC oraz bezpośredniego zbioru i preparatu do wielowarstwowych kolb w celu uruchomienia układu nasion. Należy zauważyć, że minimalna liczba komórek wymagana do uformowania złoża fluidalnego w komorze wirowania przeciwprądowego wynosi około 30 milionów komórek, a maksymalna zalecana objętość do przetworzenia na partię wynosi 20 l.
Obecnie mocowanie niestandardowego zespołu przewodów do wielowarstwowej kolby w komorze bezpieczeństwa biologicznego i autoklawowanie części komponentów nie jest pożądane w warunkach cGMP. Alternatywnie, niestandardowy zespół rurek sterylizowanych promieniami gamma można zlecić dostawcom. Dostawcy dostarczający kolby wielowarstwowe oferują również możliwość wstępnego wyposażenia kolb w żądane zespoły przewodów, w tym filtr 0,2 μm, oraz sterylizację promieniami gamma całego zestawu. Zapewniłoby to, że wielowarstwowe kolby i dołączone rurki są naprawdę zamknięte, co oznacza, że proces mógłby zostać zakończony na stole w pomieszczeniu czystym klasy C.
Proces ten wykorzystujący system wirowania przeciwprądowego nie ogranicza się do hodowanych komórek na bazie adherentów w wielowarstwowym naczyniu i może być dostosowany do dynamicznych (bioreaktory zbiornikowe z mieszadłem lub falowe) i statycznych (przepuszczalnych dla gazu) platform do rozprężania komórek opartych na zawiesinie. W szczególności, w przypadku hMSC namnażonych w kulturach mikronośników 3D, protokoły w systemie wirowania przeciwprądowego mogą być optymalizowane w celu zbierania, mycia i formułowania hMSC oddzielonych od mikronośników. 
Ogólnie rzecz biorąc, rosnące zainteresowanie opracowywaniem translacyjnych terapii komórkowych o zwiększonej odporności i niezawodności procesów doprowadziło do opracowania zamkniętych, zautomatyzowanych platform przetwarzania komórek. Systemy te są niezbędne, ponieważ zmniejszają liczbę etapów obsługi, zapobiegają potencjalnemu zanieczyszczeniu przez sterylne połączenia i obniżają koszty produkcji poprzez zmniejszenie nakładu pracy i zwiększenie efektywnego wykorzystania przestrzeni w pomieszczeniach czystych21. W związku z tym wielu twórców produktów terapii komórkowej, którzy starają się o zgodę organów regulacyjnych na tłumaczenie swoich terapii, zdaje sobie sprawę z tego, jak ważne jest zamknięcie procesu i wdrożenie pełnej automatyzacji lub półautomatyzacji już na etapie rozwoju procesu 14,31,32.
Dzięki zastosowaniu przyjaznej dla przepisów pożywki SFM XF oraz wraz z odczynnikami pomocniczymi zgodnymi z 21 CFR GMP Part 11 i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi jakości, ten półautomatyczny proces byłby z łatwością odpowiedni do produkcji klinicznej. Wykazaliśmy powtarzalność procesu zamkniętego i utrzymanie jakości WJ-MSC. Poprawa wydajności i bezpieczeństwa hodowli komórek opartych na adherentach w wielowarstwowych kolbach przyniosłaby korzyści nie tylko dziedzinie terapii hMSC, ale także firmom zajmującym się bankowaniem linii komórkowych i produkcją wirusów adherentnych.

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są doskonałym kandydatem do zastosowań klinicznych, zarówno w inżynierii tkankowej, jak i w terapiach komórkowych, biorąc pod uwagę ich potencjał terapeutyczny i wysoki potencjał samoodnawiania się do wzrostu in vitro, które są kluczowe dla generowania klinicznie istotnych dawek komórek1,2,3. Według ClinicalTrials.gov, obecnie prowadzonych jest ponad 1000 badań klinicznych dotyczących różnych stanów chorobowych4. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie wykorzystaniem hMSC, w najbliższej przyszłości planowane są kolejne badania kliniczne i zatwierdzenia rynkowe5,6. Jednak produkcja hMSC wiąże się z wieloma nieodłącznymi wyzwaniami pod względem zmienności między partiami, wykorzystaniem surowców wysokiego ryzyka, obawami dotyczącymi zanieczyszczenia spowodowanego wieloma otwartymi i ręcznymi procesami, ponieważ produkcja obejmuje wiele operacji jednostkowych, wyższymi kosztami pracy, kosztem skalowania w poziomie lub zwiększania skali oraz przeszkodami regulacyjnymi6,7,8,9,10,11,12. Kwestie te nadal stanowią istotną barierę dla obecnego i przyszłego dostępu do rynku.
Rozwój zamkniętych, modułowych, zautomatyzowanych rozwiązań produkcyjnych i użycie odczynników pomocniczych niskiego ryzyka rozwiązałoby te wyzwania. Zapewniłoby to również stałą jakość produktu, zmniejszyłoby prawdopodobieństwo awarii partii z powodu błędu ludzkiego, zmniejszyłoby koszty pracy oraz poprawiło standaryzację procesów i zgodność z przepisami, na przykład w zakresie cyfrowego prowadzenia ewidencji partii8,12,13,14. Aby móc uzyskać klinicznie istotną dawkę komórek, niezależnie od tego, czy jest to autologiczna, czy allogeniczna, kluczowe znaczenie ma usprawniona produkcja, która obejmuje ekspansję komórek i dalsze przetwarzanie w zamknięty, zautomatyzowany sposób.
Dla rozbudowy hMSC, dwie najczęściej stosowane obecnie metody produkcji to scale-out (monolayer 2D) i scale-up (system zawieszenia oparty na mikronośnikach 3D)15,16,17,18. Najbardziej tradycyjną i szeroko stosowaną metodą rozbudowy hMSC jest hodowla 2D oparta na monowarstwach ze względu na niskie koszty produkcji i łatwość konfiguracji19.
Wielowarstwowe kolby składające się z tac o płaskiej powierzchni ułożonych w naczyniu hodowlanym są powszechnie wykorzystywane do zwiększania skali produkcji hMSC. Systemy te są zazwyczaj dostępne w 1-warstwowych do 40-warstwowych naczyniach hodowlanych20 i są obsługiwane ręcznie w szafach bezpieczeństwa biologicznego. Etapy przetwarzania podczas pasżowania i zbierania komórek obejmują ręczne dozowanie i dekantację pożywki eksplatacyjnej, odczynnika dysocjacyjnego i buforu płuczącego poprzez pipetowanie lub fizyczne przechylanie całego naczynia. Poza tym obsługa wielu jednostek jest trudna i czasochłonna ze względu na ich rozmiar i wagę.
Następnie, po zbiorach z wielowarstwowych kolb, wirowanie w celu wymiany pożywki, mycie komórek i redukcja objętości są niezbędnymi krokami w całym procesie produkcji komórek21. Konwencjonalne wirowanie stołowe jest w większości otwartym i ręcznym procesem, który obejmuje wiele etapów, takich jak przenoszenie zawiesiny komórek do zakorkowanych probówek lub butelek wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, obracanie komórek, ręczne zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie komórek za pomocą buforu i wielokrotne mycie komórek. To znacznie zwiększa zarówno ryzyko zanieczyszczenia z powodu otwierania i zamykania nasadek, jak i ryzyko utraty osadu komórkowego podczas ręcznego procesu aspiracji/pipetowania22. W kontekście obsługi wielowarstwowych systemów hodowli komórek opartych na adherentach, takich jak hMSC, operator musiałby przejść przez pracochłonny proces wielokrotnego przemieszczania się między wirówką a komorą bezpieczeństwa biologicznego i jednoczesnego przenoszenia ciężkiej jednostki. Te ręczne kroki są pracochłonne, stwarzają ryzyko w postaci błędów ludzkich i zanieczyszczenia i muszą być wykonywane w środowisku pomieszczenia czystego klasy B, co jest kosztowne23. Ponadto konwencjonalny proces ręcznego wirowania nie jest skalowalny i może powodować ścinanie i naprężenia komórkowe; W związku z tym maksymalizacja odzysku komórek, żywotności i skuteczności wymywania resztkowych zanieczyszczeń to inne główne wyzwania<klasa SUP="xref">22. Komercyjna produkcja terapii komórkowych na skalę cGMP wymaga zamkniętych, modułowych rozwiązań automatyzacji w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, zapewnienia stałej jakości produktu, zmniejszenia kosztów pracy i produkcji oraz zwiększenia niezawodności procesu24,25. Kolby wielowarstwowe mogą być obsługiwane jako system zamknięty dzięki sterylnemu filtrowi 0,2 μm w jednym z portów, który ułatwia sterylną wymianę gazową, a drugi port jest aseptyki podłączony za pomocą złączy lub przyspawany bezpośrednio do automatycznego urządzenia do przetwarzania komórek w celu pobierania komórek. Pracowaliśmy nad zamknięciem i zautomatyzowaniem większości etapów pasażowania i zbioru WJ-hMSC, oceniając innowacyjną wirówkę przeciwprądową przeznaczoną do wytwarzania produktów na bazie komórek, genów lub tkanek. Ta wirówka przeciwprądowa jest również elastyczna do wykonywania różnych zastosowań związanych z przetwarzaniem komórek, takich jak separacja komórek na podstawie rozmiaru, wymiana pożywki/buforu, stężenie i zbieranie dla różnych typów komórek8,26,27,28. Przyrząd wykorzystuje zamknięty zestaw jednorazowego użytku, który można sterylnie podłączyć za pomocą spawania rurowego lub aseptycznych łączników do przenoszenia worków lub można go podłączyć bezpośrednio do dowolnej platformy rozszerzeń.
W tym badaniu zaprojektowaliśmy niestandardowy zestaw przewodów, aby umożliwić zamknięte sterylne połączenia między jednorazowym zestawem do wirowania przeciwprądowego a wielowarstwową kolbą. Zoptymalizowaliśmy protokół enzymatycznego odłączania, mycia i zbierania WJ-MSC z wielowarstwowej kolby w całkowicie zamknięty i półautomatyczny sposób w ciągu jednego cyklu. Zebrane WJ-hMSC scharakteryzowano pod kątem czystości (analiza markerów powierzchniowych) i siły działania (CFU-F, różnicowanie trójliniowe i profile wydzielania cytokin), aby zapewnić, że produkt końcowy spełnia krytyczne atrybuty jakości (CQA) dla uwolnienia partii.

<table><tbody><tr><td>Worek transferowy 2L PVC</td><td>TerumoBCT</td><td>BB*B200TM</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski roztwór Alcian, pH 2,5</td><td>Merck</td><td>101647</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia alizaryny i czerwieni Merck</td><td></td><td>TMS-008-C</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie przeciwciało CD73</td><td>Biolegend</td><td>344015</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC IgG1 i kappa; Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>400121</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex MAGPIX Multiplex Multiplex System</td> wirowania <td>przeciwprądowego Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A47679</td><td>Gibco CTS Rotea System wirowania przeciwprądowego</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>CTS (L-alanylo-L-glutamina) Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>CTS Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>CTS Rekombinowana ludzka witronektyna (VTN-N)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>CTS TrypLE Select Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1285901</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy montaż</td> <td>przewodówSaint-Gobain and Colder Product Company (CPC)</td><td>N/A</td><td>Sterylizowane promieniami gamma 3/32" Linia ID PVC wyposażona w sterylny męski MPC (zadzior 1/8") i uszczelniona na drugim końcu. Autoklaw to krótka linia C-Flex wyposażona w sterylne złącze portu Cell Factory na jednym końcu i żeńskie MPC (zadzior 3/8") na drugim. Podłącz linie PVC i C-Flex w komorze bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Kapsułka Emflon II (filtr 0,2um)</td><td>Pall</td><td>KM5V002P2G100</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12662029</td><td>Regiony kwalifikowane do mezenchymalnych komórek macierzystych, zatwierdzone przez USDA</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzkie przeciwciało CD105</td><td>Biolegend</td><td>323203</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzkie przeciwciało CD45</td><td>Biolegend</td><td>304005</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzkie przeciwciało CD90 (Thy1)</td><td>Biolegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>FITC IgG1 myszy itp.; Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend</td><td></td><td>400109</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw jednorazowego użytku Hi-Flow</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A46575</td><td>Jednorazowy zestaw Gibco CTS Rotea Hi-flow, natężenie przepływu 30 &ndash; 165 mL/min</td></tr><tr><td>Systemy wielowarstwowe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140360 (4-warstwowe); 140410 (10-warstwowe)</td><td>Nunc Standard Cell Factory Systems</td></tr><tr><td>Licznik NucleoCounter NC-3000</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwiący O w kolorze czerwonym olejowym</td><td>Merck</td><td>102419</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0045</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD34 Biolegend</td><td></td><td>PerCP 343519</td><td></td></tr><tr><td>Mysz PerCP IgG1, &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>400147</td><td></td></tr><tr><td>ProcartaPlex Multipleksowe testy immunologiczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Niestandardowy panel 19-Plex: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1&alpha;, MIP-1&beta;, MIP-3&alpha;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1&alpha;, TGF&alpha;, TNF-alfa, VEGF-A&nbsp;</td></tr><tr><td>Port próbki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50111</td><td>Sterylizowany promieniami gamma port próbki leur z dołączonymi 2 liniami PVC</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania adipogenezy StemPro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Różnicowanie chondrocytów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ME20236L1</td><td>zawiera StemPro MSC SFM Basal Medium i niestandardowy suplement MSC SF XF (100x)</td></tr><tr><td>StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>T175 Nunc EasYFlask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T75 Nunc EasYFlask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG9204</td><td></td></tr><tr><td>WJ MSCs&nbsp;</td><td>Komórka PromoCell</td><td>(#C12971; Niemcy)</td> <td>Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste</td></tr> <tr><td>i alfa; Pożywka MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12571063</td><td>Z nukleozydami</td></tr></tbody></table>

przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są obecnie badane jako obiecująca metoda terapeutyczna oparta na komórkach dla różnych chorób, a w ciągu najbliższych kilku lat spodziewane są kolejne zatwierdzenia rynkowe do użytku klinicznego. Aby ułatwić to przejście, kluczowe znaczenie ma rozwiązanie problemów związanych ze skalą, odtwarzalnością między partiami, kosztami, zgodnością z przepisami i kontrolą jakości. Wyzwaniom tym można sprostać, zamykając proces i wdrażając zautomatyzowane platformy produkcyjne. W tym badaniu opracowaliśmy zamknięty i półautomatyczny proces pasażowania i zbierania hMSC pochodzących z galaretki Whartona (WJ) (WJ-hMSC) z wielowarstwowych kolb przy użyciu wirowania przeciwprądowego. WJ-hMSCs zostały namnażone przy użyciu zgodnej z przepisami pożywki wolnej od kseno-wirusa (SFM XF) i wykazały porównywalną proliferację komórek (podwojenie populacji) i morfologię do WJ-hMSC namnażanych w klasycznych pożywkach zawierających surowicę. Nasz zamknięty, półautomatyczny protokół zbioru wykazał wysoki odzysk komórek (~98%) i żywotność (~99%). Komórki umyte i zagęszczone za pomocą wirowania przeciwprądowego utrzymywały ekspresję markerów powierzchniowych WJ-hMSC, jednostki tworzące kolonie (CFU-F), potencjał różnicowania trójliniowego i profile wydzielania cytokin. Opracowany w ramach badania półautomatyczny protokół pobierania komórek może być łatwo stosowany do przetwarzania na małą i średnią skalę różnych komórek przylegających i zawiesinowych poprzez bezpośrednie połączenie z różnymi platformami do rozbudowy komórek w celu przeprowadzenia redukcji objętości, mycia i zbierania przy niskiej objętości wyjściowej.

Główny bank komórek (MCB) WJ-hMSC po rozmrożeniu utrzymywano przez trzy kolejne pasażu (p1-p4) w klasycznym medium zawierającym surowicę, aby uzyskać wystarczającą liczbę roboczych banków komórek (WCB) do eksperymentów. Robocze banki komórek p4 rozmrożono i namnażano zarówno w medium zawierającym surowicę, jak i w medium SFM XF przez kolejne trzy pasażu (p4-p7) w kolbach T-175. Komórki WJ-MSC dobrze zaadaptowały się podczas namnażania w medium SFM XF i były w stanie utrzymać stabilną proliferację zbliżoną do tej w medium zawierającym surowicę (Rysunek 2A). Jednak komórki namnażane w medium SFM XF wykazywały nieco bardziej wydłużoną, wrzecionowatą morfologię fibroblastopodobną, co skutkowało nieco większym rozmiarem komórek (Rysunek 2B) wynoszącym średnio ~17 µm w porównaniu do ~15 µm w medium zawierającym surowicę. W obu warunkach hodowli na przestrzeni trzech pasażu komórki WJ-hMSC konsekwentnie osiągały maksymalną gęstość komórek na poziomie ~2.3 x 104 komórek/cm2 oraz czas podwojenia populacji wynoszący ~34 h (Rysunek 2C,D).
W celu wielkoskalowej ekspansji WJ-hMSC w systemie zamkniętym przeprowadziliśmy ekspansję kaskadową WJ-hMSC najpierw w kolbie 4-warstwowej, a następnie w kolbie wielowarstwowej 10-warstwowej. Po 4 dniach hodowli, przy konfluencji wynoszącej około 80%-90%, zebraliśmy odpowiednio 9.6 x 107 ± 0.9 x 107 oraz 2.3 x 108 ± 0.2 x 108 komórek z kolb 4-warstwowych i 10-warstwowych. Osiągnięto wyższą gęstość komórek na poziomie 3.6 x 104-3.8 x 104 cells/cm2 w porównaniu do kolb T-175, co oznacza, że kolby wielowarstwowe umożliwiły lepszą ekspansję komórek, aż do siedmiokrotnego wzrostu.
Ponadto, WJ-hMSCs namnożone w 10-warstwowych naczyniach hodowlanych zostały zebrane bezpośrednio przy użyciu wirowania przeciwprądowego. Sterylne połączenie z zestawem jednorazowego użytku było łatwe do ustanowienia w celu bezpośredniego transferu cieczy z maksymalnym przepływem 165 mL/min przy użyciu perystaltycznej pompy urządzenia. Półautomatyczny proces zbioru komórek zrealizowano poprzez najpierw zebranie komórek za pomocą dysocjacji enzymatycznej, załadowanie komórek do komory przeciwprądowej w celu redukcji objętości i zagęszczenia, a następnie przemycie buforem piorącym, którego objętość stanowiła około 3-krotność objętości komory wirowania przeciwprądowego. Następnie przemyte komórki zostały zagęszczone i zebrane do pożądanej objętości zbioru określonej w protokole. Kroki przetwarzania wykorzystane w półautomatycznej obróbce komórek zostały zaprojektowane tak, aby naśladować manualny schemat zbioru. Osiągnięto 10-krotną redukcję objętości, co zaowocowało uzyskaniem stężeń komórek sięgających 5,3 miliona komórek/mL. Protokół pozwolił na uzyskanie wysokiej odzyskowalności komórek na poziomie ~98% oraz wysokiej żywotności komórek na poziomie ~99% konsekwentnie w trzech niezależnych powtórzeniach (Rysunek 3A-C).
Przeprowadzono rozległe testy charakterystyki komórkowej w celu określenia krytycznych parametrów jakościowych zbioru komórek uzyskanego za pomocą wirowania przeciwprądowego w porównaniu z wirowaniem ręcznym. Aby zweryfikować tożsamość WJ-hMSCs, analizowano markery powierzchniowe komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Rysunku 4A, komórki WJ-hMSCs zebrane obiema metodami wykazywały charakterystyczne profile markerów powierzchniowych zgodnie z regulacjami ISCT: pozytywną ekspresję CD73, CD90 i CD105, a także negatywną ekspresję CD34 i CD45. Następnie, aby ocenić potencjał klonogenny WJ-hMSCs, przeprowadzono testy CFU-F. Jak pokazano na Rysunku 4B, komórki zebrane za pomocą wirowania przeciwprądowego wykazały podobny potencjał CFU-F w porównaniu z komórkami zebranymi metodą wirowania ręcznego (odpowiednio 21% ± 1% vs. 20% ± 1%). Ponadto, jak przedstawiono na Rysunku 4C, komórki zebrane po wirowaniu przeciwprądowym zachowały zdolność do różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty, podobnie jak komórki w metodzie wirowania ręcznego. Na koniec zbadano profile wydzielania 18 różnych cytokin przez komórki przy użyciu testów immunoenzymatycznych typu multiplex. Jak pokazano na Rysunku 4D, komórki przemyte i skoncentrowane za pomocą wirowania przeciwprądowego utrzymały profile wydzielania cytokin, które były porównywalne z profilami prób pobranych przed przemyciem/skoncentrowaniem komórek (przed wirowaniem przeciwprądowym).
Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy efektywną ekspansję hMSC w systemie hodowlanym SFM XF, a komórki przemyte i skoncentrowane przy użyciu zamkniętego, zautomatyzowanego systemu wirowania przeciwprądowego charakteryzowały się wysokim odzyskiem i żywotnością po przemyciu oraz zachowały swój fenotyp i funkcjonalność. Zamknięty proces półautomatyczny opracowany w niniejszym badaniu może zapewnić spójną jakość produktu pod kątem końcowego odzysku WJ-MSC, co potwierdzono w trzech niezależnych seriach pomiarowych.
<img alt="Schemat układu przetwarzania komórek; niestandardowe rurki w kolbach wielowarstwowych; wyświetlacz GUI komory z zastosowaniem złoża fluidalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Konfiguracja i montaż zestawu jednorazowego o wysokim przepływie do zbioru, przemywania i zagęszczania hMSC. (A) Schemat zestawu po połączeniu worków w linii z odpowiednimi rurkami. (B) 10-warstwowa kolba wielowarstwowa połączona z jednorazowym zestawem o wysokim przepływie za pomocą niestandardowego układu rurek. (C) Wizualizacja stabilnego fluidalnego złoża komórkowego utworzonego w komorze przeciwprądowej poprzez funkcję kamery dostępną w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania do wirowania przeciwprądowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe, wykresy statystyczne WJ-MSC w surowicy i w pośrodkach SFM XF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Porównanie morfologii i ekspansji hMSC w pośrodku zawierającym surowicę oraz w pośrodku SFM XF. (A) Reprezentatywna morfologia hMSC w klasycznym pośrodku z surowicą oraz w pośrodku SFM XF. Komórki namnażane w SFM XF wykazywały dłuższą, wrzecionowatą, charakterystyczną morfologię fibroblastopodobną, podczas gdy komórki hodowane w pośrodku zawierającym surowicę wykazywały morfologię bardziej spłaszczoną. (B) Średni rozmiar MSC w pośrodku zawierającym surowicę i pośrodku SFM XF, zmierzony za pomocą automatycznego licznika komórek (n = 3). Wyraźnie widać, że komórki namnażane w SFM XF były ogólnie większe niż komórki namnażane w surowicy w różnych pasażach. Całkowita wydajność komórek w różnych pasażach (n= 3) (C) w przeliczeniu na liczbę komórek na powierzchnię hodowli oraz (D) poziomy podwojenia populacji. W różnych pasażach uzyskano podobne poziomy wydajności komórek w pośrodku SFM XF i pośrodku zawierającym surowicę. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Liczba żywych komórek i objętość po wirowaniu przeciwprądowym; dane na wykresach słupkowych przedstawiające stopień odzysku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Charakterystyka komórek przetworzonych przy użyciu systemu wirowania przeciwprądowego. (A) Całkowita liczba żywych komórek przed i po płukaniu i zagęszczaniu. (B) Po procesie wirowania przeciwprądowego osiągnięto 10-krotną redukcję objętości. (C) Całkowity odzysk i żywotność komórek. Dane stanowią średnią z trzech powtórzeń biologicznych (n = 3) cykli płukania i zagęszczania. Dane wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa, test różnicowania i analiza cytokin w porównaniu zbiorów komórek; wyniki na wykresach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64707/64707fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza krytycznych atrybutów jakości. (A) Reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej. (B) Reprezentatywne obrazy przedstawiające całkowitą liczbę CFU. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe różnicowania trzech linii komórkowych. (D) Wyniki analizy ekspresji cytokin przed i po przetworzeniu komórek w systemie wirówki przeciwprądowej (n = 3). Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/64707fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Kolejność etapów protokołu pozyskiwania hMSC poprzez trypsynizację, przemywanie i koncentrację w systemie wirowania przeciwprądowego, obejmująca początkowe kroki przygotowania systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64707/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół pobierania przylegających komórek z wielowarstwowych kolb w zamknięty półautomatyczny sposób za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Protokół ten może być stosowany do zbierania zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych z innych platform do rozbudowy komórek z niewielkimi modyfikacjami istniejących etapów.

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...

Wirowanie laboratoryjne jest otwartym i ręcznym procesem, który jest trudny do skalowania. Nasz protokół pokazuje, jak zamknąć i zautomatyzować dysocjację, mycie i pobieranie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w jednym przebiegu. Konfiguracja jest prosta.Cały proces może być przeprowadzony na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego w obiekcie klasy cGMP. Zamknięte, zautomatyzowane przetwarzanie komórek zmniejsza liczbę czynności związanych z ręczną obsługą, które mogą być podatne na ryzyko, i umożliwia zgodność z cGMP. Metoda ta może być stosowana do innych typów komórek ekspandowanych w wielowarstwowych systemach hodowli.System wirowania przeciwprądowego umożliwia modyfikację dowolnych kroków protokołu dla różnych zastosowań. Procedurę tę zademonstruje dr Alan Lam, naukowiec z grupy bioprzetwarzania komórek macierzystych w Instytucie Technologii Bioprzetwarzania, A star w Singapurze. Aby rozpocząć montaż jednorazowego zestawu do wirowania przeciwprądowego, połącz zestaw jednorazowego użytku z jednorazowymi workami transferowymi z PVC za pomocą spawania rurowego, jak pokazano na rysunku.Następnie, wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, przymocuj 10-warstwową wielowarstwową kolbę zawierającą zlewające się ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z galaretki Whartona lub HMSC Wharton's Jelly do niestandardowego zespołu rurek. Przenieś dołączone 10-warstwowe naczynie hodowlane z niestandardowym zespołem przewodów na stół i przyspawaj je do linii E zestawu jednorazowego użytku. Też. przyspawać sterylny port próbki do linii G zestawu jednorazowego użytku o wysokim przepływie.Następnie podłącz linię żniwną H do sterylnej przynęty, wyposażonej w 50-mililitrową strzykawkę. Aby skonfigurować działanie instrumentu, włącz go za pomocą przełącznika z tyłu instrumentu i podłącz laptopa do portu USBC w instrumencie za pomocą dostarczonego USBC. Uruchom graficzny interfejs użytkownika wirówki przeciwprądowej lub oprogramowanie GUI z pulpitu lub menu Start i zaloguj się.Następnie załaduj protokół, klikając przycisk Wybierz protokół na głównej stronie powitalnej. Następnie naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na przyrządzie i otwórz szklane drzwiczki, aby załadować zmontowany zestaw jednorazowego użytku do systemu wirowania przeciwprądowego. Zacznij od zawieszenia toreb na haczykach wieszaków w kolejności, która najlepiej pokrywa je z portami rurkowymi na paskach czujnika pęcherzykowego, z 10-warstwową wielowarstwową kolbą umieszczoną pod kątem.Dopasuj zestaw do dwóch przycisków lokalizacji zestawu. Rozciągnij rurkę pompy wokół pompy perystaltycznej i wciśnij białe złącze w kształcie bańki na miejsce. Zamocuj komorę wirówki, podnosząc srebrną dźwignię wspornika komory wirówki przeciwprądowej i zabezpieczając ją, ustawiając dźwignię w pozycji pionowej.Wciśnij rurkę z każdego portu w zestawie do ścieżek wzdłuż pasków czujnika pęcherzykowego. Zamknij drzwi, naciskając zatrzask drzwi. Naciśnij przycisk Inicjuj w graficznym interfejsie użytkownika.Pojawi się lista kontrolna. Pierwsze cztery elementy to kontrole instrumentów, podczas gdy ostatnie dwa to kontrole użytkownika. W tym momencie upewnij się, że worki i połączenia są zgodne z obrazem zestawu, a ręczna zaciski są otwarte.Naciśnij przycisk Potwierdź, aby wyświetlić ekran Wejścia protokołu. Ustaw wartość w oknie dialogowym wprowadzania danych lub objętości zbioru na 45 mililitrów i naciśnij Potwierdź. Naciśnij zielony przycisk start na instrumencie, aby rozpocząć działanie protokołu.Po zakończeniu wstępnego zalewania upewnij się, że zużyte podłoże zostało całkowicie wypompowane do worka na odpady. W krokach pauzy, jak zaznaczono w tabeli przepływu pracy, podnieś wielowarstwową kolbę do góry i potrząśnij nią, aby równomiernie rozprowadzić bufor na wszystkie tace. Po zakończeniu umieść 10-warstwową wielowarstwową kolbę z powrotem w pierwotnej pozycji rysowania, aby przejść do następnych kroków.W krokach 20 i 23 upewnij się, że trypsynizowane komórki zostały całkowicie przeniesione do worka pośredniego. Dobrze wymieszaj worek pośredni ręcznie w kroku 25. W kroku 26 użyj dwumililitrowej strzykawki z przynętą, aby pobrać próbkę przez port pobierania próbek.W krokach 29 i 30 sprawdź stabilne tworzenie się fluidyzacyjnego łoża komórek. Powinno być jak pokazane tutaj fluidalne złoże komórkowe. Przebieg jest zakończony na rampie do zatrzymania, a wszystkie wartości szczypania w systemie wirowania przeciwprądowego zamkną się automatycznie.Po zakończeniu działania protokołu naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na instrumencie i otwórz szklane drzwi. Aseptycznie uszczelnić linię pobierania za pomocą ręcznej zgrzewarki do probówek i ostrożnie przenieść szczelnie zapieczętowaną strzykawkę wypełnioną skoncentrowanym pobraniem komórek do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu zliczenia komórek i kriokonserwacji. Ponownie odłącz komorę za pomocą dźwigni.Wyciągnij złącze żarówki z oprawy i ostrożnie wyjmij zestaw i wrzuć go do torby na wypadek zagrożenia biologicznego. Wyczyść instrument chusteczkami na etanol i zamknij drzwi. Na koniec najpierw zamknij aplikację GUI, a nie wyłącz przełącznik z tyłu instrumentu.M.d.com Wharton's Jelly rozmnażały się dobrze, gdy były rozprężane zarówno w pożywkach zawierających surowicę, jak i bezzawierających surowicy, wolnych od kseno. Jednak osoby w pożywce wolnej od surowicy i ksenotypu wykazywały nieco dłuższą morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą fibroblasty, z większą średnią wielkością komórek wynoszącą 17 mikronów, w porównaniu do 15 mikronów w pożywce surowicy. W obu pożywkach we wszystkich trzech przejściach, HMSC Wharton's Jelly konsekwentnie osiągały maksymalną gęstość komórek około 23 000 komórek na centymetr kwadratowy i czas podwojenia populacji wynoszący 34 godziny.Kiedy HMSC Wharton's Jelly zostały rozprężone w 10-warstwowych naczyniach hodowlanych przy użyciu zademonstrowanego wirowania przeciwprądowego, osiągnięto dziesięciokrotne zmniejszenie objętości, generując stężenie komórek sięgające 5,3 miliona komórek na mililitr. Protokół konsekwentnie osiągał wysoką regenerację komórek wynoszącą około 98% i wysoką żywotność komórek wynoszącą około 99% przez trzy niezależne serie. HMSC Wharton's Jelly zebrane przy użyciu obu metod wykazywały charakterystyczne profile markerów powierzchniowych, które są dodatnie CD73, CD90 i CD105, a także ujemne CD34 i CD45.Komórki zebrane z wirowania przeciwprądowego wykazywały podobny test fibroblastów tworzących kolonie lub potencjał CFU, w porównaniu z tymi zebranymi przez wirowanie ręczne. W obu metodach komórki zachowały zdolność różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty. Profile wydzielania cytokin w komórkach po odwirowaniu przeciwprądowym były porównywalne z wirowaniem przed przepływem.Upewnij się, że zestaw jednorazowego użytku został skompletowany w odniesieniu do konfiguracji łóżka, umieść go w tym konstruktorze protokołu systemu centryfuzji przeciwprądowej. Protokół wymywania zanieczyszczeń resztkowych z produktu końcowego może być stosowany w zastosowaniach klinicznych w celu wsparcia użytkowników w spełnieniu kryteriów dopuszczenia partii do obrotu. Aby przyspieszyć proces przenoszenia płynów do przetwarzania na dużą skalę, można użyć zewnętrznych pomp do przeniesienia trypsynizowanej zawartości do worka transferowego, zamiast bezpośredniego zbierania z wielowarstwowej kolby.

human-mesenchymal-stem-cell-processing-for-clinical-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Sharma, A. D., et.al. Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych. J. Vis. Exp. (2015)Film ten pokazuje proces charakteryzowania transgenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych zaprojektowanych do ekspresji terapeutycznych czynników neurotroficznych. Przedstawiono w nim etapy związane z utrwalaniem, przepuszczalnością i barwieniem komórek za pomocą pierwszorzędowych...

Charakterystyka genetycznie modyfikowanych mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań neuroterapeutycznych

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Mezenchymalne komórki macierzyste są zwykle pozyskiwane ze szpiku kostnego i wymagają hodowli ekspansywnej. Gdy próbki krzepną przed przetworzeniem, można zastosować protokół z użyciem (enzymatycznej) urokinazy leku trombolitycznego w celu degradacji skrzepu. W ten sposób komórki są uwalniane i dostępne do hodowli ekspansyjnej. Protokół ten stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla ponownego próbkowania.

Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Poznaj protokół zamkniętego, zautomatyzowanego pobierania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu systemu kontrprądowej wirówki. Metoda zapewnia 98% odzysk komórek i 99% żywotność, spełniając standardy cGMP.

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Przeglądaj więcej filmów