Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

Protokoły zapewniają metodę badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej powierzchni nanocząstek i nanostruktur od badań wstępnych do bardziej złożonych badań powierzchni. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, które zaowocowały nieporównywalnymi danymi z różnych badań, metody te dają spójne i porównywalne wyniki dla różnych materiałów nanocząsteczkowych, materiałów nanostrukturalnych i gatunków drobnoustrojów. Utrzymanie jednorodnego rozkładu nanocząstek w metodach A i B może być trudne.

Dokładne wirowanie próbek zapewni zawieszenie nanocząstek, a pipetowanie trzy do czterech razy między podwielokrotnościami utrzyma zawiesiny Rozpocznij zbieranie hodowanych bakterii od porcjowania jednego mililitra wyhodowanej przez noc kultury bakteryjnej do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Po wytworzeniu wystarczającej liczby porcji należy je odwirować, aby osiągnąć pożądaną gęstość osadzenia. Zebrać szwadron szwadronu do pojemnika zbiorczego.

I ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 mililitra świeżej pożywki wzrostowej. Połącz zawiesinę z dwóch probówek i powtórz wirowanie. Po odwirowaniu należy ponownie przepłukać je świeżą pożywką wzrostową i powtórzyć łączenie zawartości z dwóch probówek w jedną przed odwirowaniem probówek.

Trzecie przepłukanie należy podać 0,33 mililitra buforu tris lub buforu hydroksyetyloaminometanowego. Połącz trzy zawiesiny, każda o objętości 0,33 mililitra, w jedną mikrowirówkę o pojemności 1,5 mililitra. Po odwirowaniu usuń supernatant z granulowanych komórek i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze świeżego buforu tris, który będzie znany jako zawiesina komórek lub kultura bakterii w fazie opóźnionej.

Aby utworzyć kultury bakterii i nanocząstek, należy podwielokrotnić dwa mililitry kultury wysiewu bakterii w każdym dołku 12-dołkowej płytki polistyrenowej niepoddanej działaniu tkanek. Na każde pięciomililitrowe mikroprobówkę wirówkową zawierającą wstępnie zważone cząstki tlenku magnezu dodać trzy mililitry bakteryjnej kultury siewnej. I krótko przekręć rurkę, aby wymieszać nanocząsteczki tlenku magnezu z bakteriami.

Po wymieszaniu podnieś jeden mililitr zawiesiny nanocząstek tlenku magnezu do trzech oddzielnych studzienek, aby utworzyć potrójne próbki każdej z góry zmierzonej masy nanocząstek tlenku magnezu. Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min. I przenieś trzymililitrową próbkę do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów za pomocą pipety.

Następnie wykonać od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, dodając 180 mikrolitrów buforu tris do każdej studzienki w rzędzie B do rzędu G dla odpowiedniej liczby kolumn. Krótko zmieszać 15-mililitrową stożkową rurkę zawierającą próbki bakteryjne i dodać 50 mikrolitrów próbki bakteryjnej do pojedynczej studzienki w rzędzie A. Następnie, z rzędu A, przenieś 20 mikrolitrów próbki bakteryjnej do odpowiedniego dołka rzędu B z krótkim mieszaniem. Za pomocą sterylnej końcówki pipety przenieś 20 mikrolitrów z dołka w rzędzie B do odpowiedniego dołka w rzędzie C. Kontynuuj to do rzędu G, aby zakończyć seryjne rozcieńczanie od 10 do ujemnego w rzędzie B do 10 do ujemnych sześciu w rzędzie G. Po zakończeniu odpipetować 100 mikrolitrów z każdej studzienki do odpowiedniej płytki z agarem wzrostowym, i rozprowadzić na płytce, aby rozproszyć kulturę komórkową.

Umieść płytki studzienkowe w wytrząsarce inkubatora na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Zbadaj płytkę i policz płytki zawierające około 25 do 300 kolonii. Jeśli to możliwe, wybierz płytki o tej samej wartości rozcieńczenia.

Dla każdego badanego materiału należy rozcieńczyć próbki bakterii przez noc, dodając trzy podwielokrotności o pojemności 200 mikrolitrów do pożywki wzrostowej do trzech studzienek i trzy podwielokrotności po 200 mikrolitrów kultury bakteryjnej do dodatkowych studzienek. Umieść 96-dołkową płytkę w czytniku płytek i zeskanuj ją. W razie potrzeby kontynuuj dodawanie bulionu lub nocnej kultury bakteryjnej, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach lub OD 600 zostanie osiągnięta około 0,01.

Aby przygotować zawiesiny nanocząstek bakteryjnych i zawiesiny nanocząstek w pożywkach sterylnych, należy usunąć jeden mililitr kultury bakteryjnej lub pożywki z potrójnego zestawu 15-mililitrowych stożkowych probówek. I dodaj go do pięciomililitrowej probówki wirówkowej zawierającej wstępnie zmierzone nanocząstki. Wiruj probówki, aby wymieszać roztwór.

Rozprowadź nanocząstki jednorodnie, przenosząc jedną mililitrową porcję z pięciomililitrowej probówki wirówkowej do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po zakończeniu podwielokrotność 200 mikrolitrów każdej próbki do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Po określeniu opisanej wcześniej gęstości osadzenia, dodać próbki i kontrolę do poszczególnych studzienek 48-dołkowej płytki polistyrenowej niepoddanej obróbce tkankowej.

Następnie podwielokrotność 0,75 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej studzienki zawierającej próbki i kontrole. Umieścić 48-dołkową płytkę w inkubatorze na 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 120 obr./min. Po inkubacji zbierz dwie próbki z każdej grupy i przenieś je pojedynczo do oznakowanych pięciomililitrowych mikroprobówek wirówkowych.

Dodaj dwa mililitry poprawionego symulowanego płynu ustrojowego lub RSBF do każdej probówki. Przygotuj wysterylizowane bibułki z podazotu celulozy, przycinając je do jednego centymetra średnicy. Umieść pocięty papier nitrocelulozowy na płytce agarowej zawierającej odpowiednie podłoże.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonej kultury bakteryjnej na bibułę filtracyjną przed dodaniem 50 mikrolitrów odpowiedniego podłoża do środka każdej powierzchni próbki. Za pomocą wysterylizowanej pęsety podnieś azotowy papier celozowy z powierzchni ślimaka. Ostrożnie odwróć papier celulozowy azotowy i umieść go na powierzchni próbki, tak aby bakterie miały kontakt z 50 mikrolitrami pożywki i badaną powierzchnią nanostrukturalną.

Jeśli próbka ulega degradacji w hodowli, umieść pod nią uchwyt, aby ją podnieść, aby uniknąć kontaktu z buforem tris. Utrzymuj wilgotność, dodając jeden mililitr buforu tris do próbki zawierającej studzienkę. Po całonocnej inkubacji zebrać bibułę nitrocelulozową z każdej powierzchni próbki i umieścić je w pięciu mililitrach buforu tris.

Wiruj zebrane bibuły filtracyjne i próbki materiału nanopowierzchniowego przez pięć sekund. Zebrać zawiesiny buforowe tris z próbki i umieścić je w oddzielnych świeżych probówkach zbiorczych. Skutki przeciwdrobnoustrojowe przy zastosowaniu metody A wykazały minimalne i hamujące stężenie (MIC) wynoszące jeden miligram na mililitr nanocząstek tlenku magnezu oraz minimalne stężenia bakteriobójcze (MBC 99,9) wynoszące 1,0 i 1,6 miligrama na mililitr nanocząstek tlenku magnezu odpowiednio dla Gram-ujemnych Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa.

Gram-dodatni gronkowiec naskórka, S.Aureus i oporny na metycylinę Staphylococcus aureus lub MRSA, wykazały wartości MIC wynoszące odpowiednio 0,5, 0,7 i jeden miligram na mililitr nanocząstek tlenku magnezu. Wartości NBC 99,99 wynoszące 1,6 i 1,2 miligrama na mililitr zostały zidentyfikowane odpowiednio dla S. epidermis i S. aureus. Chociaż MRSA nie został zredukowany powyżej NBC 90.

Wartości MIC wynoszące 1,2 i jeden miligram na mililitr zidentyfikowano odpowiednio u wrażliwych na leki i lekoopornych gatunków Candida, C albicans i C albicans opornych na flukonazol lub FR. Natomiast nanocząstki tlenku magnezu wykazywały wartości MIC wynoszące jeden i 0,7 miligrama na mililitr lub odpowiednio odporne na echinokandynę C.glabrata i C glabrata lub ER. Każdy gatunek kandydujący osiągnął NBC 90 na poziomie od 0,7 do 1,2 miligrama na mililitr, ale tylko C.glabrata ER został zredukowany do NBC 99,9 przy 1,2 miligrama na mililitr.

W metodzie B MRSA wystawiony na działanie nanocząstek rósł wykładniczo do OD 0,85. Narażenie na 1,2 miligrama na mililitr nanocząstek tlenku magnezu i 6,25 miligrama na mililitr trimetoprimu spowodowało odpowiednio 80,2% i 81,6% zmniejszonego wzrostu bakterii. Podobnie, 2,9 miligrama na mililitr nanocząstek wodorotlenku magnezu zmniejszyło wzrost bakterii do 70,3% Narażenie na jeden mikrolitr na mililitr wankomycyny spowodowało 99,99% zmniejszenie wzrostu MRSA, co sugeruje aktywność bakteriostatyczną nanocząstek tlenku magnezu i wodorotlenku magnezu.

Metoda C nie wykazała zahamowania wzrostu bakterii przy kontakcie pośrednim. Wyniki wykazały, że ZC21 miał najsilniejszą aktywność przeciwbakteryjną przeciwko adhezji i wzrostowi MRSA, spośród wszystkich badanych próbek. W metodzie D nie zidentyfikowano żywego gronkowca złocistego w próbkach 1,9A, 1,9 AA i EPD ani w ich sparowanych bibułach filtracyjnych.

Jednak ekspozycja na próbki EPD po uklęknięciu zmniejszyła wzrost bakterii do kilku komórek na powierzchni nanostrukturalnej i sparowanej bibule filtracyjnej. Identyfikacja działania przeciwdrobnoustrojowego nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych doprowadziła do przeprowadzenia dodatkowych badań w zastosowaniach bioinżynieryjnych, w tym związanych z ranami przewlekłymi i infekcjami związanymi z implantami.