Name: Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności ALDH1A1 w komórkach raka jajnika za pomocą sondy fluorogenicznej. Technika cytometrii przepływowej i obrazowania molekularnego umożliwia selektywną detekcję izoformy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez The National Institutes of Health (R35GM133581 do JC) oraz Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (przyznane SG). JC dziękuje Fundacji Camille i Henry'ego Dreyfusów za wsparcie. Autorzy dziękują dr Thomasowi E. Bearroodowi za jego początkowy wkład w przygotowanie akcji AlDeSense i AlDeSense AM. Dziękujemy Panu Oliverowi D. Pichardo Peguero i Panu Josephowi A. Forzano za pomoc w przygotowaniu różnych syntetycznych prekursorów. Dziękujemy prof. Erikowi Nelsonowi (Zakład Fizjologii Molekularnej i Integracyjnej, UIUC) za komórki Caov-3, IGROV-1 i PEO4. Dziękujemy prof. Paulowi Hergenrotherowi (Wydział Chemii, UIUC) za ogniwa BG-1. Dziękujemy Centralnym Placówkom Instytutu Biologii Genomowej Carla R. Woese'a za dostęp do mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 700 i odpowiedniego oprogramowania. Dziękujemy Zakładowi Cytometrii Przepływowej za dostęp do analizatora CMtO BD LSR II. Dziękujemy dr Sandrze McMasters i Cell Media Facility za pomoc w przygotowaniu pożywek do hodowli komórkowych.

1. Zmierz całkowitą aktywność ALDH1A1 w homogenatach komórek raka jajnika za pomocą fluorymetrii
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml następujących pożywek do hodowli komórkowych:
	<ol>
		<li>IGROV-1 i PEO4: Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S).</li>
		<li>BG-1 i Caov-3: Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS i 1% P/S.</li>
		<li>OVCAR-3: RPMI 1640 z 20% FBS, 1% P/S i 0,01 mg/ml insuliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.</li>
	<li>Trypsynizować komórki w 0,25% trypsyny przez 10 minut, liczyć je za pomocą automatycznego licznika komórek i osadzać 1 × 107 komórek przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację, przemyć osad przez ponowne zawieszenie komórek w 1 ml 1x PBS i ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 4.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w roztworze 1x inhibitora proteazy w 1x PBS. Użyj 1 ml tego roztworu na 2,5 × 106 komórek.</li>
	<li>Sonikuj zawiesinę komórek na lodzie przez 2 minuty (impuls 1 s, amplituda 40%) za pomocą sondy homogenizatora komórek.</li>
	<li>Frakcje nierozpuszczalne/membranowe osadów przez odwirowanie (3 200 × g) w temperaturze 25 °C przez 15 min. Usunąć i zachować supernatant, ponieważ jest to homogenat, który będzie używany w kolejnych etapach. Rozdziel homogenaty na trzy kuwety, aby przeprowadzić eksperyment w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dodaj sondę do homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie sondy 4 μM. Pipetować w górę i w dół trzy razy, aby dobrze wymieszać roztwór.</li>
	<li>Zmierz sygnał fluorescencyjny natychmiast po dodaniu i po pożądanym czasie inkubacji na fluorymetrze. Czas inkubacji można zoptymalizować, aby zobaczyć maksymalne włączenie składania (1 godzina w tym eksperymencie). Czas inkubacji musi być stały dla wszystkich porównywanych linii komórkowych.
	<ol>
		<li>Ustaw długość fali wzbudzenia na 496 nm.</li>
		<li>Ustaw emisję na 510-600 nm.</li>
		<li>Ustaw szerokość szczeliny na 0,5 mm.</li>
		<li>Odpipetuj roztwór do kuwety kwarcowej o pojemności 1 ml, umieść we fluorymetrze i naciśnij skanowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podzielić końcową intensywność fluorescencji przy 516 nm (maksymalna długość fali fluorescencji) przez intensywność przy tej samej długości fali z początkowego odczytu, aby określić aktywację krotności barwnika selektywnego izoformowo.</li>
</ol>
2. Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania komórek o wysokiej aktywności ALDH1A1
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.</li>
	<li>Dzień przed obrazowaniem konfokalnym płytka 4 × 105 komórek w 8-dołkowym szkiełku komorowym.
	<ol>
		<li>Pokryj dno każdej studzienki poli-L-lizyną (0,1 mg/ml, 100 μl na studzienkę) przez 10 minut, a następnie zasysaj.</li>
		<li>Umyj każdą studzienkę 3 razy, dodając wodę klasy do hodowli komórkowych (100 μl na studzienkę) i zasysając.</li>
		<li>Trypsynizuj komórki w 0,25% trypsyny przez 10 minut, policz je za pomocą automatycznego licznika komórek i plateruj komórki w 4 × 105 komórek na dołek.</li>
		<li>Pozwól komórkom osiąść i przyczepić się na noc (12-16 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową i dodać pożywkę bez surowicy (500 μl na studzienkę), uzupełnioną 2 μM sondy lub sondy kontrolnej.</li>
	<li>Inkubować z sondą w temperaturze pokojowej przez 30 minut i natychmiast obrazować komórki.</li>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny i dostosuj do próbki.
	<ol>
		<li>Ostrożnie załaduj próbkę przy najmniejszym powiększeniu; znajdź komórki, aby zapewnić prawidłowe ustawienie.</li>
		<li>Upewnij się, że soczewka obiektywu ma 10-krotne powiększenie i zlokalizuj komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do tego eksperymentu wymagany jest kanał FITC (wzbudzenie: laser 488 nm; emisja: 516-521 nm) i kanał T-PMT (światło przechodzące). Zlokalizuj i skup się na komórkach za pomocą T-PMT, aby ustawić ostrość na tej samej płaszczyźnie Z przez cały eksperyment, aby usunąć odchylenie.</li>
	<li>Dostosuj moc lasera i wzmocnienie FITC do odpowiedniego ustawienia, w którym sygnał z próbek AM Ctrl-AlDeSense jest minimalnie wykrywalny, a jednocześnie nadal widzi sygnał w próbkach AM AlDeSense. Każdy parametr można dostosować, przesuwając odpowiedni pasek. Może być konieczne kilkakrotne dostosowanie ustawień w celu zidentyfikowania prawidłowych parametrów. Po zoptymalizowaniu zakończ resztę eksperymentu w tej linii komórkowej przy użyciu identycznych parametrów.</li>
	<li>Zrób trzy obrazy na studzienkę, co daje w sumie trzy dołki na warunek leczenia (w sumie dziewięć obrazów). Ustaw ostrość na właściwej płaszczyźnie za pomocą T-PMT, aby uniknąć odchyleń, zamiast używać kanału fluorescencji lub scalonego obrazu.</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy, aby określić procent komórek ALDH1A1+.
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu, podziel plik czi na różne kanały.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę komórek i całkowitą liczbę komórek fluorescencyjnych.</li>
		<li>Aby określić procent komórek ALDH1A1+, podziel liczbę komórek fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie. Konieczne jest liczenie w ten sam sposób dla każdego obrazu bez manipulowania obrazami, ponieważ, na przykład, dostosowanie jasności może dodać zmienną zakłócającą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zastosowanie cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek o wysokiej aktywności ALDH1A1
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.</li>
	<li>Trypsynizować, liczyć i granulować komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu sondy/sondy kontrolnej 2 μM w PBS. Kołysz ogniwa w temperaturze pokojowej przez 60 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na barwnik.</li>
	<li>Po okresie inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml PBS. Przepuść komórki przez sitko komórkowe (siatka nylonowa 35 μm), aby usunąć grudki komórek, które mogą zatkać cytometr przepływowy. Natychmiast umieść komórki na lodzie.</li>
	<li>Włącz przyrząd i uruchom protokół rozruchowy.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma płynu w osłonie i pustych odpadów.</li>
	<li>Uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez 5 minut każda.</li>
	<li>Uruchom koraliki kontroli jakości, aby zapewnić prawidłowe działanie.</li>
	<li>W zakładce ustawień wybierz FSC (rozproszenie do przodu), SSC (rozproszenie boczne) i FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) dla filtra fluorescencyjnego.</li>
	<li>Narysuj poniższe wykresy, aby określić żywotność, singlety i fluorescencję. Zoptymalizuj moc lasera (specyficzną dla instrumentu użytkownika) tak, aby populacje komórek mieściły się w podanych parametrach do dalszej analizy.
	<ol>
		<li>Wykres punktowy FSC-A i SSC-A: główna populacja komórek znajduje się w pobliżu środka wykresu.</li>
		<li>Wykres punktowy FSC-A kontra FSC-W: wąskie pasmo poziome wskazujące na pojedyncze (a nie skupiska komórek).</li>
		<li>Wykres punktowy FITC-A w porównaniu z FSC-A: obserwuj rozkład komórek posortowanych przez selektywną sondę fluorogeniczną z izoformą.</li>
		<li>Histogram FITC-A: obserwuj przesunięcie populacji na podstawie FITC w celu określenia procentu komórek ALDH1A1+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zoptymalizować moc lasera FITC, uruchom próbkę za pomocą sondy tak, aby prawy ogon krzywej histogramu znajdował się w pobliżu maksymalnego sygnału FITC-A. Następnie uruchom próbkę za pomocą sondy kontrolnej. Przesunięcie populacji powinno być możliwe do zaobserwowania, aby ujawnić maksymalny zakres dynamiki. Etap optymalizacji mocy lasera może wymagać wielokrotnego powtórzenia, ale moc lasera nie powinna być zmieniana w próbkach po wyznaczeniu ustawienia do eksperymentu.</li>
	<li>Uruchom każdą próbkę przez 10 000 zliczeń (wykonaj w trzech egzemplarzach).</li>
	<li>Powtórz krok 3.12 dla każdej linii komórkowej, ponieważ wystąpi zmienność w wychwytywaniu i ALDH1A1 aktywności.</li>
	<li>Po zakończeniu pobierania próbki uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą na 5 minut każda, a następnie zainicjuj wyłączenie urządzenia.</li>
	<li>Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej i bramkuj żądaną populację komórek. Ustaw bramki tak, aby wszystkie zdarzenia wpadały do bramki ALDH1A1- lub ALDH1A1+. Korzystając z wyboru bramki prostokątnej, ustaw bramkę ALDH1A1 tak, aby >99,5% zdarzeń w próbkach sondy kontrolnej zachodziło w tej bramce. Pozostałe komórki zostaną uznane za ALDH1A1+. Te same bramki można następnie zastosować do próbki sondy w celu ilościowego określenia liczby zdarzeń branych pod uwagę ALDH1A1- i ALDH1A1+.</li>
</ol>

<ol><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukaemia+is+organised+as+a+heirarchy+that+originates+from+a+primitive+haematopoetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+cancer+stem+cells%3A+Beyond+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+cancer+stem+cells+in+therapy+resistance%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms.</a> Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).</li>
<li>Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+potential+of+cancer+stem+cells%3A+A+review+of+the+detection+of+cancer+stem+cells+and+their+roles+in+cancer+recurrence+and+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment.</a> Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).</li>
<li>Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+tumorigenesis%3A+Cancer+stem+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis.</a> Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).</li>
<li>Kim, W. T., Ryu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+surface+markers+on+normal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell surface markers on normal stem cells.</a> BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).</li>
<li>Pors, K., Moreb, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer%3A+An+opportunity+for+biomarker+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development.</a> Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).</li>
<li>Jackson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+aldehyde+dehydrogenase+gene+%28ALDH%29+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily.</a> Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).</li>
<li>Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+aldehyde+dehydrogenases+in+endogenous+and+xenobiotic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism.</a> Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).</li>
<li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li>
<li>Anorma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+cancer+stem+cell+plasticity+using+an+isoform-selective+fluorescent+probe+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1.</a> ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).</li>
<li>Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+red+fluorescent+sensor+for+ALDH1A1+displaying+enhanced+cellular+uptake+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity.</a> Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).</li>
<li>Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-based+small-molecule+fluorescent+probes+for+chemoselective+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging.</a> Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).</li>
<li>East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+of+activity-based+sensing+for+in+vivo+NIR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging.</a> Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+NIR+bioluminescence+probe+enables+discovery+of+diet-induced+modulation+of+the+tumor+microenvironment+via+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide.</a> ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity-based+sensing+approach+for+the+detection+of+cyclooxygenase-2+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells.</a> Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).</li>
<li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+principles+for+modulating+fluorescence+properties+of+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).</li>
<li>Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+fluorogenic+aldehydes+for+monitoring+the+progress+of+aldehyde+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).</li>
<li>Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+tumor+penetration%3A+transport+opposed+by+systemic+and+antigen-mediated+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).</li>
<li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li>
<li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1+maintains+ovarian+cancer+stem+cell-like+properties+by+altered+regulation+of+cell+cycle+checkpoint+and+DNA+repair+network+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling.</a> PLoS One. 9 (9), e107142(2014).</li>
<li>Kaipio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1-related+stemness+in+high-grade+serous+ovarian+cancer+is+a+negative+prognostic+indicator+but+potentially+targetable+by+EGFR%2FmTOR-PI3K%2Faurora+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors.</a> The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).</li>
<li>Deng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+levels+and+patterns+of+stem+cell+marker%2C+aldehyde+dehydrogenase+isoform+1+%28ALDH1%29%2C+in+human+epithelial+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers.</a> PLoS One. 5 (4), e10277(2010).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+activity-based+sensing+probes+for+isoform-selective+imaging+of+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity.</a> Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).</li>
<li>Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+ovarian+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of ovarian cancer: a review.</a> Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).</li>
<li>Tulake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+stem+cell+markers+ALDH1A1+and+OCT4+as+potential+biomarkers+for+the+early+detection+of+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma.</a> Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).</li>
<li>Nwani, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ALDH1A1+inhibitor+targets+cells+with+stem+cell+characteristics+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer.</a> Cancers. 11 (4), 502(2019).</li>
<li>Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+%28ALDH1A1%29+expression+by+immunohistochemistry+is+associated+with+chemo-refractoriness+in+patients+with+high-grade+ovarian+serous+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma.</a> Human Pathology. 73, 1-6 (2018).</li>
<li>Landen Jr, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aldehyde+dehydrogenase+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).</li>
<li>Condello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin-regulated+ALDH1A1+is+a+target+in+ovarian+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids.</a> Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).</li>
<li>Storms, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primitive+human+hematopoietic+progenitors+on+the+basis+of+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescence+assay+for+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity.</a> Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).</li>
<li>Minn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red-shifted+fluorescent+substrate+for+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase.</a> Nature Communications. 5, 3662(2014).</li>
<li>Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+ALDH+substrates+and+their+potential+to+study+maturational+lineage+biology+in+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).</li>
<li>Yagishita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+highly+selective+fluorescent+probe+enabling+flow-cytometric+isolation+of+ALDH3A1-positive+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).</li>
<li>Maity, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiophene+bridged+aldehydes+%28TBAs%29+image+ALDH+activity+in+cells%3A+Via+modulation+of+intramolecular+charge+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer.</a> Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).</li>
<li>Koenders, S. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+retinal-based+probe+for+the+profiling+of+retinaldehyde+dehydrogenases+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells.</a> ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).</li>
<li>Oe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-red%2Fnear-infrared+turn-on+fluorescence+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).</li>
<li>Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+BODIPY-based+blue+fluorescent+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).</li>
<li>Okamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+stem+cells+using+a+newly+developed+long-acting+fluorescence+probe%2C+C5S-A%2C+targeting+ALDH1A1%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1.</a> Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).</li>
</ol>

Ujawniamy zgłoszony patent (US20200199092A1) na technologię AlDeSense.

Pan-selektywność jest głównym ograniczeniem wielu sond ALDH; Jednak ostatnio zgłoszono kilka przykładów selektywności izoformowej: 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Selektywna izoforma sondy...

Rakowe komórki macierzyste (CSCs) stanowią subpopulację komórek nowotworowych wykazujących właściwości charakterystyczne dla komórek macierzystych1. Podobnie jak ich niezłośliwe odpowiedniki, CSCs posiadają niezwykłą zdolność do samoodnawiania i proliferacji. W połączeniu z innymi wbudowanymi mechanizmami, takimi jak nadekspresja transporterów z kaskady ATP-binding cassette, CSCs często unikają skutków początkowej chirurgicznej redukcji masy guza, a także późniejszej terapii adjuwantowej2. Ze względu na ich kluczową rolę w oporności na leczenie3, nawrotach choroby4 oraz przerzutach5, CSCs stały się priorytetem w badaniach nad nowotworami. Choć istnieje wiele antygenów powierzchniowych komórek (np. CD133), które można wykorzystać do identyfikacji CSCs6, atrakcyjną alternatywą stało się wykorzystanie aktywności enzymatycznej aldehydodehydrogenaz (ALDHs) występujących w cytoplazmie7. ALDHs to superfamilia 19 enzymów odpowiedzialnych za katalizowanie utleniania reaktywnych endogennych i ksenobiotycznych aldehydów do odpowiadających im produktów w postaci kwasów karboksylowych8.
Generalnie detoksykacja aldehydów jest kluczowa dla ochrony komórek przed niepożądanymi zdarzeniami sieciowania oraz stresem oksydacyjnym, który może uszkodzić integralność komórek macierzystych9. Ponadto izoforma 1A1 kontroluje metabolizm kwasu retinowego, co z kolei wpływa na wielopotencjałowość (stemness) via sygnalizację retinaldehydu10. Niedawno opracowano AlDeSense11,12, małocząsteczkową sondę opartą na detekcji aktywności (activity-based sensing – ABS), służącą do selektywnego wykrywania aktywności ALDH1A1. Konstrukcje ABS umożliwiają detekcję anality poprzez zmianę chemiczną, a nie zdarzenie wiązania, co pozwala na wysoką selektywność i zmniejszenie odpowiedzi poza celem (off-target)13,14,15,16. Zasada działania tej izoformo-selektywnej sondy fluorogennej opiera się na mechanizmie gaszenia poprzez fotoindukowany transfer elektronów od donora (d-PeT)17, wynikającym z obecności grupy funkcyjnej aldehydowej, która służy do tłumienia sygnatury fluorescencyjnej sondy18. Po konwersji do kwasu karboksylowego katalizowanej przez ALDH1A1, następuje odblokowanie relaksacji radiacyjnej, co prowadzi do powstania silnie fluorescencyjnego produktu. Ponieważ gaszenie d-PeT nigdy nie jest w 100% wydajne, podczas opracowywania tego testu wzięto pod uwagę fluorescencję resztkową, która może prowadzić do możliwych wyników fałszywie dodatnich, poprzez stworzenie Ctrl-AlDeSense – odczynnika nieodpowiadającego, o dopasowanych charakterystykach fotofizycznych (np. wydajności kwantowej) i identycznym wzorcu barwienia cytoplazmatycznego w komórkach. Używane razem, to unikalne zestawienie pozwala wiarygodnie odróżnić komórki o wysokiej aktywności ALDH1A1 od tych wykazujących niskie poziomy via fluorymetrię, obrazowanie molekularne i cytometrię przepływową. Stosowanie izoformo-selektywnych barwników aktywowalnych wiąże się z kilkoma kluczowymi zaletami w porównaniu do tradycyjnych metod immunohistochemicznych. Na przykład zakłada się, że CSC są ukryte głęboko w guzie, przez co są bardziej dostępne dla małych cząsteczek niż dla dużych przeciwciał19. Dodatkowo, powstały w wyniku obrotu fluorescencyjny produkt nie modyfikuje kowalencyjnie żadnego komponentu komórkowego, co oznacza, że może zostać łatwo usunięty via cykle płukania, pozostawiając CSC w stanie niemodyfikowanym. Wreszcie, odpowiedź typu „turn-on” identyfikuje wyłącznie żywe komórki i ich funkcje, podobnie jak test MTT, ze względu na zależność od kofaktora NAD+.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat obrazujący fluorescencyjne włączenie sygnału AlDeSense. Barwnik selektywny względem izoform jest aktywowany przez ALDH1A1 i może być wykorzystywany do identyfikacji podwyższonej aktywności ALDH1A1 w komórkach raka jajnika poprzez fluorymetrię, obrazowanie molekularne oraz cytometrię przepływową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64713/64713fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W poprzednich badaniach test z użyciem izoformowo-selektywnej sondy fluorogennej pozwolił na skuteczną stratyfikację komórek z wysoką aktywnością ALDH (ALDH+) od komórek z niską aktywnością ALDH (ALDH-) w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki K562, ludzkich komórkach raka piersi MDA-MB-231 oraz mysich komórkach czerniaka B16F0. Jest to istotne, ponieważ w wielu typach nowotworów wysoka ekspresja białka ALDH1A1 oznacza gorsze rokowanie kliniczne20. Zakłada się, że podwyższone poziomy ALDH1A1 są charakterystyczne dla CSC, które mogą unikać leczenia, rozwijać oporność i rozprzestrzeniać się w organizmie. Jednakże w przypadku raka jajnika istnieją badania raportujące przeciwne wyniki (wysoka ekspresja ALDH1A1 jest powiązana z lepszą przeżywalnością pacjentek)21,22,23,24. Choć na pierwszy rzut oka może się to wydawać sprzeczne, ekspresja niekoniecznie koreluje z aktywnością enzymatyczną, na którą mogą wpływać zmiany w mikrośrodowisku guza (np. zmiany pH, gradienty tlenu), dostępność kofaktora NAD+ lub substratów aldehydowych, poziomy kwasów karboksylowych (inhibicja produktowa) oraz modyfikacje potranslacyjne, które mogą zmieniać aktywność enzymu25. Dodatkowo rak jajnika dzieli się na pięć głównych typów histologicznych (surowiczy wysokiego stopnia, surowiczy niskiego stopnia, endometrioidalny, jasnokomórkowy i śluzowy), w których, według naszej hipotezy, wystąpią zmienne poziomy aktywności ALDH1A126. W celu zbadania aktywności ALDH1A1 w guzach jajnika zastosowano test z izoformowo-selektywną sondą fluorogenną, aby zidentyfikować populacje ALDH1A1+ w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika należących do wspomnianych wyżej typów histologicznych. Linie komórkowe przebadane w niniejszym badaniu obejmują komórki BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 i PEO4, reprezentujące histotypy jasnokomórkowy i surowiczy. W niniejszej pracy podkreślono wszechstronność i uniwersalność sondy w identyfikacji CSC dla badaczy dążących do przeprowadzenia podobnych badań w innych unieśmiertelnionych liniach komórkowych nowotworów, a także w próbkach pacjentów. Zastosowanie AlDeSense rzuci światło na szlaki biochemiczne zaangażowane w utrzymanie CSC w złożonych mikrośrodowiskach tkankowych i potencjalnie może służyć jako narzędzie kliniczne do określania rokowań oraz pomiaru agresywności nowotworu.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor fosforanowy Solanka Corning</td><td></td><td>21-040-CMX12</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Zsyntetyzowany we własnym zakresie</td></tr><tr><td>BG-1</td><td></td><td></td><td>Prezent dostarczony przez Laboratorium Prof. Paula Hergenrothera, University of Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>BioLite 25cm2 Kolba</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>130189 Szafa bezpieczeństwa biologicznego seria 1300 A2</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caov-3</td><td></td><td></td><td>Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Homogenizator komórkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5180R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>Contrl-AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Zsyntetyzowany we własnym</td></tr><tr><td>DMEM, 10% FBS, 1% P/S</td><td></td><td></td><td>Przygotowany przez komórkę UIUC placówka medialna</td></tr><tr><td>Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskiem z filtrem siatkowym, 5 ml</td><td>Corning</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez UIUC CMtO</td></tr><tr><td>FL</td> Mikroskop <td>EVOS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II z płaszczem wodnym CO2&nbsp; Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>IGROV-1</td><td></td><td></td><td>Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>inkubacyjna Innova 42R</tr><tr><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Komorowy #1.0 System szkła borokrzemowego</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155383</tr><tr><td>OVCAR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>PEO4</td><td></td><td></td><td>Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Pierce Inhibitor Inhibitor Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI, 10% FBS, 1% P/S</td><td></td><td></td><td>Przygotowane przez pożywkę komórkową UIUC</td></tr><tr><td>RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/ml Insulina</td><td></td><td></td><td>Przygotowana przez pożywkę komórkową UIUC</td></tr></tbody></table>

zastosowanie aldesense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1a1

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Nawroty po leczeniu raka są często przypisywane utrzymywaniu się subpopulacji komórek nowotworowych znanych jako rakowe komórki macierzyste (CSC), które charakteryzują się niezwykłą zdolnością do inicjowania nowotworu i samoodnawiania. W zależności od pochodzenia guza (np. jajników), profil biomarkerów powierzchniowych CSC może się znacznie różnić, co sprawia, że identyfikacja takich komórek za pomocą barwienia immunohistochemicznego jest trudnym przedsięwzięciem. Wręcz przeciwnie, dehydrogenaza aldehydowa 1A1 (ALDH1A1) okazała się doskonałym markerem do identyfikacji CSC, ze względu na jej konserwatywny profil ekspresji w prawie wszystkich komórkach progenitorowych, w tym CSC. Izoforma ALDH1A1 należy do nadrodziny 19 enzymów, które są odpowiedzialne za utlenianie różnych endogennych i ksenobiotycznych aldehydów do odpowiadających im produktów kwasu karboksylowego. Chan i in. opracowali niedawno AlDeSense, selektywną izoformę sondy "włączającej" do wykrywania aktywności ALDH1A1, a także niereaktywnego odczynnika kontrolnego (Ctrl-AlDeSense) w celu uwzględnienia barwienia poza celem. Wykazano już, że to narzędzie do selekcji izoform jest wszechstronnym narzędziem chemicznym poprzez wykrywanie aktywności ALDH1A1 w komórkach białaczki szpikowej K562, mammosferach i ksenoprzeszczepach CSC pochodzących z czerniaka. W tym artykule użyteczność sondy została zaprezentowana poprzez dodatkowe eksperymenty z fluorymetrią, mikroskopią konfokalną i cytometrią przepływową, w których określono względną aktywność ALDH1A1 w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika.

Całkowita aktywność ALDH1A1 w homogenatach komórek raka jajnika 
Średnie wartości wzrostu sygnału (fold turn-ons) dla każdej linii komórkowej uzyskane w tym teście wynoszą: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1.30 ± 0.03); Caov-3 (1.72 ± 0.06); PEO4 (2.51 ± 0.29) oraz OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (Rycina 2).
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jpg" /> 
<strong class="x...

Metody pomiaru aktywności ALDH1A1 w żywych komórkach są kluczowe w badaniach nad rakiem ze względu na jego status jako biomarkera macierzystości. W tym badaniu zastosowaliśmy selektywną izoformę sondy fluorogenicznej, aby określić względne poziomy aktywności ALDH1A1 w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika.

Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

Nasz protokół pozwala użytkownikom mierzyć aktywność ALDH1A1, biomarkera komórek macierzystych przy użyciu różnych modalności, od cytometrii przepływowej po obrazowanie molekularne żywych komórek. Głównymi zaletami tego podejścia jest to, że aktywacja sondy obejmuje reakcję zwrotną charakteryzującą się wysokim stosunkiem sygnału do tła, a także selektywną detekcją izoform ALDH1A1. Tę procedurę zademonstrują Michael Lee, Sarah Gardner i Rodrigo Tapia Hernandez, absolwenci z mojego laboratorium.Na początek odessaj pożywkę wzrostową z hodowanych komórek zainteresowania w szkiełku z ośmioma dołkami. Dodać 500 mikrolitrów na studzienkę pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej dwumikromolową selektywną izoformą fluorogeniczną lub niereaktywną sondą kontrolną. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po inkubacji należy natychmiast przystąpić do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym. Zlokalizuj komórki w powiększeniu 10x. Do tego eksperymentu wymagany jest kanał FITC i kanały światła przechodzącego.Zlokalizuj i skoncentruj komórki za pomocą kanału światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na tej samej płaszczyźnie Z przez cały eksperyment, aby usunąć odchylenia. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie FITC do odpowiedniego ustawienia, w którym sygnał z próbek kontrolnych AlDeSense AM jest minimalnie wykrywalny, a jednocześnie nadal widzi sygnał w próbkach AlDeSense AM. Dostosuj każdy parametr, przesuwając odpowiedni pasek.Może być konieczne kilkakrotne dostosowanie ustawień w celu zidentyfikowania prawidłowych parametrów. Po zoptymalizowaniu zakończ resztę eksperymentu w tej linii komórkowej przy użyciu identycznych parametrów. Zrób trzy obrazy na studzienkę, co daje w sumie trzy dołki na warunki leczenia i zapisz obrazy.Upewnij się, że ustawiasz ostrość przy użyciu kanału światła przechodzącego tylko podczas przełączania między płaszczyznami i studzienkami, aby uniknąć stronniczości. Następnie za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu podziel plik CZI na różne kanały i policz całkowitą liczbę komórek i komórek fluorescencyjnych. Aby określić procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1, podziel liczbę komórek fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie.Licz w ten sam sposób dla każdego obrazu, aby uniknąć mylących zmiennych. Wyjąć kolbę do hodowli komórek T25 zawierającą komórki przechowywane w inkubatorze. Dodaj trypsynę do odłączania komórek i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.Następnie osadzaj komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej przez wirowanie w temperaturze 180 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze dwumikromolowej sondy lub roztworu sondy kontrolnej w PBS. Kołysz komórkami w temperaturze pokojowej przez 60 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na barwnik.Po okresie inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 180 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś ogniwa w 0,5 mililitra PBS. Przepuść komórki przez sitko z nylonową siatką o grubości 35 mikrometrów na rurkę umieszczoną na lodzie w celu usunięcia grudek komórek, które mogą zatkać cytometr przepływowy.Włącz cytometr przepływowy i uruchom protokół startowy. Sprawdź, czy w pochwce nie ma płynu i pustej talii. Uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez pięć minut każda.Następnie uruchom koraliki kontroli jakości, aby zapewnić prawidłowe działanie. W zakładce ustawień wybierz rozproszenie do przodu i FITC dla filtra fluorescencyjnego. Narysuj wykres obszaru punktowego z przodu i bocznego obszaru punktowego dla głównej populacji komórek w pobliżu środka wykresu.Następnie narysuj obszar rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem szerokości rozproszenia do przodu dla wąskich poziomych pasm wskazujących singlety. Następnie narysuj wykres obszaru FITC w funkcji obszaru rozproszenia do przodu, aby obserwować rozkład komórek posortowanych przez selektywną sondę fluorogeniczną z izoformą. Następnie narysuj histogram obszaru FITC, aby obserwować przesunięcie populacji na podstawie FITC i określić procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1.Aby zoptymalizować moc lasera FITC, uruchom próbkę za pomocą sondy tak, aby prawy ogon krzywej histogramu znajdował się w pobliżu maksymalnego sygnału obszaru FITC. Etap optymalizacji mocy lasera może wymagać wielokrotnego powtórzenia, ale moc lasera nie powinna być zmieniana w próbkach, po wyznaczeniu ustawienia dla eksperymentu. Następnie dodaj próbkę do przesiewacza i uruchom ją za pomocą sondy kontrolnej.Przesunięcie populacji powinno być możliwe do zaobserwowania, aby ujawnić maksymalny zakres dynamiki. Uruchom każdą próbkę przez 10 000 zliczeń, wykonując je w trzech egzemplarzach. Po zakończeniu pobierania próbki uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez pięć minut każda, a następnie wyłącz urządzenie.Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej i dobierz żądaną populację komórek. Korzystając z wyboru bramki prostokątnej, ustaw ujemny chód dehydrogenazy aldehydowej 1A1, tak aby ponad 99,5% zdarzeń w próbkach sondy kontrolnej zachodziło w tej bramce. Pozostałe komórki zostaną uznane za dodatnie pod względem dehydrogenazy aldehydowej 1A1.Zastosować te same bramki do próbki sondy. Aby określić ilościowo liczbę zdarzeń uważanych za dehydrogenazę aldehydową 1A1 ujemną i 1A1 dodatnią. Określono średnie włączenia fałdowania dla każdej linii komórkowej w celu ilościowego określenia całkowitej aktywności dehydrogenazy aldehydowej 1A1.Procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 określono w każdej linii komórkowej poprzez dostrojenie mocy i wzmocnienia lasera. Aby zminimalizować sygnał w próbce kontrolnej poddanej działaniu AlDeSense AM, sygnał fluorescencyjny został zoptymalizowany w komórkach poddanych działaniu AlDeSense AM. Zliczając liczbę komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej A1A, określono procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej A1A.Dzięki zastosowaniu selektywnej sondy fluorogenicznej izoformy, populację komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 określono ilościowo w każdej linii komórkowej poprzez bramkowanie dla górnych 0,5% najjaśniejszych komórek w populacji kontrolnej leczonej AlDeSense AM. Analiza panelu komórek raka jajnika ujawniła procentową zawartość komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1. Z uzyskanych wyników badanych linii komórek nowotworowych można wywnioskować, że BG-1 ma najniższą aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1 i najniższą populację dodatnią dehydrogenazy aldehydowej 1A1.Ponadto obrazowanie konfokalne i cytometria przepływowa ujawniły największy odsetek komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 w komórkach Caov-3. Ale ogólna aktywność linii komórkowej była dopiero na trzecim miejscu. Alternatywnie, komórki OVCAR-3 zawierały trzecią co do wielkości populację dodatnią pod względem dehydrogenazy aldehydowej 1A1, ale wykazywały najwyższą ogólną aktywność.AlDeSense to wszechstronna i uogólniona sonda do identyfikacji CSC w unieśmiertelnionych liniach komórkowych i próbkach pacjentów. Mamy nadzieję, że będzie to narzędzie prognostyczne w warunkach klinicznych.

application-aldesense-to-stratify-ovarian-cancer-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Komórki inicjujące nowotwór (TICs) mogą stanowić realny cel terapeutyczny w leczeniu raka jajnika, choroby często nawracającej i śmiertelnej. Przedstawiamy protokół dla warunków hodowli, które wzbogacają tę wysoce nowotworową populację komórek.

Metody in vitro Wzbogacanie komórek inicjujących nowotwór raka jajnika

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj metodę pomiaru aktywności ALDH1A1 w komórkach raka jajnika za pomocą sondy fluorogenicznej. Technika cytometrii przepływowej i obrazowania molekularnego umożliwia selektywną detekcję izoformy.

Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1

Przeglądaj więcej filmów