Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1

Nasz protokół pozwala użytkownikom mierzyć aktywność ALDH1A1, biomarkera komórek macierzystych przy użyciu różnych modalności, od cytometrii przepływowej po obrazowanie molekularne żywych komórek. Głównymi zaletami tego podejścia jest to, że aktywacja sondy obejmuje reakcję zwrotną charakteryzującą się wysokim stosunkiem sygnału do tła, a także selektywną detekcją izoform ALDH1A1. Tę procedurę zademonstrują Michael Lee, Sarah Gardner i Rodrigo Tapia Hernandez, absolwenci z mojego laboratorium.

Na początek odessaj pożywkę wzrostową z hodowanych komórek zainteresowania w szkiełku z ośmioma dołkami. Dodać 500 mikrolitrów na studzienkę pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej dwumikromolową selektywną izoformą fluorogeniczną lub niereaktywną sondą kontrolną. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po inkubacji należy natychmiast przystąpić do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym. Zlokalizuj komórki w powiększeniu 10x. Do tego eksperymentu wymagany jest kanał FITC i kanały światła przechodzącego.

Zlokalizuj i skoncentruj komórki za pomocą kanału światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na tej samej płaszczyźnie Z przez cały eksperyment, aby usunąć odchylenia. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie FITC do odpowiedniego ustawienia, w którym sygnał z próbek kontrolnych AlDeSense AM jest minimalnie wykrywalny, a jednocześnie nadal widzi sygnał w próbkach AlDeSense AM. Dostosuj każdy parametr, przesuwając odpowiedni pasek.

Może być konieczne kilkakrotne dostosowanie ustawień w celu zidentyfikowania prawidłowych parametrów. Po zoptymalizowaniu zakończ resztę eksperymentu w tej linii komórkowej przy użyciu identycznych parametrów. Zrób trzy obrazy na studzienkę, co daje w sumie trzy dołki na warunki leczenia i zapisz obrazy.

Upewnij się, że ustawiasz ostrość przy użyciu kanału światła przechodzącego tylko podczas przełączania między płaszczyznami i studzienkami, aby uniknąć stronniczości. Następnie za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu podziel plik CZI na różne kanały i policz całkowitą liczbę komórek i komórek fluorescencyjnych. Aby określić procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1, podziel liczbę komórek fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie.

Licz w ten sam sposób dla każdego obrazu, aby uniknąć mylących zmiennych. Wyjąć kolbę do hodowli komórek T25 zawierającą komórki przechowywane w inkubatorze. Dodaj trypsynę do odłączania komórek i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.

Następnie osadzaj komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej przez wirowanie w temperaturze 180 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze dwumikromolowej sondy lub roztworu sondy kontrolnej w PBS. Kołysz komórkami w temperaturze pokojowej przez 60 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na barwnik.

Po okresie inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 180 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś ogniwa w 0,5 mililitra PBS. Przepuść komórki przez sitko z nylonową siatką o grubości 35 mikrometrów na rurkę umieszczoną na lodzie w celu usunięcia grudek komórek, które mogą zatkać cytometr przepływowy.

Włącz cytometr przepływowy i uruchom protokół startowy. Sprawdź, czy w pochwce nie ma płynu i pustej talii. Uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez pięć minut każda.

Następnie uruchom koraliki kontroli jakości, aby zapewnić prawidłowe działanie. W zakładce ustawień wybierz rozproszenie do przodu i FITC dla filtra fluorescencyjnego. Narysuj wykres obszaru punktowego z przodu i bocznego obszaru punktowego dla głównej populacji komórek w pobliżu środka wykresu.

Następnie narysuj obszar rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem szerokości rozproszenia do przodu dla wąskich poziomych pasm wskazujących singlety. Następnie narysuj wykres obszaru FITC w funkcji obszaru rozproszenia do przodu, aby obserwować rozkład komórek posortowanych przez selektywną sondę fluorogeniczną z izoformą. Następnie narysuj histogram obszaru FITC, aby obserwować przesunięcie populacji na podstawie FITC i określić procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1.

Aby zoptymalizować moc lasera FITC, uruchom próbkę za pomocą sondy tak, aby prawy ogon krzywej histogramu znajdował się w pobliżu maksymalnego sygnału obszaru FITC. Etap optymalizacji mocy lasera może wymagać wielokrotnego powtórzenia, ale moc lasera nie powinna być zmieniana w próbkach, po wyznaczeniu ustawienia dla eksperymentu. Następnie dodaj próbkę do przesiewacza i uruchom ją za pomocą sondy kontrolnej.

Przesunięcie populacji powinno być możliwe do zaobserwowania, aby ujawnić maksymalny zakres dynamiki. Uruchom każdą próbkę przez 10 000 zliczeń, wykonując je w trzech egzemplarzach. Po zakończeniu pobierania próbki uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez pięć minut każda, a następnie wyłącz urządzenie.

Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej i dobierz żądaną populację komórek. Korzystając z wyboru bramki prostokątnej, ustaw ujemny chód dehydrogenazy aldehydowej 1A1, tak aby ponad 99,5% zdarzeń w próbkach sondy kontrolnej zachodziło w tej bramce. Pozostałe komórki zostaną uznane za dodatnie pod względem dehydrogenazy aldehydowej 1A1.

Zastosować te same bramki do próbki sondy. Aby określić ilościowo liczbę zdarzeń uważanych za dehydrogenazę aldehydową 1A1 ujemną i 1A1 dodatnią. Określono średnie włączenia fałdowania dla każdej linii komórkowej w celu ilościowego określenia całkowitej aktywności dehydrogenazy aldehydowej 1A1.

Procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 określono w każdej linii komórkowej poprzez dostrojenie mocy i wzmocnienia lasera. Aby zminimalizować sygnał w próbce kontrolnej poddanej działaniu AlDeSense AM, sygnał fluorescencyjny został zoptymalizowany w komórkach poddanych działaniu AlDeSense AM. Zliczając liczbę komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej A1A, określono procent komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej A1A.

Dzięki zastosowaniu selektywnej sondy fluorogenicznej izoformy, populację komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 określono ilościowo w każdej linii komórkowej poprzez bramkowanie dla górnych 0,5% najjaśniejszych komórek w populacji kontrolnej leczonej AlDeSense AM. Analiza panelu komórek raka jajnika ujawniła procentową zawartość komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1. Z uzyskanych wyników badanych linii komórek nowotworowych można wywnioskować, że BG-1 ma najniższą aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1 i najniższą populację dodatnią dehydrogenazy aldehydowej 1A1.

Ponadto obrazowanie konfokalne i cytometria przepływowa ujawniły największy odsetek komórek dodatnich dehydrogenazy aldehydowej 1A1 w komórkach Caov-3. Ale ogólna aktywność linii komórkowej była dopiero na trzecim miejscu. Alternatywnie, komórki OVCAR-3 zawierały trzecią co do wielkości populację dodatnią pod względem dehydrogenazy aldehydowej 1A1, ale wykazywały najwyższą ogólną aktywność.

AlDeSense to wszechstronna i uogólniona sonda do identyfikacji CSC w unieśmiertelnionych liniach komórkowych i próbkach pacjentów. Mamy nadzieję, że będzie to narzędzie prognostyczne w warunkach klinicznych.