Badanie strategii łączenia dwóch ziół w leczeniu uszkodzonych komórek PC12

Protokół w tym badaniu zawiera strategię kombinacji dwóch ziół w leczeniu uszkodzonych przez niedotlenienie komórek PC12 oraz odniesienie do optymalizacji najlepszego trybu łączenia ziół. Technika ta może zapewnić prostą, niezawodną i wydajną metodę eksperymentalną in vitro do badania przesiewowego skutecznej kombinacji składników z ziół przeciwko komórkom niedotlenionym. Strategia ta może być również zastosowana do badania przesiewowego kombinacji składników przeciwko komórkom niedotlenionym z innych kombinacji preparatów ziołowych i zilustrowania ich mechanizmu ochronnego.

Na początek subkulturuj komórki PC12 co dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla, aby uzyskać pasaż od 4 do 8 dla wszystkich kolejnych eksperymentów. Potraktuj 70 do 80% zlewających się komórek PC12 jednym mililitrem 0,25% trypsyny i obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek. Następnie przerwij trawienie trypsyny, dodając trzy mililitry kompletnej pożywki.

Wiruj przeniesione komórki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej o pojemności 840 x g przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy z kompletną pożywką i przenieść zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Aby policzyć komórki, uruchom oprogramowanie do cytometrii przepływowej i wybierz odpowiednią wielokrotność rozcieńczenia roztworu komórkowego w ustawieniu zliczania.

Kliknij Wykres gęstości po załadowaniu próbki komórki. Zakreśl populację komórek z dala od osi x i osi y. Kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę danych poniżej rysunku i wybierz pozycję X, Y, Liczba i Abs.

Policz, aby uzyskać wyniki zliczania komórek w tabeli danych Abs.Count. Po dostosowaniu stężenia komórek w przybliżeniu do 1 razy 10 do 5 komórek na mililitr z kompletną pożywką, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnego dnia do płytki odrzuconej przez supernatant dodać 120 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr roztworu MTT do każdej studzienki i inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji, po odrzuceniu supernatantu, dodać 150 mikrolitrów DMSO do każdej studzienki. Utrzymuj płytkę pod wstrząsem w oscylatorze wirowym przez 10 minut z prędkością 240 razy na minutę. Następnie zmierz absorbancję przy 490 nanometrach w czytniku mikropłytek.

Aby określić optymalną kombinację leków za pomocą metody projektowania jednorodnego, należy hodować komórki, jak wykazano wcześniej, i leczyć uszkodzone komórki PC12 sześcioma różnymi proporcjami stężeń wstrzykiwania Astragalus i kapsułki breviscapus. Aby ocenić efekt ochronny dwóch optymalnych kombinacji, należy leczyć uszkodzone komórki PC12 dwoma rodzajami kombinacji leków. Inkubuj komórki przez 24 godziny i oblicz żywotność komórek, jak pokazano wcześniej.

Wysiewaj komórki PC12 na 12-dołkowej płytce i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po leczeniu farmakologicznym potraktuj komórki 250 mikrolitrami trypsyny na studzienkę i odwiruj komórki przy 840 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy z 500 mikrolitrami buforu wiążącego.

Dodać 5 mikrolitrów aneksyny V-FITC, 10 mikrolitrów jodku propidyny w trzech powtórzeniach dla każdej grupy i inkubować komórki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby sprawdzić apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej. W oprogramowaniu cytometru przepływowego kliknij opcję Automatyczna kompensacja w menu Start, wybierz FITC, PE, PerCP i APC w polu Wybierz kanał, a następnie wybierz opcję Kompensacja na wysokości. Następnie kliknij przycisk OK w polu Element statystyczny:Mediana.

Kliknij opcję Density Map (Mapa zagęszczenia) i zakreśl efektywną populację komórek za pomocą metody zliczania komórek przedstawionej wcześniej. Z fluorescencją FITC jako parametrem osi x i inną fluorescencją jako parametrem osi y, utwórz mapę gęstości. Kliknij Macierz kompensacji w menu Start i Współczynnik w macierzy przepełnienia.

Wysiewać komórki PC12 do szkiełek nakrywkowych umieszczonych na 24-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po leczeniu farmakologicznym spłucz szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS przez pięć minut każde, utrwal je 4% paraformaldehydem przez 15 minut i przepuszczaj 0,5% Triton X-100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu komórek zablokuj je 10% kozim surowicą na godzinę w temperaturze pokojowej.

Dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-3 do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyć trzykrotnie buforem TBST przez trzy minuty każdy i inkubować z 200 mikrolitrami przeciwciała drugorzędowego przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji inkubować szkiełka nakrywkowe z 300 mikrolitrami 0,5 mikrograma na mililitr DAPI przez 10 minut i myć komórki trzykrotnie TBST przez pięć minut każda.

Uchwyć obrazy szkiełek nakrywkowych pod mikroskopem fluorescencyjnym i przeanalizuj statystycznie intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania. Przemyć szkiełko nakrywkowe z komórek PC12 potraktowane lekiem trzykrotnie PBS przez trzy minuty każde i inkubować z 400 mikrolitrami 10 mikromolowego dichloro-dihydrofluoresceiny dioctanu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ponownie umyj komórki DMEM bez surowicy dwa razy po trzy minuty każda.

Dodaj środek gaszący fluorescencję i natychmiast uchwyć obrazy szkiełek nakrywkowych pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obliczyć względną intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania. Przemyć komórki PC12 potraktowane lekiem na 6-dołkowej płytce trzy razy z PBS przez pięć minut każda, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut w przygotowanym buforze do lizy o pojemności 100 mikrolitrów na studzienkę. Po lizie odwirować komórki w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zebrać supernatant.

Po wykryciu stężenia białka za pomocą testu Bradforda, należy przeprowadzić elektroforezę 12%SDS-PAGE z 25 mikrogramami białka w każdym pasie i przenieść żel do membrany PVDF. Zablokuj błony 5% beztłuszczowym mlekiem przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i inkubuj z pięcioma mililitrami odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po inkubacji i przemyciu błony TBST trzy razy przez 10 minut każde, inkubować z pięcioma mililitrami wtórnych przeciwciał sprzężonych z HRP w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Na koniec do membrany płukanej TBST dodaj chemiluminescencyjny substrat HRP do wykrywania prążków białkowych zgodnie z instrukcją producenta. Następnie uchwyć obrazy za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego w celu ilościowego określenia szarych wartości białek, z beta-aktyną jako kontrolą wewnętrzną. Żywotność komórek na normalnych komórkach PC12 była niższa niż 95% w przypadku wstrzyknięcia Astragalus w stężeniach większych niż 12 mikromolowych i większych niż 5 mikromolowych w przypadku kapsułki breviscapus.

Wstrzyknięcie traganka może poprawić przeżywalność uszkodzonych komórek PC12 w zakresie stężeń od 6 do 12 mikromolowych, a torebka breviscapus w zakresie od 2 do 5 mikromolowych. Natomiast kombinacja leków w stosunku od 6 do 1,8 mikromola wykazywała najwyższą żywotność komórek. Żywotność dwóch kombinacji komórek na uszkodzonych komórkach PC12 była znacznie zwiększona, a kombinacja składników była lepsza niż kombinacja preparatów.

Wskaźnik apoptozy wykazał, że odsetek wczesnych, późnych i całkowitych komórek apoptotycznych był znacznie wyższy w grupie modelowej niż w grupie normalnej. W porównaniu z grupą modelową, odsetek komórek apoptotycznych na każdym etapie był znacznie niższy w grupie leczonej. Intensywność fluorescencji kaspazy-3 była istotnie niższa w każdej grupie leczonej w porównaniu z grupą modelową i była stosunkowo niższa w grupie złożonej ze składnikami.

Względna ekspresja genów Akt, Bcl-2 i Bax ujawniła, że kombinacja składników jest lepsza od kombinacji preparatów w promowaniu przeżycia komórek, co jest związane z silniejszym efektem antyapoptozy. Kombinacja składników wykazywała lepsze działanie przeciwutleniające niż kombinacja preparatów i znacznie wyższą ekspresję białka Nrf2. Metoda ta może być stosowana do badań przesiewowych i oceny kombinacji składników z innymi potencjalnymi działaniami farmakologicznymi z kombinacji ziół, takimi jak przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i inne.