Name: Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę endogennego znakowania genów w Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR i PCR. Protokół skraca czas genotypowania i umożliwia tworzenie stabilnych linii z fluorescencyjnymi białkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy George'owi Watase i Josie Clowney za dyskusje podczas początkowych etapów rozwoju protokołu. Prace były wspierane przez fundusze z NIH (grant nr R35GM133737 dla S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (dla S. Y.) i McKnight Scholar Award (dla S. Y.).

1. Projektowanie i budowa odczynników do edycji genów
UWAGA: Aby przeprowadzić endogenne znakowanie, konieczne jest zidentyfikowanie różnych izoform pożądanego genu. W zależności od konkretnych celów eksperymentu, znacznik fluorescencyjny może być włączony wewnętrznie lub na końcach N lub C wybranej izoformy białka. Aby uzyskać optymalną edycję za pośrednictwem CRISPR, ważne jest, aby umieścić dwa sgRNA odpowiednio blisko zamierzonego miejsca wbicia. Następnie, aby umożliwić edycję poprzez rekombinację homologiczną, należy przygotować wektor dawcy obejmujący sekwencje homologiczne do genu docelowego, wraz ze znacznikiem fluorescencyjnym. Poniżej znajduje się przewodnik krok po kroku po tych procesach (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Zaprojektuj sgRNA zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj sgRNA dla Drosophila, korzystając z tych stron internetowych: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ lub http://www.flyrnai.org/crispr2/. </li>
		<li>W przypadku strony internetowej flycrispr wprowadź sekwencję ±100 pz otaczającą żądane miejsce knock-in (terminal N, terminal C lub dowolne interesujące nas locus genomowe). Jeśli używasz nos-Cas9 attP2 jako tła do wstrzyknięcia, wybierz opcję genomu Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). System Nos-Cas9 zapewnia ekspresję Cas9 specyficzną dla linii zarodkowej.</li>
		<li>Aby poprawić wydajność ekspresji sgRNA, wybierz cele CRISPR z opcją 5' G, ponieważ sgRNA, które zaczynają się od guaniny, zwiększą aktywność edycyjną. Następnie kliknij przycisk Znajdź cele CRISPR. Zostanie wyświetlona lista możliwych sekwencji sgRNA.</li>
		<li>Dla każdej sekwencji kliknij przycisk Oceń. Ta akcja sprawdza, czy dla każdej sekwencji nie ma potencjalnych celów wyłączonych na podstawie wcześniej wybranego genomu. Z podanej listy wybierz 2 sgRNA, które mają 0 poza celami. Upewnij się, że jeden sgRNA znajduje się w górę, a drugi w dół w stosunku do miejsca wprowadzenia. Idealnie byłoby, gdyby ich pozycje znajdowały się jak najbliżej miejsca wbicia (<200 pz), ale nie mogą się na siebie nakładać (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Czasami może być trudno znaleźć odpowiednie sgRNA dla danego genu docelowego. Odstęp między sgRNA a miejscem knock-in można zwiększyć do ± 200 pz. Użycie sgRNA, które nie inicjuje się G, może nieznacznie zmniejszyć dodatni wskaźnik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wybór znacznika fluorescencyjnego zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Znaczniki fluorescencyjne oferują różnorodny zakres cech, z których każda ma swoje unikalne zalety i wady1,2. Określając idealny znacznik fluorescencyjny do znakowania określonego białka, należy wziąć pod uwagę kluczowe kwestie opisane w poniższych krokach, które wchodzą w grę.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę, że poziomy naturalnej ekspresji białek są zazwyczaj znacznie niższe niż te obserwowane w eksperymentach z nadekspresją1,2, zacznij od znaczników, które są jasne i fotostabilne i pasują do konfiguracji eksperymentalnej. Niektóre znaczniki fluorescencyjne, w szczególności niektóre RFP, takie jak tdTomato i DsRed, mają tendencję do tworzenia multimerów14 i mogą prowadzić do agregacji białek.</li>
		<li>Aby zwiększyć wszechstronność, połącz znaczniki epitopów (np. FLAG lub V5) z markerem fluorescencyjnym za pomocą elastycznego łącznika, który umożliwia analizy biochemiczne, takie jak Western Blot lub koimmunoprecypitacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zaprojektować konsolidator, wykonaj kroki opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać optymalną funkcjonalność, upewnij się, że zarówno endogenne białko będące przedmiotem zainteresowania, jak i znacznik fluorescencyjny składają się oddzielnie do odpowiednich form funkcjonalnych. Aby to osiągnąć, użyj peptydu łącznikowego o długości od 2 do 20 aminokwasów. Na przykład umieść dwie reszty glicyny między ostatnim aminokwasem białka Period a pierwszym aminokwasem białka fluorescencyjnego mNeonGreen.</li>
		<li>Upewnij się, że te sekwencje peptydowe łącznikowe zawierają aminokwasy, takie jak glicyna i seryna, które nadają elastyczność strukturze15. Gwarantuje to, że naturalne zachowanie i lokalizacja endogennego białka pozostają niezmienione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprojektuj wektor dawcy zgodnie z poniższym opisem. 
	UWAGA: Wektor dawcy wprowadza znacznik fluorescencyjny do pożądanej lokalizacji endogennej poprzez proces naprawy kierowanej homologią, który jest inicjowany przez rozszczepienie CRISPR. W związku z tym, oprócz znacznika fluorescencyjnego, wektor dawcy musi posiadać sekwencje, które są homologiczne po obu stronach znacznika.
	<ol>
		<li>Rozpocznij projektowanie wektora dawcy od uporządkowania sekwencji DNA peptydu łącznikowego i znacznika fluorescencyjnego i upewnij się, że istnieją sekwencje homologiczne po obu końcach (ramiona homologiczne). Aby uzyskać optymalne wyniki, upewnij się, że ramiona homologii obejmują co najmniej 800 nukleotydów po każdej stronie zamierzonego miejsca wbicia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Ostatnie doniesienia sugerują, że ramiona homologii mogą być krótsze (100-200 pz)16.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie sekwencje PAM w plazmidzie dawcy są zmodyfikowane w taki sposób, aby sekwencja aminokwasowa otrzymanego białka pozostała niezmieniona. Jeśli sekwencja PAM znajduje się w UTR, usuń ją całkowicie.</li>
		<li>Położenie kodonu START i STOP zależy od lokalizacji znacznika. W przypadku znakowania wewnętrznego upewnij się, że znacznik fluorescencyjny znajduje się w ramce z sekwencją kodującą docelowego genu. W przypadku znakowania N-końcami umieść znacznik fluorescencyjny przed endogennym kodonem startowym. W przypadku znakowania C-końca należy umieścić znacznik fluorescencyjny przed naturalnym kodonem stop i upewnić się, że zachowałeś tylko jeden kodon startowy, aby uniknąć potencjalnych problemów z translacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj sgRNA i plazmidy dawcy, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>W celu tworzenia plazmidu sgRNA postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi klonowania U6-gRNA, które można znaleźć pod adresem flycrispr.org/protocols/grna/. Zastosuj alternatywne podejście do klonowania oparte na enzymach restrykcyjnych (określane jako strategia C w dostarczonym zasobie), aby wstawić sekwencję gRNA do plazmidu pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).</li>
		<li>Przekształć się w DH5a E. coli (NEB, C2987H) zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji dostarczonymi przez producenta. W celu weryfikacji należy przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera na powstałych klonach przy użyciu standardowych starterów sekwencjonowania T3 lub T7.</li>
		<li>Aby stworzyć plazmid dawcy, należy pozyskać dwuniciowe DNA z pożądaną sekwencją dawcy od dostawców komercyjnych (np. IDT). Zintegruj go z witryną wielokrotnego klonowania pBlueScriptII SK(-). Zsekwencjonuj plazmid dawcy, aby upewnić się, że sekwencje sgRNA lub PAM są prawidłowo zmodyfikowane i nie ma SNP obecnych w plazmidzie. 
		UWAGA: Alternatywą dla integracji za pomocą pBlueScriptII jest oddzielne PCR ramion homologicznych i segmentów znaczników fluorescencyjnych i skonsolidowanie ich w sieci szkieletowej przy użyciu technik takich jak Golden Gate Assembly lub Gibson Assembly.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj następującego schematu iniekcji i krzyżowania.
	<ol>
		<li>Aby pozyskać muchy z edytowaną linią zarodkową, należy jednocześnie wstrzyknąć plazmidy gRNA i plazmid dawcy do odpowiedniego tła Cas9 (np. nos-Cas9 III, BDSC 78782). Jeśli korzystasz z komercyjnych usług iniekcji, postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby wykonać przygotowanie plazmidu. 
		UWAGA: Zazwyczaj stężenie plazmidu gRNA powinno przekraczać 0,5 μg/μL, a stężenie plazmidu dawcy powinno wynosić powyżej 1,0 μg/μL. Typowy czas od wysłania próbek plazmidu do otrzymania wstrzykniętych zarodków wynosi około 2 tygodnie. Przedstawiono tutaj strategię badań przesiewowych pod kątem zdarzeń edycji genów na chromosomie X z wykorzystaniem szczepu równoważącego FM7/L. W przypadku genów na drugim lub trzecim chromosomie należy zastosować odpowiednie szczepy równoważące.</li>
		<li>W przypadku pobierania wstrzykniętych much (G0) należy znieczulić dwutlenkiem węgla i oddzielić samce much i dziewicze samice. Ustanów krzyżówki much, łącząc każdego samca G0 z co najmniej dwiema dziewiczymi samicami FM7/L w indywidualnych wąskich fiolkach z pokarmem CT. Umieść skrzyżowane fiolki w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25°C i wilgotności ~60%, aż F1 odleci (FM7/L jest najczęściej stosowanym równoważnikiem chromosomu X). Podobnie sparuj każdą samicę G0 z samcem FM7 / Y.</li>
		<li>Znieczulij i zbierz co najmniej 10 dziewiczych żeńskich potomstwa (F1) zarówno z krzyżówek męskich, jak i żeńskich G0. Z krzyżówek żeńskich G0 zbierz co najmniej 10 samców much F1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Upewnij się, że każda mucha F1 jest oznaczona szczegółami jej pochodzenia i przechowywana oddzielnie. Przejdź do etapu kontroli przesiewowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj następującego protokołu PCR na jednej nodze.
	<ol>
		<li>Tworzenie starterów: Zaprojektuj parę starterów obejmującą miejsce edycji docelowego genu. Idealnie, temperatury topnienia podkładów powinny być podobne, około 55°C.</li>
		<li>Przygotowanie buforu do lizy: Przygotować 10 μl buforu do lizy dla każdej próbki muchy. Bufor składa się z 10 mM Tris (pH 8,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 25 mM NaCl i 400 μg/ml proteinazy K. Przygotuj bufor do lizy jako mieszankę główną, a następnie rozprowadź 10 μl w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR. Upewnij się, że bufor pozostaje zimny przez cały proces rozwarstwiania nóg (Rysunek 3B).</li>
		<li>Konfiguracja probówki: Przygotuj szklane rurki kapilarne, wypełniając jeden koniec pokarmem z sacharozą i agarem (2% agaru i 4% sacharozy) i umieść je w 96-dołkowej płytce z głęboką studnią, która będzie określana jako hotel muchowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C).</li>
		<li>Rozwarstwienie nóg: Umieść podkładkę znieczulającą z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym, znieczul jedną kandydatkę na muchę i odetnij jedną ze środkowych nóg. Umieść nogę w buforze do lizy, zapewniając całkowite zanurzenie. Nie ma potrzeby maceracji nogi, należy bezpośrednio przejść do etapu protokołu lizy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Przytrzymaj skrzydło muchy parą cienkich metalowych kleszczy, przenieś muchę do hotelu muchowego i natychmiast uszczelnij rurkę przędzą.</li>
		<li>Próbki kontrolne: Dwie muchy typu dzikiego mogą być wykorzystane jako kontrole ujemne zgodnie z tą samą procedurą preparacji nóg. Rozcieńczony plazmid dawcy służy jako kontrola pozytywna.</li>
		<li>Opieka po sekcji: Umieść hotel muchowy w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 °C i wilgotności ~60%. Chociaż muchy mogą przetrwać noc, zaleca się wykonanie kolejnych kroków i krycie w ciągu tego samego dnia.</li>
		<li>Protokół lizy: Umieścić odcięte nogi w roztworze buforowym do lizy w termocyklerze ustawionym na 37 °C na 90 minut, następnie w temperaturze 95 °C na 5 minut, a na koniec w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na wyekstrahowanie wystarczającej ilości DNA z pojedynczej nogi każdej muchy (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
		<li>Reakcja PCR: Zorganizuj reakcję PCR zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując 1,5 μl lizatu z nóg muchy jako źródło DNA.</li>
		<li>Elektroforeza żelowa: Poddaj produkty PCR elektroforezie w żelu agarozowym. Zinterpretuj wyniki z żelu na podstawie rozmiaru pasma. Zazwyczaj muchy z kontrolą ujemną wykazują niższy prążek, a dodatnie kontrole plazmidowe wykazują wyższy pasek. Upewnij się, że określone rozmiary pasm są zgodne z oryginalnym projektem plazmidu dawcy. Samice much dodatnich będą miały dwa prążki, ponieważ są heterozygotyczne, a samce dodatnie będą prezentować pojedyncze prążki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B). 
		UWAGA: Zazwyczaj w ciągu jednego dnia udaje się przebadać 70 much. Upewnij się, że zidentyfikowałeś co najmniej 10 dodatnich much F1 w 4 do 5 różnych krzyżówkach G0, ponieważ niektóre F1 mogą być bezpłodne z powodu mutacji poza celem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź następującą konfigurację krzyżową po PCR.
	<ol>
		<li>Na podstawie wyników żelu wybierz dodatnie muszki z hotelu dla much i indywidualnie skrzyżuj je z muchami równoważącymi (FM7 / L do znakowania genów chromosomu X), aby wytworzyć pokolenie F2. Gdy pojawi się pokolenie F2, ustal krzyżówki rodzeństwa, aby stworzyć homozygotyczne stabilne stada (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
		<li>Użyj homozygotycznych kolb do sekwencjonowania Sangera w miejscu edycji, aby zapewnić dokładność. Zweryfikowane przez krzyżowanie wsteczne linie muchowe z muchami typu dzikiego w celu usunięcia mutacji tła. Badanie przesiewowe każdej generacji przy użyciu protokołu PCR na jednej nodze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transience+of+transient+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiMIC%3A+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li>
<li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068(2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li>
<li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539(2019).</li>
<li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li>
<li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077(2022).</li>
<li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li>
<li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li>
<li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wyniki pokazują uproszczoną, prostą, jednoetapową strategię znakowania endogennych genów u Drosophila, opartą na CRISPR. W protokole używamy dwóch gRNA, aby skuteczniej indukować pękanie podwójnej nici DNA i rekombinację homologiczną. GRNA i plazmid dawcy są wstrzykiwane do zarodków muszek owocowych, które wyrażają enzym Cas9 w swojej linii zarodkowej. Zarodki te są następnie hodowane w standardowych warunkach aż do osiągnięcia dorosłości, kiedy to są krzyżowane z muchami równoważącymi w celu uzyskania potomstwa pierwszego pokolenia (F1). Genotypowanie PCR przeprowadza się na środkowej nodze każdej próbki F1 w celu przeprowadzenia badań przesiewowych na obecność genetycznie zmodyfikowanych much. Metoda ta zapewnia znaczną przewagę nad obecnymi metodami badań przesiewowych, które wykorzystują dwa etapy badań przesiewowych, z których pierwszy polega na użyciu widocznego markera, takiego jak kolor oczu, w celu zidentyfikowania odpowiedniego genotypu, a drugi etap polega na usunięciu markera koloru oczu10. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystującą PCR na DNA wyekstrahowanym z małego segmentu środkowej nogi pojedynczej muchy, co pozwala na nieśmiertelne genotypowanie poszczególnych much, oferując bardziej wydajną i opłacalną alternatywę dla istniejących metod. Metoda ta umożliwia badania przesiewowe zwierząt kandydujących pojedynczo lub partiami, aż do wyizolowania odpowiedniego genotypu. Liczba zwierząt poddawanych badaniom przesiewowym przed wyizolowaniem odpowiednich stad różni się w zależności od eksperymentu, w zależności od wielu czynników, w tym skuteczności wybranych sgRNA, skuteczności wstrzyknięcia, insercji poza celem, które mogą wpływać na żywotność. Alternatywnie, DNA z pojedynczych skrzydeł pojedynczych much może być również wykorzystane do celów genotypowania18.
Możliwe jest, że dodanie znacznika do N- lub C-końca genu może niekorzystnie wpłynąć na funkcję genu, co może potencjalnie wpłynąć na żywotność muszek. Jeśli dostępne są informacje o strukturze białka, można je wykorzystać do określenia, czy znakowanie N- lub C-końcowych może lepiej zachować funkcję i lokalizację natywnego białka. Zawsze zaleca się przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych, w tym testowanie, czy znakowane białko wykazuje podobny wzorzec lokalizacji jak białko typu dzikiego za pomocą metod barwienia przeciwciał. Ta sama strategia badań przesiewowych może być stosowana do badań przesiewowych innych rodzajów insercji lub delecji genetycznych opartych na CRISPR. Podsumowując, jednoetapowa strategia badań przesiewowych znacznie ułatwia generowanie much edytowanych przez CRISPR i otwiera wiele możliwości badania subkomórkowej lokalizacji i dynamiki endogennych genów w ich naturalnym kontekście.

Białka fluorescencyjne stały się potężnymi narzędziami do wizualizacji lokalizacji, dynamiki i interakcji białko-białko w komórkach w organizmach żywych1,2. Znakowanie endogennych genów białkami fluorescencyjnymi umożliwia długoterminowe obrazowanie procesów komórkowych na żywo z rozdzielczością subkomórkową. Co więcej, te endogenne techniki znakowania genów mają kilka zalet w porównaniu z metodami nadekspresji i barwienia immunologicznego. Na przykład nadekspresja białek może prowadzić do nieprawidłowego fałdowania białek, niespecyficznych interakcji białko-białko i błędnej lokalizacji3. Do tej pory naukowcom udało się stworzyć ogromne biblioteki endogennych genów połączonych z białkami fluorescencyjnymi dla kilku organizmów modelowych, takich jak pączkujące drożdże, które mogą ulegać wydajnej rekombinacji homologicznej4. W przypadku Drosophila melanogaster opracowano różne narzędzia, takie jak MiMICs5, transpozon-based enhancer traps6 i fosmids7 zostały opracowane do fluorescencyjnego oznaczania genów.
Rozwój narzędzi opartych na CRISPR-Cas9 umożliwił efektywne przeprowadzanie edycji genomu, w tym znakowanie białek endogennych, w szerokim zakresie organizmów modelowych8,9. Cas9 to enzym kierowany przez RNA, który rozszczepia dwuniciowe DNA w bardzo wydajny i specyficzny sposób8, który może być następnie naprawiony przez niehomologiczny szlak łączenia końców (NHEJ) prowadzący do mutacji punktowych lub delecji. Alternatywnie, szlak naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) umożliwia integrację heterologicznego DNA z chromosomem.
Poprzednie metody znakowania genów w organizmie modelowym, Drosophila melanogaster, oparte na CRISPR, opierały się na dwuetapowym procesie10,11,12. Polega to na użyciu rozpoznawalnego markera koloru oczu, Dsred, do wykrywania udanych zdarzeń HDR. Następnie marker Dsred zostałby wycięty przy użyciu systemu rekombinacji Cre/loxP. Aby usprawnić i przyspieszyć ten proces, przedstawiamy tutaj prostszą i bardziej wydajną metodę. Takie podejście pozwala obejść potrzebę śmiertelnego genotypowania i pozwala na bezpośrednie badanie przesiewowe poszczególnych much. W szczególności stosujemy podejście oparte na PCR, aby wyekstrahować DNA z niewielkiego segmentu środkowej nogi muchy, co pozwala nam na genotypowanie poszczególnych much. Warto zauważyć, że procedura ta nie zagraża witalności, ruchowi ani zdolnościom reprodukcyjnym muchy, od której pobrano próbkę. Tylko odpowiednie osobniki, zidentyfikowane za pomocą tej metody, są dalej rozwijane w stabilne stada.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół generowania fluorescencyjnych muszek oznaczonych białkiem, w których endogenne geny są znakowane za pomocą fluorescencyjnych reporterów. Technika ta wykorzystuje edycję genomu CRISPR-Cas9 do fuzji dowolnego pożądanego znacznika fluoroforowego z N- lub C- końcem endogennego genu. Poniżej opisujemy projektowanie i budowę plazmidów gRNA i plazmidu dawcy, jednoetapową strategię badań przesiewowych w celu wyboru much CRISPR-dodatnich oraz kroki w celu ustalenia stabilnych linii. W szczególności opisujemy strategie znakowania endogennego genu Drosophila zegara rdzeniowego, kropka, za pomocą fluoroforu na C-końcu. Pokrótce opisujemy również eksperymenty kontrolne, które należy przeprowadzić, aby potwierdzić, że oznaczone białko jest funkcjonalne oraz techniki obrazowania na żywo w celu wizualizacji białka Period w żywych neuronach zegarowych w nienaruszonych mózgach Drosophila13. Opisany tutaj protokół ma również szerokie zastosowanie do kandydatów do badań przesiewowych pod kątem delecji i insercji określonych fragmentów DNA poprzez edycję genomu CRISPR-Cas9.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5-alfa Kompetentny&nbsp;E. coli&nbsp;( Wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka głębinowa</td><td>BRAND</td><td>701354</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>QIAGEN</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Gibco</td><td>21720001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduLigaza DNA Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o crispr u drosophila melanogaster

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Badanie lokalizacji, dynamiki i regulacji subkomórkowej białek w żywych komórkach uległo głębokiej transformacji dzięki pojawieniu się technik, które pozwalają na znakowanie endogennych genów w celu produkcji fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Metody te umożliwiają naukowcom wizualizację zachowania białek w czasie rzeczywistym, dostarczając cennych informacji na temat ich funkcji i interakcji w środowisku komórkowym. Wiele obecnych badań nad znakowaniem genów wykorzystuje dwuetapowy proces, w którym widoczne markery, takie jak zmiany koloru oczu, są wykorzystywane do identyfikacji organizmów modyfikowanych genetycznie w pierwszym etapie, a widoczny marker jest wycinany w drugim etapie. W tym miejscu przedstawiamy jednoetapowy protokół do wykonywania precyzyjnego i szybkiego endogennego znakowania genów u Drosophila melanogaster, który umożliwia badania przesiewowe w kierunku zmodyfikowanych linii bez widocznego markera oka, oferując znaczną przewagę nad wcześniejszymi metodami. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem udanych zdarzeń znakowania genów, stosujemy technikę opartą na PCR do genotypowania poszczególnych muszek poprzez analizę małego segmentu z ich środkowej nogi. Muchy, które przejdą kryteria przesiewowe, są następnie wykorzystywane do produkcji stabilnych stad. W tym miejscu szczegółowo opisujemy projekt i budowę plazmidów do edycji CRISPR oraz metody badań przesiewowych i potwierdzania linii inżynieryjnych. Łącznie protokół ten znacznie poprawia skuteczność endogennego znakowania genów u Drosophila i umożliwia badania procesów komórkowych in vivo.

W naszych eksperymentach zazwyczaj wykazywaliśmy wskaźnik sukcesu na poziomie ~20%-30% w badaniach przesiewowych dla różnych endogennych genów oznaczonych na wszystkich chromosomach (X, II, III). Wydajność tego procesu może się różnić w zależności od kilku czynników, takich jak selekcja gRNA, charakter genu i jakość wstrzyknięcia. Tutaj ilustrujemy wyniki naszej strategii oznaczania endogennego genu okresu za pomocą mNeonGreen fluorophore13. Gen menstruacyjny, umieszczony na chromosomie X D. melanogaster, odgrywa kluczową rolę w zegarze okołodobowym. Drosophila ma dobrze scharakteryzowaną sieć zegarową składającą się z około 150 neuronów zegarowych, które wyrażają białka zegarowe17.
Oznaczyliśmy białko Period zielonym białkiem fluorescencyjnym mNeonGreen na jego C-końcowym końcu, połączonym łącznikiem z podwójną glicyną13. Po wstrzyknięciu plazmidu skrzyżowaliśmy muchy G0 z balanserem FM7/L, a następnie zebraliśmy pokolenie F1. Spośród 126 much F1 przebadanych przy użyciu specjalistycznych starterów PCR (Tabela 1), zidentyfikowaliśmy 47 pozytywnych przypadków, co dało 37,3% wskaźnik sukcesu. Spośród nich wybraliśmy 5 osobników F1, aby założyć dodatkowe krzyżówki w celu uzyskania stabilnych stad. Płeć nie miała wpływu na odsetek pozytywnych wyników podczas tego badania przesiewowego. Po zweryfikowaniu dokładności sekwencji znakowanego genu przeprowadziliśmy testy kontrolne, w tym oceny behawioralne i oceny qPCR, aby zapewnić oscylacje mRNA w celu potwierdzenia funkcjonalności znakowanego białka (PERIOD-mNeonGreen)13.
Aby przeprowadzić eksperymenty z obrazowaniem na żywo, skrzyżowaliśmy te muchy PERIOD-mNeonGreen z Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdMucha pomidorowa, gdzie Clock856-GAL4 oznacza wszystkie neurony zegarowe19, a CD4 to białko transbłonowe, które znakuje błony komórkowe. W eksperymentach obrazowania na żywo przeprowadziliśmy sekcję 3-4 dorosłych mózgów za pomocą lodowatego podłoża Drosophila Schneidera. Mózgi zostały zamontowane i zobrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego Airyscan. Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne obrazy przedstawiające białko PERIOD w neuronach zegarowych w mózgach Drosophila.
<img alt="Schemat klonowania sgRNA i plazmidu dawcy, szczegółowo opisujący wstrzyknięcie zarodka CRISPR i genetyczne badania przesiewowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9. Protokół przedstawia szereg kroków mających na celu zaprojektowanie i złożenie sgRNA i plazmidów dawcy, a następnie badanie przesiewowe metodą PCR na jednej nodze i produkcję stabilnych linii inżynieryjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram edycji genów CRISPR-Cas9; pokazuje sgRNA, Cas9, naprawę DNA, naprawę ukierunkowaną na homologię." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat edycji genomu CRISPR/Cas9 w celu wygenerowania muchek period-mNeonGreen. (A) Schemat ilustrujący dodanie znacznika białka fluorescencyjnego do C-końca endogennego genu. (B) Gen okresu endogennego (per) jest znakowany mNeonGreen, jasnym, monomerycznym zielonym białkiem fluorescencyjnym na końcu karboksylowym. Dwa sgRNA znajdują się odpowiednio w ostatnim eksonie i 3'UTR. Wektor donorowy zawiera dwie sekwencje homologii ~1 kb flankujące znacznik mNeonGreen. Kodon stop jest dodawany na końcu znacznika w celu prawidłowego zakończenia tłumaczenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przesiewowy much: krzyżówki genetyczne i metoda PCR, schemat, ekstrakcja genomowego DNA, elektroforeza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia badania przesiewowego muszek z pozytywnym wynikiem CRISPR. (A) Podejście do wstępnego badania krzyżówek genetycznych dla genów przeznaczonych do znakowania CRISPR na chromosomach X i II. G0 oznacza muchy, którym wstrzyknięto początkowo wstrzyknięcie, podczas gdy F1 reprezentuje ich potomstwo w pierwszym pokoleniu, które wymaga badań przesiewowych. (B) Przedstawiono metodę przesiewową PCR na jednym odcinku oraz czas trwania każdego etapu procedury. (C) Pokazane tutaj jest zdjęcie Fly Hotelu. Szklane rurki są wypełnione pokarmem na muchy i uszczelnione na jednym końcu. Pojedyncze muchy są ładowane do pojedynczych rurek. Po przebadaniu DNA wyekstrahowanego ze środkowej diody poszczególnych much, odpowiednie muchy są pobierane z hotelu dla much i ustalane są stabilne linie. (D) Podejście polegające na ustawieniu krzyżówek po kontroli przesiewowej much (pokazanych tutaj na niebiesko), które przeszły test przesiewowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek; ZT0-ZT2; lokalizacja białek; porównanie procesów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy białka PERIOD-mNeonGreen w neuronach zegarowych. Reprezentatywne zdjęcia z okresu-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdMuchy pomidorowe porwane do cykli Światło-Ciemność. ZT odnosi się do czasu Zeitgeber, a ZT0 odnosi się do czasu włączenia świateł, a ZT12 odnosi się do czasu wyłączenia świateł. Otoczka jądrowa neuronu zegarowego jest oznaczona tdTomato, pokazanym tutaj na czerwono, a białko PERIOD jest oznaczone mNeonGreen i pokazane na zielono. Białko PERIOD jest zorganizowane w dyskretne ogniska jądrowe w późnych godzinach nocnych i wczesnoporannych. Podziałka skali, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nazwa</td>
			<td>Sekwencja DNA (od 5 'do 3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elementarz przesiewowy z okresu do przodu</td>
			<td>ATACTCGTCCATAGACCACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rewers podkładu do badań przesiewowych okresowych</td>
			<td>ACATTATCCTCGGCTTGCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA1-sense</td>
			<td>cttcACCAGACACAGCACGGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA1-antysens</td>
			<td>aaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA2-sense</td>
			<td>cttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA2-antysens</td>
			<td>aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ramiona homologii okresu i wstawka mNeonGreen</td>
			<td>GAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA 
			GGGCGACCTGACCATTCGGGGTTGAACGATGTGCACA 
			CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC 
			TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC 
			AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat 
			gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT 
			TTGACCTGTCGAATCTTCAACGAACAAGGAGC 
			GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT 
			GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC 
			AACGAGGTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT 
			ACAGAGTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT 
			CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT 
			CCGGTCTAACTAGCCACTCTAATTACTGATTAAA 
			CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA 
			AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT 
			TTATTGTACAATAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA 
			AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC 
			CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATCTGATTAAACAT 
			AGGATAGATATCATCTAAAAGCTGCTTGGCTTGAGAT 
			CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT 
			CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTCTTCTCTCTTTCTCGGA 
			TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT 
			TCGAAGAActtgaaggaaggaagggagttaggaataggaactggtgg 
			gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcactcca 
			GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATCATC 
			CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT 
			CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTACAGTTCGTGT 
			CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT 
			TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT 
			TTCGAAAGACATACATCGGGGTTGGTTGGATAGTTAG 
			CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTTCGCGCT 
			GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC 
			CATTTGAAAGTGGAAATAATCTTATCATTGGGGTAG 
			GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC 
			GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGAAACCCG 
			TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATATGGCTACCT 
			TCGTAAGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC 
			CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC 
			GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC 
			CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG 
			ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT 
			CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC 
			GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTGACCATATC 
			GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG 
			CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC 
			TTCACCCTTCGACACACCTCCGCCGTCGCCGTGCTGCT 
			GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATCTTGC 
			TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta 
			cattgaatcgcatcgtggactgtacgtacacCTTCAGCTTTCGG 
			TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTGTGTCCGGCGGACTCTC 
			CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA 
			AGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA 
			TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc 
			ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT 
			GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTGT 
			GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA 
			GGAGTCCGGCACCTCCTTCTTGCAGGGATCGGATA 
			CCGCTGCACTGGAGCCCCCCTCCGTCTTGACGGA 
			TGCGCTCTGCGAGGGACGCTGCACCTGGGC 
			AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC 
			TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta 
			tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccaccccactg 
			acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG 
			AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG 
			GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT 
			GGCCGTGGGCGGGCCGCCGGGTGTGTGTAG 
			AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT 
			GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGGGGGCGGCA 
			GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGC 
			CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG 
			CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGCGGGGA 
			TGTAGTAGAAGGTCGGGAAGGGGGGGGGGGGGAGGA 
			GAAGCTGCTGGGCCATGGCCGTGTGCGGGGGG 
			TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG 
			GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA powiedział:</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista sekwencji sgRNA do oznaczania endogennego genu okresu na końcu C oraz starterów używanych do przeprowadzania badań przesiewowych PCR na jednej nodze.

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Celem tego protokołu jest wygenerowanie endogennej edytowanej linki muchowej. Jako przykład pokazujemy białko fluorescencyjne knock-in, ale można je również zastosować do innych knock-in, knockout, a także generowania mutacji. Nasz protokół jest metodą opartą na rekombinacji homologicznej CRISPR, więc nie ma prawie żadnych ograniczeń co do miejsc mutacji.Co więcej, nasz protokół znacznie skrócił czas i wysiłek związany z etapami genotypowania. Aby rozpocząć, otwórz stronę internetową fly CRISPR, aby zaprojektować sgRNA dla Drosophila i wprowadź około 100 sekwencji par zasad otaczających żądane miejsce knock-in. Wybierz cele CRISPR z opcją pięciu głównych guanin.Kliknij przycisk znajdź cele CRISPR, aby wygenerować listę możliwych sekwencji sgRNA. Następnie kliknij przycisk oceny dla każdej sekwencji i wybierz dwa sgRNA, które nie mają żadnych niedocelowych elementów. Ponieważ naturalne poziomy ekspresji białek są zazwyczaj znacznie niższe, wybierz znaczniki fluorescencyjne, które są jasne i fotostabilne oraz pasują do konfiguracji eksperymentalnej.Następnie zaprojektuj łącznik, aby połączyć znaczniki epitopów z markerem fluorescencyjnym w celu analizy biochemicznej. Użyj peptydu łącznikowego w zakresie od dwóch do 20 aminokwasów, w tym aminokwasów takich jak glicyna i seryna. Aby zaprojektować wektor dawcy dla Drosophila, uporządkuj sekwencję DNA peptydu łącznikowego i znacznika fluorescencyjnego oraz zapewnij sekwencje homologiczne po obu końcach.Zmodyfikuj dowolne sekwencje PAM w plazmidzie dawcy, aby utrzymać powstałą sekwencję aminokwasów białek. Następnie ustaw kodony start i stop w zależności od lokalizacji znacznika. W przypadku znakowania wewnętrznego upewnij się, że znacznik fluorescencyjny znajduje się w ramce z sekwencją kodującą docelowego genu.W przypadku znakowania N-końca, umieść znacznik fluorescencyjny za endogennym kodonem startowym. W przypadku znakowania C-końca należy umieścić znacznik fluorescencyjny przed naturalnym kodonem stop. Upewnij się, że zachowałeś tylko jeden kodon startowy, aby uniknąć potencjalnych problemów z translacją.Użyj alternatywnego podejścia do klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych, aby wprowadzić sekwencję sgRNA do plazmidu plazmidu U6 Bbs1-chiRNA. Po utworzeniu plazmidu sgRNA przekształć plazmid w DH5-Alpha Escherichia coli zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj powstałe klony za pomocą sekwencjonowania Sangera, używając standardowych starterów sekwencjonowania T3 lub T7.Aby stworzyć plazmid dawcy, użyj dwuniciowego DNA o pożądanej sekwencji i zintegruj go z plazmidem Bluesript 2SK ujemnym miejscem wielokrotnego klonowania. Sekwencjonuj plazmid dawcy, aby upewnić się, że sekwencje sgRNA lub PAM są prawidłowo zmodyfikowane i nie ma SNP obecnych w plazmidzie. Następnie weźmy muchy Cas9, którym wstrzyknięto skonstruowane gRNA i plazmidy dawcy.Znieczulij muchy dwutlenkiem węgla i oddziel samce much i dziewicze samice. Aby ustanowić krzyżówki much, sparuj każdego samca G zero z co najmniej dwiema dziewiczymi samicami FM7L w indywidualnych wąskich fiolkach z pokarmem CT. Umieść skrzyżowane fiolki w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%, aż F1 odleci w pobliżu.Następnie znieczulij i zbierz co najmniej 10 dziewiczych żeńskich potomstwa zarówno z krzyżówek męskich, jak i żeńskich G zero. Upewnij się, że każda mucha F1 jest oznaczona szczegółami jej pochodzenia i przechowywana oddzielnie. Aby przebadać muszki pod kątem PCR, zaprojektuj startery o temperaturze topnienia około 55 stopni Celsjusza, które obejmują miejsce edycji docelowego genu.Przygotuj bufor do lizy dla każdej próbki muchy i dozuj 10 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR. Utrzymuj bufor w niskiej temperaturze podczas procesu rozwarstwiania nóg. Następnie przygotuj szklane rurki kapilarne, wypełniając jeden koniec sacharozą agarem.Umieść te probówki w 96-dołkowej płycie studziennej, zwanej hotelem muchowym. W celu rozwarstwienia nogi umieść podkładkę znieczulającą z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym. Znieczul kandydata na muchę i odetnij jedną z jej środkowych nóg.Następnie zanurz nogę w buforze do lizy. Przytrzymaj skrzydło muchy za pomocą cienkich metalowych kleszczy. Przenieś muchę do hotelu muchowego i natychmiast uszczelnij rurkę przędzą.Umieść hotel muchowy w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Zanurz odcięte nogi w roztworze buforu do lizy w termocyklerze. Zorganizuj reakcję PCR zgodnie z instrukcją producenta, używając 1,5 mikrolitra lizatu z nóg muchy jako źródła DNA.Poddaj produkty PCR elektroforezie w żelu agarozowym i zinterpretuj wyniki na podstawie rozmiaru prążka. Na podstawie wyników żelu wybierz dodatnie muchy z hotelu muchowego i indywidualnie skrzyżuj je z muchami balansującymi, aby uzyskać pokolenie F2. Użyj homozygotycznych kolb do sekwencjonowania Sangera w miejscu edycji, aby zapewnić dokładność.Zatwierdzone krzyżowo linie muchowe z muchami typu dzikiego w celu usunięcia mutacji tła. Badanie przesiewowe każdej generacji przy użyciu protokołu PCR na jednej nodze. Konfokalne obrazy mikroskopowe mózgów dorosłych Drosophila wykazały białko miesiączkowe zorganizowane w dyskretne ogniska jądrowe w późnych godzinach nocnych i wczesnoporannych.Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten jest solidny, jeśli startery PCR do genotypowania są specyficzne.

one-step-crispr-based-strategy-for-endogenous-gene-tagging-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj uproszczoną metodę endogennego znakowania genów w Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR i PCR. Protokół skraca czas genotypowania i umożliwia tworzenie stabilnych linii z fluorescencyjnymi białkami.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów