Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster
26 stycznia 2024
Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.
Celem tego protokołu jest wygenerowanie endogennej edytowanej linki muchowej. Jako przykład pokazujemy białko fluorescencyjne knock-in, ale można je również zastosować do innych knock-in, knockout, a także generowania mutacji. Nasz protokół jest metodą opartą na rekombinacji homologicznej CRISPR, więc nie ma prawie żadnych ograniczeń co do miejsc mutacji.
Co więcej, nasz protokół znacznie skrócił czas i wysiłek związany z etapami genotypowania. Aby rozpocząć, otwórz stronę internetową fly CRISPR, aby zaprojektować sgRNA dla Drosophila i wprowadź około 100 sekwencji par zasad otaczających żądane miejsce knock-in. Wybierz cele CRISPR z opcją pięciu głównych guanin.
Kliknij przycisk znajdź cele CRISPR, aby wygenerować listę możliwych sekwencji sgRNA. Następnie kliknij przycisk oceny dla każdej sekwencji i wybierz dwa sgRNA, które nie mają żadnych niedocelowych elementów. Ponieważ naturalne poziomy ekspresji białek są zazwyczaj znacznie niższe, wybierz znaczniki fluorescencyjne, które są jasne i fotostabilne oraz pasują do konfiguracji eksperymentalnej.
Następnie zaprojektuj łącznik, aby połączyć znaczniki epitopów z markerem fluorescencyjnym w celu analizy biochemicznej. Użyj peptydu łącznikowego w zakresie od dwóch do 20 aminokwasów, w tym aminokwasów takich jak glicyna i seryna. Aby zaprojektować wektor dawcy dla Drosophila, uporządkuj sekwencję DNA peptydu łącznikowego i znacznika fluorescencyjnego oraz zapewnij sekwencje homologiczne po obu końcach.
Zmodyfikuj dowolne sekwencje PAM w plazmidzie dawcy, aby utrzymać powstałą sekwencję aminokwasów białek. Następnie ustaw kodony start i stop w zależności od lokalizacji znacznika. W przypadku znakowania wewnętrznego upewnij się, że znacznik fluorescencyjny znajduje się w ramce z sekwencją kodującą docelowego genu.
W przypadku znakowania N-końca, umieść znacznik fluorescencyjny za endogennym kodonem startowym. W przypadku znakowania C-końca należy umieścić znacznik fluorescencyjny przed naturalnym kodonem stop. Upewnij się, że zachowałeś tylko jeden kodon startowy, aby uniknąć potencjalnych problemów z translacją.
Użyj alternatywnego podejścia do klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych, aby wprowadzić sekwencję sgRNA do plazmidu plazmidu U6 Bbs1-chiRNA. Po utworzeniu plazmidu sgRNA przekształć plazmid w DH5-Alpha Escherichia coli zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj powstałe klony za pomocą sekwencjonowania Sangera, używając standardowych starterów sekwencjonowania T3 lub T7.
Aby stworzyć plazmid dawcy, użyj dwuniciowego DNA o pożądanej sekwencji i zintegruj go z plazmidem Bluesript 2SK ujemnym miejscem wielokrotnego klonowania. Sekwencjonuj plazmid dawcy, aby upewnić się, że sekwencje sgRNA lub PAM są prawidłowo zmodyfikowane i nie ma SNP obecnych w plazmidzie. Następnie weźmy muchy Cas9, którym wstrzyknięto skonstruowane gRNA i plazmidy dawcy.
Znieczulij muchy dwutlenkiem węgla i oddziel samce much i dziewicze samice. Aby ustanowić krzyżówki much, sparuj każdego samca G zero z co najmniej dwiema dziewiczymi samicami FM7L w indywidualnych wąskich fiolkach z pokarmem CT. Umieść skrzyżowane fiolki w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%, aż F1 odleci w pobliżu.
Następnie znieczulij i zbierz co najmniej 10 dziewiczych żeńskich potomstwa zarówno z krzyżówek męskich, jak i żeńskich G zero. Upewnij się, że każda mucha F1 jest oznaczona szczegółami jej pochodzenia i przechowywana oddzielnie. Aby przebadać muszki pod kątem PCR, zaprojektuj startery o temperaturze topnienia około 55 stopni Celsjusza, które obejmują miejsce edycji docelowego genu.
Przygotuj bufor do lizy dla każdej próbki muchy i dozuj 10 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR. Utrzymuj bufor w niskiej temperaturze podczas procesu rozwarstwiania nóg. Następnie przygotuj szklane rurki kapilarne, wypełniając jeden koniec sacharozą agarem.
Umieść te probówki w 96-dołkowej płycie studziennej, zwanej hotelem muchowym. W celu rozwarstwienia nogi umieść podkładkę znieczulającą z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym. Znieczul kandydata na muchę i odetnij jedną z jej środkowych nóg.
Następnie zanurz nogę w buforze do lizy. Przytrzymaj skrzydło muchy za pomocą cienkich metalowych kleszczy. Przenieś muchę do hotelu muchowego i natychmiast uszczelnij rurkę przędzą.
Umieść hotel muchowy w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Zanurz odcięte nogi w roztworze buforu do lizy w termocyklerze. Zorganizuj reakcję PCR zgodnie z instrukcją producenta, używając 1,5 mikrolitra lizatu z nóg muchy jako źródła DNA.
Poddaj produkty PCR elektroforezie w żelu agarozowym i zinterpretuj wyniki na podstawie rozmiaru prążka. Na podstawie wyników żelu wybierz dodatnie muchy z hotelu muchowego i indywidualnie skrzyżuj je z muchami balansującymi, aby uzyskać pokolenie F2. Użyj homozygotycznych kolb do sekwencjonowania Sangera w miejscu edycji, aby zapewnić dokładność.
Zatwierdzone krzyżowo linie muchowe z muchami typu dzikiego w celu usunięcia mutacji tła. Badanie przesiewowe każdej generacji przy użyciu protokołu PCR na jednej nodze. Konfokalne obrazy mikroskopowe mózgów dorosłych Drosophila wykazały białko miesiączkowe zorganizowane w dyskretne ogniska jądrowe w późnych godzinach nocnych i wczesnoporannych.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten jest solidny, jeśli startery PCR do genotypowania są specyficzne.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia uproszczony protokół znakowania endogennych genów u Drosophila, wykorzystujący technikę opartą na PCR do identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych bez użycia markerów. Podejście to ułatwia tworzenie stabilnych linii typu knock-in, co wykazano na przykładzie białka fluorescencyjnego, i może być adaptowane do dodatkowych modyfikacji genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Badania nad Drosophila
Wstęp
- Technologie edycji genów, takie jak CRISPR, przyspieszyły wprowadzanie modyfikacji genetycznych w organizmach modelowych.
- Tagowanie endogenne pozwala na obserwację zachowania i interakcji białek.
- Wydajne metody genotypowania są niezbędne do potwierdzenia pomyślnego przeprowadzenia modyfikacji.
Cel badania
- Aby usprawnić proces tworzenia i potwierdzania genetycznie zmodyfikowanych linii Drosophila.
- Aby dostarczyć protokół minimalizujący czas trwania procedur genotypowania.
- Aby rozszerzyć możliwości zastosowania technik homologicznej rekombinacji CRISPR.
Zastosowane metody
- Wykorzystano rekombinację homologiczną CRISPR u Drosophila w celu edycji genów.
- Kluczowe działania obejmowały projektowanie sgRNA oraz konstrukcję plazmidów donora.
- Przeprowadzono przesiew PCR zmodyfikowanych linii w celu walidacji poprawności edycji.
- Krytyczne etapy obejmowały sekcję odnóży w celu pobrania próbek oraz amplifikację PCR z wykorzystaniem specyficznych starterów.
Główne wyniki
- Badanie pomyślnie zademonstrowało wydajną metodę generowania knock-inów białek fluorescencyjnych u Drosophila.
- Wskazano na skrócenie czasu genotypowania oraz zwiększenie dokładności w potwierdzaniu edycji genetycznych.
- Otrzymane linie much wykazywały pożądane wzorce lokalizacji białek, niezbędne do dalszych badań biologicznych.
Wnioski
- Niniejszy protokół znacznie upraszcza generowanie i walidację genetycznie zmodyfikowanych linii Drosophila.
- Zwiększa on możliwości badawcze w zakresie wykorzystania modeli Drosophila w różnorodnych badaniach genetycznych.
- Wydajność i elastyczność tej metody mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji białek oraz interakcji genów in vivo.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne znakowanie endogennych genów u Drosophila melanogaster przyspiesza walidację funkcji i lokalizacji białek, wspierając wczesne odkrycia oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) biofarmaceutycznym. Jednoetapowy protokół oparty na CRISPR z przesiewaniem metodą PCR eliminuje zależność od markerów widzialnych, usprawniając generowanie stabilnych, genetycznie zmodyfikowanych linii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną i efektywność selekcji projektów poprzez umożliwienie szybkiego, bezmarkerowego potwierdzenia modyfikacji genetycznych w modelach systemowych istotnych dla przebiegu chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmacydycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę lokalizacji i funkcji białek in vivo w celu walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnego znakowania endogennego bez użycia markerów egzogennych.
- Ułatwia szybkie generowanie linii genetycznie zdefiniowanych do badań opartych na hipotezach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane, wolne od markerów systemy biologiczne do późniejszego przesiewu fenotypowego.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów dzięki genotypowaniu opartemu na PCR.
- Umożliwia skalowalną produkcję zmodyfikowanych linii do rzetelnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera rozwój modeli istotnych dla chorób poprzez umożliwienie prowadzenia badań in vivo nad dynamiką białek.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki wykorzystaniu stabilnych, scharakteryzowanych genetycznie linii.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w badaniach translacyjnych poprzez potwierdzenie precyzyjnych edycji genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten jednowykrokowy protokół znakowania CRISPR integruje się z procesem wczesnego odkrywania i identyfikacji wiodących cząsteczek, stanowiąc podstawę dla późniejszych badań przesiewowych i badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie wizualizacji zachowania białek w czasie rzeczywistym.
- Skrining: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych linii bezmarkerowych, odpowiednich do ilościowych analiz fenotypowych.
- Analityka: Wykorzystuje genotypowanie oparte na PCR oraz sekwencjonowanie metodą Sangera w celu rzetelnego potwierdzenia modyfikacji genetycznych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli chorób poprzez umożliwienie śledzenia białek in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat postępowania dla różnorodnych zastosowań edycji i tagowania genów u Drosophila.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia genotypowanie, zwiększa powtarzalność i wspiera skalowalną generację linii.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie walidacji modelu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modeli genetycznie zmodyfikowanych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu projektowania CRISPR, konstrukcji plazmidów oraz genetyki Drosophila.
- Wymagany dostęp do infrastruktury PCR, sekwencjonowania metodą Sangera oraz mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga standaryzacji protokołów genotypowania i przesiewu pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych genów docelowych i strategii znakowania w obrębie Muszka owocówka modele
- Uzyskanie wiarygodnych wyników jest zależne od specyficzności projektu sgRNA oraz doboru starterów PCR.
