Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Technika ta umożliwia opracowanie ustandaryzowanego systemu, który jest łatwy do skonfigurowania na podstawie ludzkich linii komórkowych lub pierwotnych populacji komórek i zapewnia cechy dobrze zorganizowanej struktury przypominającej szpik kostny. Model ten umożliwia zebranie komórek po utrwaleniu w celu scharakteryzowania lokalizacji komórek in situ w systemie poprzez obrazowanie lub dysocjację struktury 3D w celu zebrania każdego składnika komórkowego do badań molekularnych lub funkcjonalnych. Procedurę zademonstruje Kevin Geistlich, asystent inżyniera z mojego laboratorium.

Zważ od 35 do 40 miligramów kulek BCP w 1,5-mililitrowej tubie na każdą wkładkę. Oznacza to małe cylindryczne plastikowe naczynie z membraną poliwęglanową na dole. Wywierć mały otwór czystą igłą przez górną część 1.5-mililitrowej probówki, aby uniknąć otwarcia pokrywy podczas cyklu autoklawu, i umieść probówki w pozycji pionowej w zamkniętym, sterylnym pudełku.

Umieść sterylne wkładki do hodowli komórek poliwęglanowych w dołkach sześciodołkowej płytki. Wlej sterylne kulki BCP z 1,5-mililitrowej rurki do wkładu. Dokładnie umyj koraliki, wlewając 350 mikrolitrów 1X PBS do wkładu, a następnie dodaj 4,5 mililitra 1X PBS do studzienki.

Wyrzuć PBS za pomocą próżni lub pięciomililitrowej pipety, umieszczając końcówkę w rogu studzienki. Powtórz krok prania dwukrotnie. Następnie użyj 1X PBS uzupełnionego o 10%FBS, aby zablokować system.

Ostrożnie dodaj 350 mikrolitrów roztworu blokującego do wkładki i 4,5 mililitra do studzienki i umieść całą płytkę w inkubatorze na noc. Usuń rozwiązanie blokujące z systemu. Wymieszać 1 razy 10 z 6 komórkami HMEC-1 i 2 razy 10 z 6 komórkami HS27A, reprezentującymi odpowiednio przedziały komórek naczyniowych i mezenchymalnych komórek zrębu, w 15-mililitrowej probówce i wirować przez pięć minut w temperaturze 1,575 G w temperaturze pokojowej.

Odrzuć supernatant i dodaj 175 mikrolitrów pożywki HMEC-1, uzupełnionej 175 mikrolitrami ODM, która będzie promować różnicowanie mezenchymalnych komórek zrębu w osteoblasty. Wlać 350 mikrolitrów zawiesiny komórkowej zawierającej 3 razy 10 do 6 całkowitych komórek wewnątrz każdej wkładki. Następnie wlej 4,5 mililitra połączonej pożywki bez komórek do dołków płytki.

Delikatnie odessać i dozować mieszaninę kilka razy za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby homogenizować komórki i kulki BCP we wkładce. Pozwól, aby cała mieszanka osiadła na dnie wkładu. Po homogenizacji komórek śródbłonka i mezenchymów we wkładce, należy przechowywać sześciodołkową płytkę w inkubatorze przez trzy tygodnie.

Dwa razy w tygodniu zmieniaj pożywkę wewnątrz wkładki w studzience, ostrożnie usuwając pożywkę za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra i umieszczając końcówkę na wewnętrznej ściance wkładki, aby uniknąć naruszenia rogu wkładki. Zawiesić interesujące się komórki hematologiczne w pożywce złożonej HMEC-1 i RPMI i dodać zawiesinę komórek do wkładki. Na tym etapie można dodać inne interesujące typy komórek z dedykowanymi nośnikami.

Jeśli wymagany jest protokół leczenia farmakologicznego, odczekaj 24 godziny po dodaniu komórek będących przedmiotem zainteresowania przed ich leczeniem, dając im czas na przyleganie do struktury przypominającej kość. Dwa razy w tygodniu odświeżaj podłoże za pomocą 50% HMEC-1 complete medium i 50% RPMI complete medium. Po zmianie pożywki hodowlanej dwa razy w tygodniu, należy przechowywać pobrany supernatant z wnętrza wkładki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby ocenić produkcję białka w systemie.

Aby oddzielić komórki od struktury 3D, wymieszaj 4,5 mililitra RPMI z 0,5 mililitra FBS, uzupełnionym 0,4 miligrama na mililitr kolagenazy w 15-mililitrowej probówce. Następnie podgrzej roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Umieść wkładkę do góry nogami na sterylnej, sześciodołkowej pokrywie płytki, aby prawidłowo wyciąć membranę.

Za pomocą sterylnego skalpela przeciąć membranę z boków, uzyskując w ten sposób biały, stały krążek. Umieść krążek w ciepłej 15-mililitrowej probówce zawierającej przygotowaną wcześniej mieszaninę roztworu. Umieść probówkę w aktywnym kole w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 10 minut, aby umożliwić trawienie.

Zastosuj ten sam czas inkubacji dla wszystkich membran, aby uniknąć przekrzywionej analizy. Po inkubacji odwirować 15-mililitrową probówkę przez pięć minut w temperaturze 1,575 G w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach ciepłego 1X PBS.

Zawiesić osad w 300 mikrolitrach ciepłej trypsyny i dobrze wymieszać, pipetując przez 10 sekund, a następnie umieścić go w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza na jedną minutę. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając jeden mililitr ciepłego, czystego FBS. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra mechanicznie odessać i dozować pożywkę, aby całkowicie oddzielić krążek.

Odwirować probówkę przez pięć minut przy 1,575 G i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach 1X PBS uzupełnionego 10% FBS. Pozostaw kulki do osadu na pięć sekund przed zebraniem supernatantu i przefiltrowaniem go przez sitko do komórek o średnicy 35 mikronów umieszczone na probówce zbiorczej. Odwirować uzyskany filtrat przez pięć minut przy sile 1,575 G i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego w celu oceny żywotności.

Zawiesić osady w mieszaninie przeciwciał i inkubować przez 30 do 40 minut na lodzie z dala od światła. Dodaj jeden mililitr PBS uzupełniony 2% FBS, aby umyć komórki i odwirować przez pięć minut w temperaturze 1,575 G.To rozpocząć analizę cytometrii przepływowej, ponownie zawiesić odzyskane osady w 200 mikrolitrach 1X PBS z 10% FBS, uzupełnionymi DAPI w roztworze od 1 do 2000. Przeanalizuj probówki w cytometrze, korzystając z parametrów opisanych w rękopisie tekstowym.

Użyj wykresu wykresu FSC-H w porównaniu z FSC-W, aby przebramować populację singletów. We frakcji singletowej użyj wykresu DAPI-A w porównaniu z FSC-A, aby określić żywotną populację komórek. W przypadku wcześniej bramkowanej populacji DAPI-ujemnej użyj wykresu APCA-A i FSC-A, aby określić populację CD45-dodatnią.

Aby naprawić strukturę podobną do BM, przenieś wkładkę ze starej płytki na nową sześciodołkową płytkę wypełnioną 1X PBS. Następnie delikatnie zastąp medium wewnątrz wkładu 1X PBS. Po umyciu wkładki umieść ją w nowej sześciodołkowej płytce i napełnij zarówno studzienkę, jak i wkładkę świeżo otwartym paraformaldehydem.

Pozwól, aby proces utrwalania postępował przez cztery godziny w temperaturze pokojowej, z dala od światła. Następnie umyj wkład raz za pomocą 1X PBS i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od światła. Wyniki sugerują, że po pożądanej ekspozycji możliwe jest utrzymanie komórek hematologicznych przez co najmniej sześć tygodni w modelu 3D przed pobraniem żywych komórek.

Możliwe było zastąpienie linii komórkowej HS27A pierwotnym prawidłowym MSC szpiku kostnego lub ostrą białaczką szpikową MSC w tym modelu 3D podobnym do BM lub zastąpienie linii komórek krwiotwórczych pierwotnymi HSC. Osadzanie parafiny i immunochemia z powodzeniem umożliwiły analizę zawartości CD45 i CD73 przy użyciu modeli 3D. Ten system 3D wymaga trzech tygodni struktur przypominających szpik kostny i dodatkowego czasu z interesującymi komórkami.

A warunki sterylne muszą być utrzymane, ponieważ czasami możemy zaobserwować zanieczyszczenie pożywki przy zmianach pożywki dwa razy w tygodniu.