Name: Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę krystalizacji białek za pomocą mikrodializy w płytce 96-dołkowej. Technika umożliwia łatwy monitoring wzrostu kryształów dla zastosowań w krystalografii szeregowej i MicroED.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy finansowanie z brytyjskiego Departamentu Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej (BEIS). Dziękujemy Alexowi R. Jonesowi i Mike'owi Shawowi z National Physical Laboratory za ich opinie na temat manuskryptu.

1. Przygotowanie próbki białka
<ol>
	<li>Przygotować (metodami rekombinacyjnymi lub w inny sposób) i oczyścić białko (białka) będące przedmiotem zainteresowania w odpowiednim buforze (tj. takim, który jest podatny na stabilność białka i krystalizację), który został przefiltrowany za pomocą filtra 0,22 μm (patrz tabela materiałów). Oceń jakość białka (pod względem czystości, polidyspersyjności i stabilności) przed krystalizacją31. 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat białek i użytych w niniejszym badaniu.</li>
	<li>Zagęścić próbkę do 10-50 mg.mL-1 lub więcej (w zależności od docelowego białka) przy użyciu odpowiedniego koncentratora MWCO (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Zagęszczoną próbkę można natychmiast wykorzystać do krystalizacji lub przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Jeżeli białko zostało zamrożone, odwirować próbkę przez 10 minut w wirówce stołowej (≥16 000 × g, w temperaturze pokojowej lub 4 °C) w celu osadzenia i usunięcia wszelkich niepożądanych materiałów (np. osadów).</li>
	<li>Porcję białka przelać do czystych probówek PCR o pojemności 200 μl. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, jeśli białko jest niestabilne w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Ustawianie płytki do mikrodializy
UWAGA: Dostępna na rynku płytka do mikrodializy (patrz Tabela materiałów) składa się z dwóch stron ('strona białkowa' i 'strona buforowa') z membraną z regenerowanej celulozy (dostępnej w różnych MWCO), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.
<ol>
	<li>Stroną z białkiem skierowaną do góry oderwij i usuń samoprzylepną taśmę maskującą (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A) z podkładki dystansowej kleju o grubości 200 μm. Zwróć uwagę na położenie studni A1.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 3,2 μl białka (krok 1.4) do każdego dołka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Białko można również załadować za pomocą pipety dozującej wielokrotnie. Użycie pipety jednokanałowej jest możliwe, ale zwiększy to prawdopodobieństwo częściowego odwodnienia kropli występującego z powodu wydłużonego czasu ładowania.</li>
	<li>Umieść folię ochronną UV o grubości 200 μm (patrz Tabela materiałów) na płytce 96-dołkowej i sprawdź jej integralność (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Upewnij się, że folia ochronna jest skierowana do góry.</li>
	<li>Użyj łopatki uszczelniającej (patrz Tabela materiałów), dociśnij folię ochronną UV, aby aktywować i uszczelnić klej dociskowy.</li>
	<li>Odwróć tabliczkę i zwróć uwagę na położenie studzienki A1. Upewnij się, że płytka jest zorientowana buforem do góry i że pozycje studzienek są lustrzane (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 350 μl roztworu dializacyjnego do każdej ze studzienek (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 2D). 
	UWAGA: Na tym etapie można użyć dostępnych na rynku ekranów krystalizacji (rzadkie ekrany matrycowe) lub laboratoryjnie dostosowanych do potrzeb ekranów (sita siatkowe) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ostrożnie uszczelnij studnie za pomocą 'folii pokrywy zbiornika' (patrz Tabela Materiałów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Umieścić płytkę (buforem skierowanym do góry) w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu uzyskania wzrostu kryształów. 
	UWAGA: W przypadku białek wybranych do niniejszego badania, kryształy zaczęły pojawiać się między 1 a 8 godzinami w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy pod mikroskopem nie ma kryształów, odwróć płytkę, aby podnieść stronę z białkiem do góry i usuń folię ochronną z folii ochronnej UV 200 μm (krok 2.3), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2F,G.</li>
</ol>
3. Krystalizacja na dużą skalę przy użyciu sond dializatora
UWAGA: Po zbadaniu warunków krystalizacji za pomocą płytki do mikrodializy, krystalizacja białka na dużą skalę (do krystalografii seryjnej lub innych celów) może być przeprowadzona za pomocą rurki dializatora, jak pokazano na Rysunek 3. Podobnie jak płytki do mikrodializy, urządzenia te są dostępne z membranami dializacyjnymi MWCO o mocy 3, 5, 10 i 30 kDa.
<ol>
	<li>Przygotuj zoptymalizowane warunki krystalizacji do wzrostu mikrokryształów w dużych pojemnikach (przyjmując warunki zoptymalizowane przy użyciu płytki do mikrodializy). Upewnij się, że bufor został wcześniej przefiltrowany za pomocą filtra 0,2 μm.</li>
	<li>Odpipetuj białko do rurki dializatora (maksymalna objętość 0,5 ml) i uszczelnij koniec za pomocą dołączonej czerwonej plastikowej nakrętki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Umieść rurkę dializatora o pojemności 500 μl w pojemniku o odpowiedniej wielkości (w zależności od całkowitej objętości roztworu do dializy) zawierającym pływający stojak (patrz tabela materiałów), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3B. 
	UWAGA: Pływający stojak dostarczony z zestawem dializatora mieści jednocześnie do 18 rurek dializatora.</li>
	<li>Umieścić pojemnik nieruchomo w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu wzrostu kryształów.</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy nie ma kryształów, odpipetować 1-2 μl roztworu na szkiełko podstawowe. Przykryj drugą szklaną pokrywą, szkiełkiem podstawowym na górze (aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu) i view pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Kryształy mogą ulec uszkodzeniu, jeśli zostaną umieszczone między dwoma szkiełkami pokrywy podczas inspekcji. Kryształy można również oglądać bezpośrednio, umieszczając rurkę dializatora pod stereoskopowym mikroskopem o dużym powiększeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nobel+science%3A+One+hundred+years+of+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Science+Reviews%22%5BJournal%5D)">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li>
<li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li>
<li>Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallography+in+the+era+of+modern+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology.</a> Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).</li>
<li>Birch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+art+of+integral+membrane+protein+crystallisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The fine art of integral membrane protein crystallisation.</a> Methods. 147, 150-162 (2018).</li>
<li>Gorrec, F., Löwe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protocols+for+macromolecular+crystallization+at+the+MRC+laboratory+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology.</a> Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).</li>
<li>Govada, L., Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+method+of+crystallization+to+obtain+optimal+results%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">Choosing the method of crystallization to obtain optimal results.</a> Crystals. 9 (2), 106(2019).</li>
<li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+protein+crystallisation+from+an+art+into+science%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Turning protein crystallisation from an art into science.</a> Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).</li>
<li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li>
<li>Gulbis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallography%3A+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Crystallography+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein crystallography: methods and protocols.</a> Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).</li>
<li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section%3AF+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned.</a> Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).</li>
<li>Shaw Stewart,, D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+microseeding%3A+a+theoretical+and+practical+exploration+of+seed+stability+and+seeding+techniques+for+successful+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization.</a> Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li>
<li>Junius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+both+on-chip+dialysis+protein+crystallization+and+in+situ+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).</li>
<li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).</li>
<li>Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).</li>
<li>Jaho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+proteins+on+chip+by+microdialysis+for+in+situ+X-ray+diffraction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallisation%3A+Current+trends+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+922%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).</li>
<li>Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing+salts+and+polyethylene+glycol+into+protein+solutions%3A+The+effects+of+diffusion+across+semi-permeable+membranes+and+of+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection.</a> Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).</li>
<li>Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+at+the+SACLA%3A+breakthrough+to+dynamic+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XFEL+structures+of+the+human+MT2+melatonin+receptor+reveal+the+basis+of+subtype+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity.</a> Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).</li>
<li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+fixed-target+serial+synchrotron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).</li>
<li>Weinert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+millisecond+crystallography+for+routine+room-temperature+structure+determination+at+synchrotrons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons.</a> Nature communications. 8 (1), 542(2017).</li>
<li>Axford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+states+of+a+light-sensitive+membrane+protein+captured+at+room+temperature+using+thin-film+sample+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).</li>
<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-EM+method+microcrystal+electron+diffraction+%28MicroED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).</li>
<li>Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+protein+structure+determination+with+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond protein structure determination with MicroED.</a> Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).</li>
<li>Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+microcrystal+electron+diffraction+%28MicroED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).</li>
<li>Kwan, T. O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+biophysical+methods+for+characterisation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).</li>
<li>Pos, K. M., Purification Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+AcrB%2C+an+inner-membrane+multi-drug+efflux+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).</li>
<li>Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+wild-type+lactose+permease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural determination of wild-type lactose permease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).</li>
<li>Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+polypeptide+samples+by+dynamic+light+scattering%3A+membrane+proteins%2C+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study.</a> Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Wickstrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+visualizing+protein+motions+in+time-resolved+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).</li>
<li>Orville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+results+in+time+resolved+serial+femtosecond+crystallography+at+XFELs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs.</a> Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).</li>
<li>Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+time-resolved+serial+synchrotron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).</li>
<li>Neutze, R., Brändén, G., Schertler, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+using+X-ray+free+eletron+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers.</a> Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).</li>
<li>Wierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
</ol>

Współautorzy, Pascelle Draper i Paul Reardon, są zatrudnieni przez SWISSCI.

Obecnie krystalizacja przez dializę jest najbardziej niewykorzystaną metodą krystalizacji, a mianowicie ze względu na niską przepustowość i żmudny charakter istniejących metod, takich jak mikrodializa za pomocą guzików. W tym przypadku prosty, ale solidny protokół podąża za przepływem pracy HTP do wzrostu kryształów białka poprzez dializę za pomocą dostępnej na rynku płytki do mikrodializy i rurki dializatora. W zależności od białka docelowego, płytka do mikrodializy i rurka dializatora używane w procedurze są dostarczane z wyborem membrany dializacyjnej o MWCO 3, 5, 10 lub 30 kDa. Protokół można łatwo skonfigurować w dowolnym standardowym zakładzie krystalizacji i ma tę wielką zaletę, że można go stosować zarówno do białek rozpuszczalnych, jak i błonowych. Jednak kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy nie były testowane podczas tego protokołu.
Podobnie jak w przypadku każdej metody krystalizacji za pomocą dializy, stosunek objętości między próbką białka a roztworem do dializy ma kluczowe znaczenie. W tym protokole zalecany jest stosunek 1:100 między próbką a roztworem do dializy, ale ponieważ płytka do mikrodializy pozwala na maksymalną pojemność 350 μl roztworu do dializy, proporcje te można zbadać w celu uzyskania trafień kryształów. W prezentowanym protokole wykorzystuje się objętość 1-2 μL białka przy ustawianiu płytek krystalizacyjnych. Ma to na celu zapewnienie dokładnego ustawiania kropli za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej. Dzięki zastosowaniu pipet elektronicznych (pipet wielokanałowych lub wielokrotnych dozowników) lub robotów dozujących ciecze HTP, można dokładnie uzyskać krople o mniejszych objętościach, zmniejszając w ten sposób ilość wymaganego białka. Ponadto, ze względu na stosunkowo niewielkie objętości buforu dializacyjnego wymaganego przez płytkę do mikrodializy (w przeciwieństwie do innych konwencjonalnych metod dializy), możliwe jest (bez nadmiernego wykorzystania zasobów) badanie dużych przestrzeni chemicznych, nie tylko przy użyciu dostępnych na rynku ekranów krystalizacji, ale także ekranów optymalizacyjnych (zaprojektowanych wokół początkowego warunku osiągnięcia krystalizacji).
Krytycznym krokiem w przedstawionej procedurze HTP jest terminowe podanie małych objętości białka (0,50-3,2 μl na warunek) na płytkę dializacyjną w celu ograniczenia odwodnienia i utraty próbki. Można to łatwo złagodzić, stosując pipetę wielokanałową, pipetę do wielokrotnego dozowania lub zrobotyzowany system krystalizacji. Długi czas inkubacji, wynoszący ponad 2 tygodnie, płytek w temperaturze 20 °C może prowadzić do odwodnienia kropelek białka lub uszkodzenia niedawno utworzonych kryształów. Przechowywanie płytek dializacyjnych w komorze nawilżania lub zamykanej torbie może złagodzić ten efekt. Ponadto zaleca się stosowanie sterylnych materiałów i technik, aby uniknąć rozwoju bakterii.
Jak wspomniano we wprowadzeniu, ostatnio, wraz ze zwiększoną potrzebą zrozumienia dynamiki strukturalnej białek dla mechanizmów chorobowych, interakcji wiązania białko-ligand i interakcji białko-białko, dziedzina krystalografii rentgenowskiej białek została zrewolucjonizowana poprzez rozwój nowych i istniejących technik krystalizacji, nowoczesnych podejść do dostarczania próbek kryształów, nowych generacji źródeł promieniowania rentgenowskiego oraz nowych wyrafinowanych metod pozyskiwania i przetwarzania danych36,37,38. W związku z tym pojawienie się seryjnej mikrokrystalografii w temperaturze pokojowej, wykonywanej przy użyciu XFEL lub synchrotronowych źródeł światła, stało się niezwykłym narzędziem w biologii strukturalnej, szczególnie w dziedzinie białek błonowych39. Jednak do wygenerowania wystarczającej ilości danych dla solidnego rozwiązania strukturalnego potrzebne są tysiące mikrokryształów, co nie jest łatwym zadaniem (przynajmniej przy użyciu konwencjonalnych metod krystalizacji). Opisana tutaj metoda krystalizacji dializ umożliwia wytworzenie dużej liczby mikrokryształów. Po określeniu warunków krystalizacji do produkcji mikrokryształów (1-10 μm) za pomocą płytki do mikrodializy, za pomocą dializatora o pojemności 0,5 ml można wytworzyć duże ilości mikrokryształów o dużej gęstości (rysunek 5). Kryształy te idealnie nadają się do zbierania danych za pomocą stałych celów lub systemów dostarczania próbek strumieniem cieczy27, Lokal mieszkalny 40. Kryształy uzyskane tą metodą mogą być również odpowiednie do zastosowań MicroED. Jednak mogą one wymagać zmielenia do odpowiedniego rozmiaru i grubości dla tego konkretnego zastosowania, ponieważ elektrony oddziałują z kryształami znacznie silniej niż fotony promieniowania rentgenowskiego41.
Podsumowując, opisane tutaj podejście do krystalizacji przez dializę uzupełnia rozwijające się strategie krystalizacji białek w celu określenia struktury i rozszerza zakres wysiłków, które można zastosować do określenia nowych celów białkowych, które wcześniej nie były skuteczne przy użyciu innych konwencjonalnych metod.

W ciągu ostatniego stulecia krystalografia rentgenowska odgrywała kluczową rolę w wyjaśnianiu i rozumieniu paradygmatu struktura-funkcja makromolekuł biologicznych. Do dziś pozostaje jedną z najskuteczniejszych metod określania struktur o rozdzielczości atomowej wielu unikalnych białek, które są niezbędne dla fundamentalnego zrozumienia biochemii komórki, medycyny oraz wczesnego etapu projektowania leków1,2. Jednakże krystalizacja białek wciąż stanowi wąskie gardło w badaniu wielu celów białkowych, szczególnie białek błonowych i dużych kompleksów białkowych3. W konsekwencji krystalizacja białek jest niemal zawsze uważana za sztukę ze względu na stosowane, pracochłonne podejścia oparte na metodzie prób i błędów4,5,6.
Do roztworu białka w wysokim stężeniu zazwyczaj dodaje się czynnik wytrącający, aby utworzyć uporządkowaną, regularną i powtarzalną strukturę sieciową cząsteczek białka, zwaną kryształami. W sprzyjających warunkach, takich jak temperatura, pH, stężenie i rodzaj czynnika wytrącającego, ostatecznie tworzy się roztwór nasycony, po czym następuje nukleacja i wzrost kryształów7,8. Mimo wielu postępów w konfiguracjach prób krystalizacji, wynikających głównie z rozwoju robotycznych systemów wysokoprzepustowych oraz dostępności gotowych ekranów typu „sparse matrix”, ogólne podejścia do krystalizacji białek pozostały przez lata w dużej mierze niezmienione. Do powszechnych eksperymentalnych technik krystalizacji białek należą dyfuzja par (kropla wisząca i kropla siedząca)9, mikrobatch (pod warstwą oleju)10,11, dyfuzja swobodnego interfejsu (urządzenia mikroprzepływowe)12 oraz dializa (z wykorzystaniem guzików i innych technik)13,14,15. Istnieją jednak również inne, bardziej wyspecjalizowane układy, takie jak podejścia mezofazowe do krystalizacji białek błonowych16,17. Choć większość struktur białkowych uzyskanych metodą rentgenograficzną i zdeponowanych w Protein Data Bank została rozwiązana poprzez krystalizację metodami dyfuzji par6,18, inne podejścia, takie jak krystalizacja poprzez dializę, wydają się być niewystarczająco wykorzystywane, prawdopodobnie ze względu na praktyczne aspekty związane z ich konfiguracją eksperymentalną.
Krystalizacja poprzez dializę opiera się na powolnej dyfuzji substancji rozpuszczonych (precypitantów, jonów, dodatków i buforów) przez membranę półprzepuszczalną, która jednocześnie zapobiega przenikaniu cząsteczek białka. W ten sposób roztwór białka powoli osiąga stan równowagi, a precypitant uzyskuje stężenie niezbędne do krystalizacji. Kinetyka układu zależy od temperatury, stężenia precipitanta oraz progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) membrany celulozowej19. Do tej pory najpopularniejszym układem do krystalizacji metodą dializy było wykorzystanie guzików do mikrodializy wykonanych z przezroczystych arkuszy akrylowych. Są one zazwyczaj zanurzane w rezerwuarach (najczęściej z wykorzystaniem płytek do metody kropli wiszącej z dyfuzją par) zawierających roztwory precipitanta krystalizacyjnego. Jednak ta metoda o niskiej przepustowości wymaga również specyficznego montażu w celu uszczelnienia roztworu białka wewnątrz membrany dializacyjnej umieszczonej nad komorą guzika, jak pokazano na Rysunku 1. Ponadto częstym problemem utrudniającym wzrost kryształów są pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a roztworem białka. Kolejnym ograniczeniem tej metody są wymagania dotyczące próbek, gdyż w porównaniu z metodami dyfuzji par konieczne są znacznie wyższe stężenia i objętości, aby wypełnić guziki do dializy. W związku z tym krystalizacja z użyciem guzików do mikrodializy była postrzegana jako metoda nieatrakcyjna, zwłaszcza w przypadku trudnych obiektów, takich jak białka błonowe, których wydajność oczyszczania jest frustrująco niska. Niedawno opracowano urządzenia mikroprzepływowe ułatwiające krystalizację białek poprzez dializę15. Układy te zostały zaprojektowane tak, aby charakteryzowały się wysoką przejrzystością dla promieni rentgenowskich i niskim tłem, co pozwala na ich wykorzystanie do zbierania danych in situ w temperaturze pokojowej, eliminując tym samym niedogodności związane z wyławianiem i kriochłodzeniem kryształów. Pomimo tych postępów, podejście to wciąż charakteryzuje się bardzo niską przepustowością i jest kosztowne.
<img alt="Krystalizacja białek metodą mikrodializy; schemat, proces: roztwór białka, membrana dializacyjna, kryształy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Schematyczne przedstawienie krystalizacji metodą dializy z użyciem przycisków dializacyjnych. (A) Schematyczny rysunek przycisku do dializy krystalizacyjnej. (BRoztwór białka dodaje się do komory przycisku mikrodializy.CMembrana dializacyjna jest przymocowana do przycisku mikrodializacyjnego za pomocą zastosowanego pierścienia gumowego (o-ringu) poprzez aplikator. (DPrzycisk do dializy jest gotowy do zanurzenia w zbiorniku zawierającym roztwór krystalizacyjny (roztwór do dializy), jak pokazano na (EFiolka zawierająca zanurzony przycisk dializacyjny musi zostać szczelnie zamknięta, aby zapobiec parowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W niniejszym materiale przedstawiono prosty protokół przesiewania warunków krystalizacji białek oraz wzrostu kryształów z wykorzystaniem 96-dołkowej wysokoprzepustowej płytki do dializy. Jednorazowe płytki te są zaprojektowane do użytkowania w sposób zbliżony do płytek do krystalizacji metodą dyfuzji pary (pipetowanie, a następnie uszczelnienie), co pokazano na Rysunku 2. Płytki mogą pomieścić do 3,2 µL białka i 350 µL roztworu do dializy. Każdy dołek posiada osobną membranę z celulozy regenerowanej, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między dołkami. Przygotowanie układu zajmuje około 10 min i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza tym, który znajduje się w każdym standardowym laboratorium krystalograficznym. Do zademonstrowania i walidacji tego podejścia jako skutecznej metody wysokoprzepustowej (HTP) krystalografii białek wykorzystano cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe.
<img alt="Układ mikrodializy z krystalizacją przedstawiony na schemacie oraz obrazy mikroskopowe do badania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procesu krystalizacji z wykorzystaniem płytki do mikrodializy. (A) Usunięcie czerwonej adhezyjnej „folii ochronnej”. (B) Nanoszenie kropel białka do poszczególnych dołków na krople. (C) Dołki zostają przykryte UV „folią ochronną”. (D) Płytka zostaje odwrócona w celu dodania roztworów dializy (lub ekranu krystalizacji). (E) Płytka zostaje uszczelniona i poddana inkubacji. (F,G) Inspekcja mikroskopowa kropel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Zastosowanie protokołu krystalizacji poprzez dializę zademonstrowano przy użyciu rurki dializacyjnej o pojemności 0,5 mL (Rysunek 3) w celu wielkoskalowej (od setek do tysięcy) produkcji mikrokryształów, odpowiednich dla najnowocześniejszych metod zbierania danych, takich jak krystalografia seryjna zarówno w ośrodkach XFEL20,21,22,23,24, jak i w synchrotronach25,26,27, a także dla metod MicroED28,29,30.
<img alt="Schemat przygotowania do krystalizacji białek; dializa, krystalizacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wielkoskalowa krystalizacja mikrodializacyjna z użyciem rurki dializatora. (A) Schematyczne przedstawienie rurki dializatora o pojemności 0,5 mL. (B) Widok z boku zlewki zawierającej roztwór krystalizacyjny i pływającego statywu na rurki, w którym znajduje się rurka dializatora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówki 0,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0620</td><td>Do porcjowania roztworów białkowych.</td></tr><tr><td>0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>17823----------K</td><td>Filtry z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych. Do filtrowania roztworów dializacyjnych.</td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtry membranowe</td><td>Millipore</td><td>GSTF04700</td><td>Filtry membranowe do filtrowania dużych ilości</td></tr><tr><td>12-kanałowy, zmienny 0,5 &ndash; 10 &micro; L Research plus pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td>Do dozowania kropli białkowych na Diaplate.</td></tr><tr><td>12-kanałowy, zmienny 30 &ndash; 300 &micro; L Pipeta Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td>Do dozowania roztworów dializacyjnych do zbiorników Diaplate.</td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>15889152</td><td>Do stosowania z filtrami strzykawkowymi.</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki głębinowe 2,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0788</td><td>Polipropylenowe płytki do przechowywania głębokich; do przygotowania sit przy użyciu Hamilton Microlab STARlet.</td></tr><tr><td>Wirówka 5425</td><td>Eppendorf</td><td>5405000565</td><td>Z wirnikiem FA-24x2 o maksymalnej sile g 21 300 x g.</td></tr><tr><td>Diakon</td><td>dializator SWISSCI</td><td>W72010</td><td>Rurki dializatora z membraną z regenerowanej celulozy o granicy masy cząsteczkowej 10 kDa. Idealny do roztworów białkowych o pojemności do 0,5 ml.</td></tr><tr><td>Diaplate 96-dołkowa płytka</td><td>SWISSCI</td><td>W82010</td><td>Płytka do mikrodializy. Diaplate składa się z dwóch stron, pomiędzy którymi znajduje się membrana z regenerowanej celulozy o wartości granicznej masy cząsteczkowej 10 kDa.</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa Falcon 50 mL High Clarity PP</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Do przechowywania roztworów dializacyjnych.</td></tr><tr><td>Stojak pływający</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>Wchodzi w skład zestawu Diacon</td></tr><tr><td>Inkubator stojący bez wibracji</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD5-01</td><td>Inkubator o pojemności 400 l z kontrolowaną temperaturą ustawioną na 20 stopni C.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica M205 C</td> Obiektyw <td>Leica</td><td></td><td>Planapo 1,0x, zakres zoomu 7,8x i ndash; 160x z kamerą DMC 4500</td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62971</td><td>Liofilizowane białko</td></tr><tr><td>Memgold2</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD1-64</td><td>Ekran z rzadką matrycą</td></tr><tr><td>Microlab STARlet</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>System obsługi cieczy.</td></tr><tr><td>Folia pokrywy zbiornika</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>Zawarta w zestawie Diaplate</td></tr><tr><td>Filtr butelkowy wielokrotnego użytku</td><td>Thermo Scientific</td><td>DS0320-5045</td><td>Do montażu dużych ilości, do stosowania z 0,22 i mikro; m Filtry membranowe</td></tr><tr><td>Łopatka uszczelniająca</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>Zawarte w zestawie Diaplate</td></tr><tr><td>Thaumatin od Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Liofilizowana</td></tr><tr><td>folia osłonowa UV</td> białkowa <td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>Zawarta w zestawie Diaplate</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Zrozumienie relacji struktura-funkcja makromolekuł, takich jak białka, na poziomie molekularnym jest kluczowe dla biomedycyny i odkrywania nowoczesnych leków. Do tej pory krystalografia rentgenowska pozostaje najskuteczniejszą metodą rozwiązywania trójwymiarowych struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Dzięki niedawnym postępom w krystalografii szeregowej, zarówno przy użyciu rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL), jak i synchrotronowych źródeł światła, krystalografia białek osiągnęła kolejną granicę, gdzie możliwość pozyskiwania danych rozdzielczych w czasie zapewnia ważne mechanistyczne wglądy w zachowanie cząsteczek biologicznych w temperaturze pokojowej. Protokół ten opisuje prosty przepływ pracy o wysokiej przepustowości (HTP) do badań przesiewowych warunków krystalizacji przy użyciu 96-dołkowej płytki dializowej. Płytki te są zgodne ze standardem Towarzystwa Badań Biomolekularnych (SBS) i można je łatwo skonfigurować za pomocą dowolnego standardowego laboratorium krystalizacji. Po określeniu optymalnych warunków za pomocą dializatora można wytworzyć duże ilości kryształów (setki mikrokryształów). Aby potwierdzić solidność i wszechstronność tego podejścia, skrystalizowano cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe.

Krystalizacji czterech białek, w tym dwóch białek błonowych, dokonano przy użyciu płytki do mikrodializy (z membranami o MWCO 10 kDa). Lizozym z białka jaja kurzego z proszku liofilizowanego (patrz Tabela materiałów) przygotowano w stężeniu 50 mg.mL-1 w 20 mM NaOAc (pH 4,5), a liofilizowaną taumatynę (patrz Tabela materiałów) rozpuszczono w wodzie do końcowego stężenia 25 mg.mL-1. Dwiema białkami błonowymi wykorzystanymi w niniejszym badaniu były pompa efleksu leków wielolekowych AcrB z E. coli oraz transporter laktozy LacY z E. coli. Białko AcrB wyekspresowano przy użyciu komórek C43 (DE3) i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA oraz chromatografii żelowej w 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozydzie (DDM) i 5% (v/v) glicerolu32. Następnie białko skoncentrowano przy użyciu wirówkowego koncentratora o MWCO 100 kDa do końcowego stężenia 6 mg.mL-1. Białko LacY również wyekspresowano w komórkach C43 (DE3), oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-sepharose, a następnie chromatografii żelowej w 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM i skoncentrowano za pomocą koncentratora o MWCO 100 kDa do stężenia 10 mg.mL-1 4,33.
W przypadku białek lizozymu i taumatyny 96-dołkowa płytka do mikrodializy została wypełniona przygotowanym w laboratorium ekranem krystalizacji w układzie siatki (grid screen) jako roztworem do dializy, natomiast dla białka błonowego AcrB przygotowano w laboratorium ekran w układzie siatki na podstawie wcześniej opublikowanego warunku krystalizacji34. W przypadku LacY wstępne warunki prowadzące do sukcesu (hit conditions) znaleziono za pomocą komercyjnego ekranu (patrz Tabela materiałów), a następnie zoptymalizowano je za pomocą ekranu w układzie siatki przygotowanego w laboratorium. Stosunek objętości kropli krystalizacyjnych dla lizozymu, taumatyny i AcrB wynosił 1:100, przy zastosowaniu 2 µL białka i 200 µL precypitantu (roztworu do dializy). Krople krystalizacyjne LacY również przygotowano w stosunku 1:100, z zastosowaniem 1 µL białka i 100 µL roztworu do dializy, ze względu na mniejszą ilość dostępnego białka.
Kryształy wszystkich czterech białek, w tym białek błonowych, zaczęły pojawiać się w czasie od 1 do 8 h w temperaturze 20 °C po przygotowaniu płytki do mikrodializy. W tym przypadku nie było konieczności uzupełniania roztworu dializacyjnego o detergent w celu krystalizacji białek błonowych, co jest zazwyczaj praktykowane podczas standardowego procesu dializy w celu zapobiegania agregacji białek błonowych, ponieważ przewidywano, że micele detergentu będą większe niż MWCO membran dializacyjnych35.
Po pomyślnej krystalizacji białek na płytce do mikrodializy (Rysunek 4), odnotowano warunki krystalizacji i przeprowadzono krystalizację na większą skalę metodą dializy, wykorzystując tubę dializacyjną z tymi samymi membranami dializacyjnymi o MWCO 10 kDa. Wewnątrz dializatora urosły tysiące mikrokryształów dla każdego z poszczególnych białek, co przedstawiono na Rysunku 5. W przypadku krystalizacji taumatyny do dializatora wprowadzono 250 µL białka i przeprowadzono dializę przeciwko 50 mL roztworu (stosunek 1:200). Dla AcrB 250 µL białka poddano dializie przeciwko 25 mL roztworu dializacyjnego (1:100). Krystalizację LacY przygotowano również w tym samym stosunku, stosując 100 µL białka na 10 mL roztworu dializacyjnego.
<img alt="Obrazy z mikroskopii krystalizacji białek przedstawiające wzrost kryształów w różnych warunkach, skala wskazana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kryształy są hodowane metodą dializy z wykorzystaniem płytki do mikrodializy. Protokół wykazuje przydatność układu dla białek rozpuszczalnych: (A) Lizozym był dializowany przeciwko 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl i 25% (v/v) glicerolu. (B) Taumatyna była dializowana przeciwko 0,1 M Bis-tris propaniu (pH 6,6), 1 M tatranowi K/Na i 18% (v/v) glikolu etylowego. Kryształy uzyskano również dla białek błonowych: (C) AcrB był dializowany przeciwko 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY był dializowany przeciwko 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obrazy zarejestrowano za pomocą stereomikroskopu o dużym powiększeniu z polaryzatorem krzyżowym. Paski skali: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces równowagi statycznej z układem spektroskopowym; obrazy mikroskopowe przedstawiające formacje kryształów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy kryształów białek błonowych otrzymanych metodą dializy z wykorzystaniem rurki dializacyjnej. (A) Obraz przedstawiający rurkę wypełnioną mikrokryształami (wskazane czarną strzałką). (B) Obraz mikroskopowy 2 µL zawiesiny kryształów taumatyny otrzymanych przez dializę przy użyciu rurki dializacyjnej 0,5 mL, dializowanej przeciwko 0,1 M Bis-Tris propane (pH 6,6), 1,4 M tartranu K/Na i 18% (v/v) glikolu etylenowego. (C) Obrazy w ciemnym polu (lewo) i jasnym polu (prawo) mikrokryształów AcrB otrzymanych przez dializę przeciwko 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) Obrazy w ciemnym polu (lewo) i jasnym polu (prawo) mikrokryształów LacY otrzymanych przez dializę przeciwko 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obserwuje się niektóre osady. Paski skali: (B,D) = 200 µm; (C) = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Krystalizacja za pomocą dializy jest metodą niedostatecznie wykorzystywaną. Protokół ten przedstawia podejście Novo do tego zagadnienia, które zwiększy zakres strategii krystalizacji dostępnych obecnie do ustrukturyzowanego oznaczania. Głównymi zaletami tej techniki jest wysoka przepustowość, prosta konfiguracja bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu oraz możliwość łatwego monitorowania wzrostu kryształów.Osoba wykonująca tę technikę musi czuć się komfortowo z pipetowaniem małych objętości i pipetami wielokanałowymi. Krople muszą być pipetowane w jak największym stopniu, aby zapobiec częściowemu odwodnieniu. Aby przygotować się do eksperymentu mikrodializy, umieść dostępną w handlu 96-dołkową płytkę do mikrodializy w orientacji białkowej do góry i usuń samoprzylepną taśmę zakrywającą, odklejając 200-mikronową przekładkę kleju ciśnieniowego.Po odklejeniu samoprzylepnej taśmy zakrywającej zwróć uwagę na położenie studzienki A1. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, załaduj maksymalnie 3,2 mikrolitra odpowiednio przygotowanej próbki białka do każdej studzienki. Prawidłowo umieść folię ochronną UV o grubości 200 mikronów na płytce 96-dołkowej, folią skierowaną do góry. Następnie, aby aktywować i uszczelnić klej ciśnieniowy, dociśnij folię ochronną UV za pomocą łopatki uszczelniającej i sprawdź jej integralność.Teraz odwróć płytkę, aby ustawić ją w orientacji buforowej do góry i zwróć uwagę na lustrzane położenie zaznaczonej studni A1. Za pomocą pipety wielokanałowej załadować maksymalnie 350 mikrolitrów roztworu dializacyjnego do każdej studzienki płytki i ostrożnie uszczelnić studzienki folią przykrywającą zbiornik. Następnie umieść płytkę w pozycji buforowej do góry w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić wzrost kryształów. Aby zbadać tworzenie się kryształów pod mikroskopem, usuń ochronną folię ochronną z folii ochronnej UV o grubości 200 mikronów i umieść płytkę pod okularem stroną z białkiem skierowaną do góry.Aby przeprowadzić eksperyment krystalizacji na dużą skalę, przyjmij warunki, w których zachodził wzrost mikrokryształów na płytce do mikrodializy i odtwórz te same warunki w dużych pojemnikach. Wybrać rozmiar pojemnika w zależności od objętości roztworu dializacyjnego. Odpipetować maksymalną objętość 500 mikrolitrów próbki białka do rurki dializatora przed zamknięciem probówki za pomocą czerwonej plastikowej nakrętki.Umieść szczelnie zamkniętą rurkę dializatora o pojemności 500 mikrolitrów w pływającym stojaku wewnątrz pojemnika wypełnionego roztworem do dializy. Następnie umieść pojemnik w spokoju w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby uzyskać wzrost kryształów. Aby sprawdzić, czy tworzą się kryształy, należy odpipetować od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu z dializatora na szkiełko podstawowe.Przykryj roztwór na szkiełku innym szkiełkiem podstawowym i obejrzyj go pod mikroskopem. Obrazy wykonane za pomocą stereoskopowego mikroskopu o dużym powiększeniu wykazały pomyślne tworzenie mikrokryształów czterech białek przy użyciu płytek do mikrodializy z membranami odciętymi o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Stwierdzono, że lizozym tworzy kryształy podczas dializy z 0,1-molowym octanem sodu o pH 4 zawierającym odpowiednie dodatki.Domatyna tworzyła kryształy podczas dializy z 0,1 molowym bis-trisem propanem o pH 6,6 zawierającym odpowiednie dodatki. Zoptymalizowane warunki dializy doprowadziły do tworzenia mikrokryształów przez białka błonowe, a mianowicie białko wielolekowej pompy wypływowej E.coli AcrB i transporter laktozy LacY. Krystalizacja na dużą skalę w probówkach dializatorów z wykorzystaniem zoptymalizowanych warunków dializy uzyskanych z eksperymentów mikrodializy doprowadziła do powstania tysięcy mikrokryształów dla każdego z białek.W celu krystalizacji fomityny 250 mikrolitrów białka dializowano z 50 mililitrami roztworu dializacyjnego. W przypadku AcrB 250 mikrolitrów białka dializowano z 25 mikrolitrami roztworu do dializy. Krystalizacja LacY została również ustalona w tym samym stosunku, ze 100 mikrolitrami białka na 10 mililitrów roztworu dializacyjnego.Podczas odwracania płytki do strony buforowej do góry ważne jest, aby zwrócić uwagę na położenie A1, aby można było odpowiednio dozować roztwory z sita krystalizacyjnego. Kryształy otrzymane tą metodą mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak krystalografia szeregowa i mikrozaburzenia erekcji.

high-throughput-protein-crystallization-via-microdialysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Tutaj prezentujemy protokół kontrolowanej produkcji mikrokryształów białka. W procesie wykorzystuje się zautomatyzowane urządzenie pozwalające na kontrolowaną manipulację kilkoma parametrami krystalizacji. Krystalizacja białka odbywa się poprzez kontrolowane i zautomatyzowane dodawanie roztworów krystalizacyjnych przy jednoczesnym monitorowaniu i badaniu rozkładu promienia cząstek w kropli krystalizacji.

Hodowla kryształów białkowych o różnych wymiarach przy użyciu automatycznej krystalizacji połączonej z dynamicznym rozpraszaniem światła in situ

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Poznaj wysokoprzepustową metodę krystalizacji białek za pomocą mikrodializy w płytce 96-dołkowej. Technika umożliwia łatwy monitoring wzrostu kryształów dla zastosowań w krystalografii szeregowej i MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Przeglądaj więcej filmów