Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy
3 marca 2023
Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.
Krystalizacja za pomocą dializy jest metodą niedostatecznie wykorzystywaną. Protokół ten przedstawia podejście Novo do tego zagadnienia, które zwiększy zakres strategii krystalizacji dostępnych obecnie do ustrukturyzowanego oznaczania. Głównymi zaletami tej techniki jest wysoka przepustowość, prosta konfiguracja bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu oraz możliwość łatwego monitorowania wzrostu kryształów.
Osoba wykonująca tę technikę musi czuć się komfortowo z pipetowaniem małych objętości i pipetami wielokanałowymi. Krople muszą być pipetowane w jak największym stopniu, aby zapobiec częściowemu odwodnieniu. Aby przygotować się do eksperymentu mikrodializy, umieść dostępną w handlu 96-dołkową płytkę do mikrodializy w orientacji białkowej do góry i usuń samoprzylepną taśmę zakrywającą, odklejając 200-mikronową przekładkę kleju ciśnieniowego.
Po odklejeniu samoprzylepnej taśmy zakrywającej zwróć uwagę na położenie studzienki A1. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, załaduj maksymalnie 3,2 mikrolitra odpowiednio przygotowanej próbki białka do każdej studzienki. Prawidłowo umieść folię ochronną UV o grubości 200 mikronów na płytce 96-dołkowej, folią skierowaną do góry. Następnie, aby aktywować i uszczelnić klej ciśnieniowy, dociśnij folię ochronną UV za pomocą łopatki uszczelniającej i sprawdź jej integralność.
Teraz odwróć płytkę, aby ustawić ją w orientacji buforowej do góry i zwróć uwagę na lustrzane położenie zaznaczonej studni A1. Za pomocą pipety wielokanałowej załadować maksymalnie 350 mikrolitrów roztworu dializacyjnego do każdej studzienki płytki i ostrożnie uszczelnić studzienki folią przykrywającą zbiornik. Następnie umieść płytkę w pozycji buforowej do góry w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić wzrost kryształów. Aby zbadać tworzenie się kryształów pod mikroskopem, usuń ochronną folię ochronną z folii ochronnej UV o grubości 200 mikronów i umieść płytkę pod okularem stroną z białkiem skierowaną do góry.
Aby przeprowadzić eksperyment krystalizacji na dużą skalę, przyjmij warunki, w których zachodził wzrost mikrokryształów na płytce do mikrodializy i odtwórz te same warunki w dużych pojemnikach. Wybrać rozmiar pojemnika w zależności od objętości roztworu dializacyjnego. Odpipetować maksymalną objętość 500 mikrolitrów próbki białka do rurki dializatora przed zamknięciem probówki za pomocą czerwonej plastikowej nakrętki.
Umieść szczelnie zamkniętą rurkę dializatora o pojemności 500 mikrolitrów w pływającym stojaku wewnątrz pojemnika wypełnionego roztworem do dializy. Następnie umieść pojemnik w spokoju w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby uzyskać wzrost kryształów. Aby sprawdzić, czy tworzą się kryształy, należy odpipetować od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu z dializatora na szkiełko podstawowe.
Przykryj roztwór na szkiełku innym szkiełkiem podstawowym i obejrzyj go pod mikroskopem. Obrazy wykonane za pomocą stereoskopowego mikroskopu o dużym powiększeniu wykazały pomyślne tworzenie mikrokryształów czterech białek przy użyciu płytek do mikrodializy z membranami odciętymi o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Stwierdzono, że lizozym tworzy kryształy podczas dializy z 0,1-molowym octanem sodu o pH 4 zawierającym odpowiednie dodatki.
Domatyna tworzyła kryształy podczas dializy z 0,1 molowym bis-trisem propanem o pH 6,6 zawierającym odpowiednie dodatki. Zoptymalizowane warunki dializy doprowadziły do tworzenia mikrokryształów przez białka błonowe, a mianowicie białko wielolekowej pompy wypływowej E.coli AcrB i transporter laktozy LacY. Krystalizacja na dużą skalę w probówkach dializatorów z wykorzystaniem zoptymalizowanych warunków dializy uzyskanych z eksperymentów mikrodializy doprowadziła do powstania tysięcy mikrokryształów dla każdego z białek.
W celu krystalizacji fomityny 250 mikrolitrów białka dializowano z 50 mililitrami roztworu dializacyjnego. W przypadku AcrB 250 mikrolitrów białka dializowano z 25 mikrolitrami roztworu do dializy. Krystalizacja LacY została również ustalona w tym samym stosunku, ze 100 mikrolitrami białka na 10 mililitrów roztworu dializacyjnego.
Podczas odwracania płytki do strony buforowej do góry ważne jest, aby zwrócić uwagę na położenie A1, aby można było odpowiednio dozować roztwory z sita krystalizacyjnego. Kryształy otrzymane tą metodą mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak krystalografia szeregowa i mikrozaburzenia erekcji.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wysokiej wydajności do przesiewania warunków krystalizacji białek za pomocą 96-dołkowej płyty mikrodializowej. Demonstruje wzrost mikrokryształów dla zastosowań w krystalografii szeregowej i MicroED.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Krystalizacja białek
- Biologia strukturalna
- Techniki krystalograficzne
Tło
- Krystalizacja przez dializę jest mniej powszechną metodą w krystalizacji białek.
- To podejście zwiększa zakres dostępnych strategii krystalizacji.
- Jest korzystne ze względu na swoją prostotę i zdolność do dużej wydajności.
- Monitorowanie wzrostu kryształów jest proste w tej metodzie.
Cel badania
- Prezentacja nowego podejścia do krystalizacji białek.
- Ułatwienie dużej skali wzrostu mikrokryształów.
- Optymalizacja warunków dla zastosowań w krystalografii szeregowej i MicroED.
Stosowane metody
- Wykorzystanie 96-dołkowej płyty mikrodializowej do krystalizacji.
- Ładowanie próbek białek i roztworów dializowych do dołków.
- Inkubacja o kontrolowanej temperaturze dla wzrostu kryształów.
- Mikroskopowe badanie powstawania kryształów.
Główne wyniki
- Sukcesywne powstawanie mikrokryształów dla wielu białek.
- Optymalizacja warunków doprowadziła do powstania tysięcy mikrokryształów.
- Określono specyficzne warunki dla lizozymu, domatyny, AcrB i LacY.
- Uzyskane kryształy mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodny sposób przesiewania warunków krystalizacji.
- Umożliwia łatwe skalowanie eksperymentów krystalizacyjnych.
- Podejście jest korzystne dla oznaczania struktury białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput protein crystallization via microdialysis enables rapid screening of crystallization conditions, supporting structural biology and drug discovery pipelines. This workflow increases predictive confidence in structure-based target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical research. The approach is scalable, robust, and compatible with downstream applications such as serial crystallography and MicroED.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid interrogation of protein structure-function relationships for target validation.
- Enables mechanistic de-risking by providing atomic-resolution structural data.
- Supports portfolio triage by identifying tractable targets through structural insights.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein crystals for downstream screening and biophysical assays.
- Standardizes crystallization conditions using SBS-compatible 96-well plates for reproducibility.
- Enables scalable production of microcrystals for high-throughput screening platforms.
- Supports reliable evaluation of protein-ligand interactions in structure-based drug design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant protein targets for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery-stage structural elucidation to preclinical validation studies.
- Reduces risk in advancing candidates by providing robust structural evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This microdialysis-based crystallization method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative structure-guided optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through high-throughput structural analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers high-quality crystals suitable for X-ray and electron diffraction measurements.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable crystallization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust structural insights early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling and low-volume pipetting techniques.
- Needs access to standard crystallization laboratory infrastructure and microscopy for monitoring.
- Demands cross-team standardization for plate setup and data interpretation.
- Adaptable to a wide range of protein classes, including membrane proteins, as demonstrated.
- Limited by protein solubility and stability under dialysis conditions as noted in the protocol.
